黑曲霉菌c2及其菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种黑曲霉菌(Aspergillus?niger)C2，保藏号CGMCC?NO.7511，保藏日期：2013年7月5日。所述黑曲霉菌C2分离自我国河北省衡水市农田土壤，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明还公开了一种含有黑曲霉菌C2的微生物菌剂。本发明所述微生物菌剂对于植物的促生效果明显，且其作用效果不受化肥使用的抑制，可以在正常使用化肥条件下使用，对我国农业生产节约磷肥资源、粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
【专利说明】黑曲霉菌C2及其菌剂
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一种高效溶磷黑曲霉菌C2及其微生物菌剂。
【背景技术】
[0002]我国90%以上的耕地缺磷，使用磷肥是解决作物增产的主要措施，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。我国是世界化肥消费第一大国，也是磷肥第一消费大国，每年磷肥消费量1100万吨左右。众所周知，我国磷矿资源缺乏，保有储量151.98亿吨，再过20年中高品位磷矿开采殆尽(李志宁，2003a，李志宁，2003b)，不得不依靠购买国外高价磷矿石保障粮食生产。一些研究显示，我国磷肥当季利用率仅为3.22?18% (周晓芬，马民强，1994;张李康，1997;崔正忠等，2001;周广业等，1991;李云等，2002)。磷肥施入土壤后·80?90%很快被土壤固定(范丙全等，1998，2004a),石灰性土壤中有效磷转变成溶解度极低的磷灰石(Ischmidt & Nixon, 1944;Murrmann & Peech, 1968),而在酸性土壤中形成磷酸铁和磷酸铝(Ford，1933)。我国自20世纪70年代使用磷肥以来，土壤磷积累显著(林葆，2009)。土壤磷绝大部分以难溶无机磷形态存在，释放缓慢，作物有效性低。随着辚肥用量增加，磷肥转化为极难利用的闭蓄态磷(来路等，2003)与高稳定性有机磷(黄庆海等，2003)。解决土壤磷的活化与释放是提高土壤磷和磷肥利用效率的关键。因此，增强土壤磷有效性，提高磷肥增产效益，是我国农业可持续发展的必然之路。
[0003]溶磷微生物是一类具有活化土壤难溶无机磷能力的有益微生物。应用溶磷微生物活化土壤难溶磷是世界公认的安全、经济和有效的生物措施(Kucey, 1988;Kamble&Mohite, 1996 ；Morales 等，2007 ;El_Gawad 等，2009)，倍受各国科学家和政府高度重视。开展高效溶磷微生物研究与利用，对于挖掘土壤磷资源的利用潜力、提高磷肥利用率、节约磷肥、发挥我国有限磷矿资源的增产作用和农业持续发展意义重大。
[0004]溶憐真菌(Salih等,1989;王延秋等，1993; Vassileva, 1998; Asea 等,1988 ；Abd-Alla & Omar, 2001;程淑琴等，2003;Wakelin 等，2007;Morales 等，2007)和溶憐细菌(Rasal,等，2004;Raychaudhuri,等，2003;Orhan,等，2006;)都具有显著增加土壤有效磷、提高作物产量能力，以及节约磷肥的效果(El-Lateef，1998; Suri,等，2006)。同时，溶磷微生物提高磷肥利用率(Tomar等，1994; Tomar等，1996; Kamble&Mohite, 1996;范丙全等，2004a)，具有改善作物品质的能力(Hamed，2003;El-Gawad, 2009)，溶磷微生物对于提高土壤难溶磷和磷肥的生物有效性具有巨大应用潜力。
