使用脂肪酶制备水凝胶的方法
【专利摘要】本发明涉及一种改进的用于制备水凝胶，例如藻酸盐水凝胶的方法。本发明的水凝胶特别用于生物材料，例如细胞材料，如精子的固定和保存。
【专利说明】使用脂肪酶制备水凝胶的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及一种改进的用于制备水凝胶，特别是藻酸盐水凝胶的方法。本发明的 水凝胶具有广泛的应用领域，并且特别用于生物材料的固定化，更具体而言，用于细胞物质 例如精子的固定化和保存。
[0002] 发明背景
[0003] 水凝胶由形成亲水性的含水网络的聚合物链构成，其在多个工业领域，特别是生 物技术和制药业中具有广泛的应用。例如，水凝胶被用于固定生物材料（例如细胞）以用 于移植或作为例如药物活性成分或营养成分的递送系统。水凝胶也可以用作伤口敷料。此 夕卜，水凝胶，特别是藻酸盐水凝胶，被广泛地用作增稠剂。
[0004] 广泛使用的用于形成水凝胶的聚合物为藻酸盐。藻酸盐为天然存在的阴离子 多糖，其由1,4-联-β-D-甘露糖醛酸（M)和α-L-葡萄糖醛酸（G)构成（Smidsr0d and Skj&k-Braek, 1990, Trends in biotechnology,第8卷，第 3 期，第 71-78页）。市售的 藻酸盐提取自海藻，例如褐藻（Ascophyllum nodosum)、巨藻（Macrocystis pyrifera)和北 极海带（Laminaria hyperborea)，部分提取自扎掌状海带（Laminaria digitata)、福建种 海带（Laminaria japonica)、Eclonia maxima、Lesonia negrescens 和马尾藻（Sargassum sp)。
[0005] 藻酸盐还可由一些藻酸盐产生菌制备，例如由一些假单胞菌属（Pseudomonas species)以及由棕色固氮菌制备（Azotobacter vinelandii) ( Smidsr0d and Skjak-Braek, 1990, supra)〇
[0006] 藻酸盐通常尤其用于食品工业，例如作为用于粘度控制的稳定剂，或作为增稠剂。 藻酸盐还可广泛地用于制药业和化妆品业，同样作为稳定剂、增稠剂或分解剂。基于不同 目的，可分别获得富含古罗糖醒酸（guluronic acid)或甘露糖醒酸的藻酸盐（Mancini 等（1999)，Journal of Food Engineering39, 369-378、W08603781、US 4, 990, 601、US 5, 639, 467)。
[0007] 由于在二价阳离子例如钙离子的存在下藻酸盐的生物相容性和凝胶能力，藻酸 盐通常还可用于细胞的胶囊化（Nebel，R.L.，Balme，J.，Saacke，R.G.和 Lim.F. (1985)， J.Anim.Sci. 60:1631-1639 ;Lim，F 和 Sun,A.Μ·，（1980)Science210:908-9100 ;W0 2006/106400 ;EP0922451;US6596310;Torre 等（1998)，S.T.P. Pharma Sciences，8 (4)， 第 233-236 页；Torre 等，（2000)，Biomaterials，21，第 1493-1498 页；Torre 等（2002)， Journal of Controlled Release，85,第 83-89 页；Faustini 等，（2004)，Theriogenology, 61，第 173-184 页；Weber 等（2006)，Journal of Biotechnology，123,第 155-163 页。
[0008] 藻酸盐凝胶还用于固定各种材料。例如，W02008/004890记载用于保存精子的生 物聚合物颗粒，并且其中生物材料被包埋在呈固态的聚合物颗粒中，并贯穿在整个颗粒的 直径中。通过将精子包埋在藻酸盐水凝胶中而不是将精子胶囊化，使得精子保存于胶囊的 流体芯中，细胞被固定在藻酸盐凝胶网络中，因此限制了细胞在存储过程中的运动性。
[0009] 藻酸盐水凝胶，例如用于各种材料的胶囊化或圈闭（entrapment)的藻酸盐凝胶， 可以通过以下方法制备：将待圈闭的材料的溶液与海藻酸钠的溶液混合，然后将该溶液加 入到含有多价阳离子的溶液中，所述多价阳离子通常为二价阳离子例如钙离子（例如CaCl 2 的溶液）（Sn丨idsred and Skjak-Braek, 1990,supra)〇
[0010] US6, 497, 902公开了另一种制备生物相容性水凝胶（例如藻酸盐水凝胶）的方法， 其包含将待包埋的细胞、藻酸盐和钙释放剂彼此混合，之后将钙释放化合物加入到所述混 合物中形成交联凝胶。根据US专利6, 497, 902,所述钙释放剂可以是D-葡萄糖-δ -内酯 ^DL)。
[0011] 在US专利6, 497, 902中公开的方法可用来固定用于人工授精的精子（例如，用于 制备公开于W0 2008/004890的藻酸盐水凝胶）。例如，稀释并冷却（4°C)的精子可被加入 到包含溶解的海藻酸钠和悬浮的碳酸钙以及任选地冷冻保护剂（例如甘油）的溶液中，然 后通过加入包含GDL的溶液引发胶凝并获得所需的藻酸盐水凝胶。GDL的加入导致葡萄糖 酸的形成，葡萄糖酸将与水反应而形成H 30+。H30+的增加，以及碳酸钙的存在导致了 C02和 Ca2+的释放。通过加入GDL而提供的Ca2+导致含有包埋的精子的藻酸盐水凝胶的形成。
[0012] 在凝胶已发生之后，充满包埋在藻酸盐中的精子的容器可冷藏保存在液氮中，由 此提供了具有特别长的保质期的精子的冷藏保存。
[0013] 然而，本发明人已体验到在根据US专利6, 497, 902中公开的方法制备藻酸盐水凝 胶中使用⑶L包括一些缺陷。当根据上述方法制备包含固定的精子的藻酸盐凝胶时，在制 备GDL溶液后立即将其加入溶液以避免自发的胶凝是关键的。GDL必须以溶解的形式加入 而不是粉末的形式，从而避免最初局部区域/层区具有高浓度的葡萄糖酸，这将对精子不 利。此外，在GDL加入之后，胶凝反应开始后将伴随一段粘度升高的时期。由于粘度的增加， 用于形成水凝胶的容器必须相当快地被充满。在将溶解的GDL转化葡萄糖醛酸的累积时间 中，溶液因此被转移到适合的容器（例如，頂V，L' Aigle，France提供的微型吸管）以使所 需的生物材料进一步胶凝和固定化。因此，现有技术中公开的方法确实导致制备包含所需 生物材料的水凝胶的时间安排相当短且不灵活并且从工业的角度来看是主要的缺点。
[0014] 由于上述方法的缺点，需要改进水凝胶的制备方法，特别是适合在工业规模上制 备水凝胶的方法。
[0015] 在现有技术中，已经记载制备水凝胶的各种其他方法。各种报道公开了一种酶的 利用，所述酶在接触特定底物时提供了不同的反应，所述反应最终导致各种类型聚合物的 交叉联（crossbinding)。
[0016] 例如，CN 101439206公开了尤其是在酶催化方法中使用包含酚羟基单元和二氧化 酶的聚合物以制备聚合物凝胶。
[0017] Johnsen 等（2010)在 ACS Applied Materials & Interfaces，2 (7)，第 1963-1972 页中报道了使用葡萄糖氧化酶进行聚合的基于PEG的水凝胶的制备。葡萄糖氧化酶催化 β -D-葡萄糖的氧化，随后使用氧气来产生黄素腺嘌呤二核苷酸酶辅助因子，导致H202的生 成。通过亚铁离子与这些酶催化的H 202产物的结合，产生伯羟基基团物质，其进一步与丙烯 酸酯单体反应。
[0018] 还已报道了 H202和辣根过氧化物酶在水凝胶制备中的用途，参见例如 Kurisawa 等，（2010)，J. of Materials Chemistry，20 (26),第 5371-5375 页；Sakai 等， (2009), Biomaterials, 30 (20),第 3371-3377 页；Sakai and Kawakami (2006)，Acta Biomaterialia，20017, 3,第 495-501 页；Lee 等（2009)，J. of Controlled Release，134,第 186-193 页；Wang 等（2010)，Biomaterials，31，第 1148-1157 页。
[0019] 由于H202是强氧化剂，通过使用氧化酶和H20 2制备的水凝胶并不适合某些应用。
[0020] 因此，仍需要改进且简化的用于制备藻酸盐水凝胶，特别是适合于固定化生物材 料的水凝胶的方法。
[0021] 发明概述
[0022] 本发明的目的是提供一种改进的用于制备藻酸盐水凝胶的方法，其不具有现有技 术的方法的缺点。
[0023] 本发明的另一个目的是提供一种简化的用于制备藻酸盐水凝胶的方法，该藻酸盐 水凝胶适合于固定生物材料。