[0005]以往研究涉及面非常广，为溶磷微生物应用提供了技术支撑。然而，长期以来没有重视溶磷微生物在大范围、大区域与多种土壤、多种作物的广泛适应性进行研究，使得大量溶磷菌种很大程度上无法找到更适合的应用土壤与作物，难以发挥溶解土壤磷和增强磷肥有效性的最大潜力。严重限制了溶磷菌的使用范围和应用潜力发挥。对整体溶磷微生物资源而言，可能造成了巨大浪费，由此导致各国溶磷微生物菌剂研究和生产进入更大误区。一些国家仍然以单株溶磷菌株生产溶磷微生物菌剂，而在全国范围所有土壤和各种上使用。世界上大型溶磷微生物菌剂公司，如加拿大Philom Bios公司使用单株溶磷拜莱青霉菌(Penicillium bilaii) (Kucey, 1988, 1989)生产微生物菌剂 JumpStart。印度Ruchi Biochemicals公司使用并生产一种溶磷微生物,推荐在全国使用。比利时生产一株溶磷细菌生产菌剂Phosphorene (Ahmed等，1999)。我国主要以巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatarium)生产溶磷微生物菌剂(葛诚，吴薇，1995;范丙全，2007)。其他国家情形大致相似。没有考虑溶磷微生物与地域、土壤类型、作物种类的最佳适配性，溶磷微生物菌剂的使用效果受到严重影响。
[0006]广适应性(土壤、作物)的溶磷微生物菌种资源为世界范围内稀缺，且未见有关广适应性的溶磷微生物菌剂的报道。
【发明内容】
[0007]本发明主要针对我国缺磷和磷肥利用率低、增产潜力下降的问题，提供一种广泛适应性的高效溶磷菌及其制备的微生物菌剂。
[0008]本发明提供了一种黑曲霉菌(Aspergillus niger)C2,保藏号CGMCC N0.7511,保藏日期:2013年7月5日。所述黑曲霉菌C2分离自我国河北省衡水市农田土壤，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0009]本发明还提供一种含有黑曲霉菌C2的微生物菌剂。
[0010]本发明所述微生物菌剂在提高作物产量中的应用。
[0011]本发明所提供的溶磷黑曲霉菌C2，其具有如下微生物学特性:
[0012]C2菌落在无机磷(磷酸三钙为`林园)培养基上，生长较快，25 °C 5d直径达2.0-2.5cm，平坦，中央稍凸起，质地丝绒状；分生孢子结构大量，黄黑色至黑色，呈现放射状分布，背面无色或略带浅灰色。；
[0013]PDA培养基上蔓延迅速，25°C 7d直径8.0-8.5cm，初为白色，后变成黑色厚绒状，背面略带灰黄色，分生孢子头黑色呈放射状，分生孢子梗长短不一；
[0014]菌落在察氏琼脂上生长迅速，25°C 7d直径9.00cm，平坦，中央稍凸起，质地丝绒状；分生孢子结构大量，黄黑色至黑色；分生孢子梗发生于基质，顶囊球形，全面可育；产孢结构双层；分生孢子球形，直径4?6 μ m，壁具明显尖疣或光滑。
[0015]本发明的有益效果:
[0016]本发明所述微生物菌剂对于植物的促生效果明显，且其作用效果不受化肥使用的抑制，可以在正常使用化肥条件下使用，对我国农业生产节约磷肥资源、粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
[0017]本发明针对我国土壤磷有效性低、难溶磷积累，磷肥利用率持续下降的现状，并且针对我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源、微生物菌剂产业仍然使用适应范围窄、溶磷能力低的老菌种的现状，筛选和培育广泛适用我国各类主要土壤、多种作物的新的溶磷微生物菌株，为开发高效溶磷微生物菌剂的提供技术支撑。
[0018]本发明以我国主要土壤为研究对象，进行了广谱高效溶磷微生物菌种的筛选，获得了大量溶磷菌株，经过研究比较这些溶磷菌株与我国主要土壤、主要作物的适应性、溶磷能力、增产效果，获得了一株广泛适用于我国主要土壤类型、主要作物的高效溶磷的黑曲霉菌C2，特别适合我国南方、北方、西北、东北、西南等区域的典型土壤，为溶磷微生物在土壤磷转化、磷肥高效利用和节约磷肥资源等方面提供了菌种资源和技术支撑。
【具体实施方式】
[0019]实施例1黑曲霉菌C2的分离及培养
[0020](I)黑曲霉菌C2培养基
[0021]发酵液配方(kg/t发酵液):磷酸氢二钾0.1，磷酸二氢钾0.1，氯化钠4.3，硫酸镁
0.1，淀粉8.6，牛肉膏4.3，蛋白胨4.3，酵母粉4.3，蔗糖8.6，硫酸铵2.6，碳酸钙10，硫酸亚铁0.001，豆油6.8，以水配制。
[0022]( 2 )黑曲霉菌C2培养过程