[0024] 因此，本发明涉及一种藻酸盐水凝胶，其中其胶凝是通过以下方法进行引发：利用 水解酶和可被水解酶水解的底物来形成H 30+、并随后由于二价阳离子释放剂的存在而释放 二价阳离子。
[0025] 根据本发明的一个方面，提供了一种制备藻酸盐水凝胶的方法，所述方法包括将 含有水解酶的溶液与含有可被水解酶水解的底物的溶液混合，其中所述含有水解酶的溶液 或含有可被水解酶水解的底物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。在两种 溶液混合时，底物与水解酶结合导致所述底物的水解并随后形成H 30+。此外，H30+的产生导 致二价阳离子的释放，由此引发了水凝胶的形成。
[0026] 根据一个实施方案，二价阳离子释放化合物和藻酸盐存在于包含水凝胶的溶液 中。根据另一个实施方案，二价阳离子释放化合物和藻酸盐存在于包含所述底物的溶液中。
[0027] 所述水解酶可以是酯酶，例如脂肪酶。根据本发明的一个实施方案，本发明的方法 中使用水解酶为三酰基甘油脂肪酶。
[0028] 根据本发明的又一个实施方案，二价阳离子释放化合物释放选自Ca2+、Ba 2+、和Sr2+ 的二价阳离子。
[0029] 根据本发明的另一个实施方案，二价阳离子释放化合物为钙释放化合物，例如碳 酸钙。
[0030] 根据本发明的又一个实施方案，底物为有机酸的酯。
[0031] 根据本发明的又一个实施方案，提供一种方法，其包含以下步骤：将含有三酰基甘 油脂肪酶的溶液与包含可被所述水解酶水解的底物的溶液进行混合，其中底物为式I的化 合物：
[0032]
【权利要求】
1. 水解酶和可被该水解酶水解的底物在制备藻酸盐水凝胶中的用途。
2. 权利要求1的用途，其中所述酶为酯酶。
3. 权利要求2的用途，其中所述酯酶为脂肪酶。
4. 权利要求3的用途，其中所述脂肪酶为三酰基甘油脂肪酶。
5. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述水解酶的底物的水解导致成0+的产生。
6. 权利要求5的用途，其中所述酶为脂肪酶并且所述底物为式I的化合物：
其中Ri、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰 基链。
7. 权利要求2的用途，其中^、馬和馬选自甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛 酮、壬酮、癸酮、十二烷酮。
8. 权利要求6的用途，其中Rp R2和R3独立地相同或不同并代表Ci-Q-烷基羰基链。
9. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述底物选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和 三丁酸甘油酯，优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
10. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述酶和底物用于制备包埋生物材料、优选精 子的藻酸盐水凝胶。
11. 一种制备藻酸盐水凝胶的方法，包含以下步骤： 将含有水解酶的溶液与含有可被该水解酶水解的底物的溶液混合，并且其中含有所述 水解酶的溶液或含有所述底物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。
12. 权利要求11的方法，其中包含水解酶的溶液含有二价阳离子释放化合物和藻酸 盐。
13. 权利要求11的方法，其中包含底物的溶液含有二价阳离子释放化合物和藻酸盐。
14. 权利要求11的方法，其中所述水解酶为酯酶。
15. 权利要求11的方法，其中所述酯酶为脂肪酶，优选三酰基甘油脂肪酶。
16. 权利要求11-13中任一项的方法，其中所述底物为有机酸的酯。
17. 权利要求11-13中任一项的方法，用于制备藻酸盐水凝胶，包含以下步骤：将含有 三酰基甘油脂肪酶的溶液与包含可被该水解酶水解的底物的溶液混合，其中所述底物为式 I的化合物：
其中Ri、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰 基链，并且其中包含所述脂肪酶的溶液或包含式I化合物的溶液另外地包含藻酸盐和二价 阳离子释放化合物。