[0023]将黑曲霉菌C2菌株接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，28?30°C培养48h，然后接入IOOOmL三角瓶，在30°C，220r/min下，培养36h ;按5%接种量接入到50L种子罐中，在220r/min, pH7.5，通气量0.5vvm条件下，培养2d后，再按10v/v%接种量转到500L的发酵罐中，在200r/min，pH7.5，通气量0.7?1.0vvm条件下，培养3d ;发酵完成后，以1:: 3?6倍的高岭土吸附，即得溶磷黑曲霉菌C2菌剂。
[0024]实施例2高效溶磷微生物菌剂的制备
[0025]1.黑曲霉菌C2的培养
[0026](I)培养基的组成(kg/t发酵液)
[0027]可溶性淀粉IOkg,黄豆饼粉IOkg,玉米粉5kg,葡萄糖Ikg,鹿糖IOkg,酵母粉5kg,(NH4) 2S043kg, K2HPO40.2kg, NaC12.5kg, MgSO4.7H200.lkg, CaCO30.5kg, FeSO40.001kg，硼酸(1%) 1L，pH7.0，以水配制。
[0028](2)发酵培养过程
[0029]将黑曲霉菌C2接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，25?28°C培养3d。将黑曲霉菌C2孢子转接入IOOOmL三角瓶，26-28°C，220r/min下液体发酵培养36h。然后按1%接种量接入50L种子罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v%接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7?1.0vvm下，培养3d。加入保护剂海藻酸钠，以1:3?6倍的二氧化硅吸附。
[0030]2.高效溶磷微生物菌剂的制备
[0031]分别对溶磷黑曲霉菌C2进行发酵，发酵后加入保护剂海藻酸钠。黑曲霉菌C2以二氧化硅吸附，活菌数为5 X IO8-1 X 109cfu/g。
[0032]3.高效溶磷微生物菌剂造粒
[0033]向以上吸附、混合好的菌体中加入适量稻壳粉、秸杆粉和膨润土粘结造粒，根据生产需要形成不同的颗粒粒径菌剂，用于与玉米、小麦、大豆、棉花种子的机械播种，或者与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥等颗粒肥料一起机械施入土壤。
[0034]实验例3黑曲霉菌C2溶解难溶磷的效果
[0035]1.采用溶磷黑曲霉菌C2，以巨大芽孢杆菌(ATCC14581)、拜莱青霉菌(ATCC20851)为对照。在室内条件下，以磷酸三钙为难溶磷，进行了平板固体培养基培养5天，测定了其溶磷能力。
[0036]黑曲霉菌C2的溶磷圈与菌落直径比值达到了 3.10，溶磷圈内溶解的水溶性溶(P2O5)为15.98mg ;菌株ATCC20851和ATCC14581的溶磷圈与与菌落直径比值分别为1.06和1.30，溶磷圈内的溶磷量(P2O5)分别为6.31和2.llmg，都低于菌株黑曲霉菌C2 (表I)。
[0037]表I溶磷菌株在含Ca3(PO4)2培养基上的溶磷圈与菌落的直径比值(d/D)
[0038]
【权利要求】
1.一种黑曲霉菌(Aspergillus niger)C2，保藏号 CGMCC N0.7511，保藏日期:2013 年7月5日。
2.根据权利要求1所述的黑曲霉菌，其特征在于:其具有如下微生物学特性: C2菌落在无机磷培养基上生长较快，25°C 5d直径达2.0-2.5cm，平坦，中央稍凸起，质地丝绒状；分生孢子结构大量，黄黑色至黑色，呈现放射状分布，背面无色或略带浅灰色；PDA培养基上蔓延迅速，250C 7d直径8.0-8.5cm,初为白色，后变成黑色厚绒状，背面略带灰黄色，分生孢子头黑色呈放射状，分生孢子梗长短不一； 菌落在察氏琼脂上生长迅速，25°C 7d直径9.00cm，平坦，中央稍凸起，质地丝绒状；分生孢子结构大量，黄黑色至黑色；分生孢子梗发生于基质，顶囊球形，全面可育；产孢结构双层；分生孢子球形，直径4?6 μ m，壁具明显尖疣或光滑。
3.含有权利要求1或2所述黑曲霉菌C2的微生物菌剂。
4.权利要求3所述的微生`物菌剂在提高作物产量中的应用。
【文档编号】C05G3/00GK103436453SQ201310395339
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】范丙全, 武庆 申请人:保罗生物园科技股份有限公司