18. 权利要求14的方法，其中^、馬和馬选自甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、 辛酮、壬酮、癸酮、十二烷酮。
19. 权利要求14的方法，其中RpRjP R3独立地相同或不同并代表烷基羰基链。
20. 权利要求14-16中任一项的方法，其中所述底物选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯 和三丁酸甘油酯，优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
21. 权利要求11-17中任一项的方法，其中所述二价阳离子释放化合物释放选自Ca2+、 Ba2+、和Sr2+的二价阳离子。
22. 权利要求18的方法，其中所述二价阳离子释放化合物为钙释放化合物。
23. 权利要求19的方法，其中所述阳离子释放化合物为碳酸钙。
24. 权利要求11-21中任一项的方法，其中第一溶液还包含待包埋在藻酸盐水凝胶中 的目标物。
25. 权利要求22的方法，其中待包埋在藻酸盐凝胶中的目标物为生物材料。
26. 权利要求23的方法，其中所述生物材料为精子。
27. 权利要求20的方法，其中所述方法包含以下步骤： i) 通过用包含三酰基甘油脂肪酶的溶液稀释精子而形成第一溶液； ii) 将包含藻酸盐、二价阳离子释放化合物和式I化合物的第二溶液加入到在步骤i) 中获得的第一溶液中，引发胶凝：
其中Ri、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰 基链； iii) 将步骤ii)中获得的溶液转移到用于藻酸盐水凝胶胶凝的容器中； iv) 任选地将iii)的藻酸盐水凝胶冷藏保存。
28. 权利要求20的方法，其中所述方法包含以下步骤： i) 通过用包含式I化合物的溶液稀释精子而形成第一溶液：
其中Ri、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰 基链； ii) 将包含藻酸盐、二价阳离子释放化合物和三酰基甘油脂肪酶的第二溶液加入到步 骤i)中获得的溶液中，引发胶凝； iii) 将ii)中获得的溶液转移到用于藻酸盐水凝胶胶凝的容器中； iv) 任选地将iii)的藻酸盐水凝胶冷藏保存。
29. 权利要求25和26中任一项的方法，其中所述底物选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油 酯和三丁酸甘油酯，优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
30. 权利要求14和15中任一项的方法，其中对iii)中获得的溶液冷藏保存，并且其中 i)和ii)的第一溶液和第二溶液分别包含冷冻保护剂。
31. 权利要求14-16的方法，其中所述藻酸盐为富含古罗糖醛酸的藻酸盐。
32. 根据权利要求1-18中任一项制备的藻酸盐水凝胶。
33. -种藻酸盐水凝胶，其包含： a) 藻酸盐； b) 任选地待包埋在所述藻酸盐水凝胶中的目标物； c) 所述藻酸盐水凝胶制备中所使用的水解酶。
34. -种藻酸盐水凝胶试剂盒，其包含一个含有水解酶的容器和另一个含有可被该水 解酶水解的底物的容器。
35. 权利要求27的试剂盒，其中所述可被水解酶水解的底物为式I的化合物：
其中Ri、R2和R3独立地相同或不同并代表烷基羰基链。
36. 权利要求23的试剂盒，其中所述试剂盒另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合 物。
37. 权利要求28的试剂盒，其包含一个容器，其包括含有水解酶的溶液；以及另一个容 器，其包括含有藻酸盐、二价阳离子释放化合物和可被该水解酶水解的底物的溶液。
38. 权利要求28的试剂盒，其包含一个容器，其包括含有可被水解酶水解的底物的溶 液；以及另一个容器，其包括含有藻酸盐、二价阳离子释放化合物和水解酶的溶液。
【文档编号】A01N1/02GK104126015SQ201280067668
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2012年11月23日 优先权日:2011年11月24日
【发明者】G·科林肯博格, K·多马斯约瑟芬, E·科米斯拉德 申请人:斯博姆维透公司