一种禽用复合￡fL生国制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种禽用复合益生菌制剂及其制备方法，将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比20-40:5-20:10-30:12-35:15-30混合，然后加入羧甲基纤维素制成混悬液，再将混悬液加入硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗后干燥即得；上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml。本发明通过将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌等好氧菌和厌氧菌合理搭配，得到具有多种生理功能的复合益生菌制剂。本发明的禽用复合益生菌制剂能够调节肠道的微生态环境，抑制肠道病原菌的生长，增强机体免疫力，提高饲料利用率。
【专利说明】一种禽用复合益生菌制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种禽用复合益生菌制剂，同时还涉及该制剂的制备方法，属于微生 物制剂【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 随着集约化养殖业的发展，禽类的各种疾病不断发生，而且日益严重。目前防治禽 类疾病的主要手段是使用抗生素，但抗生素的使用容易导致细菌耐药的产生及禽类产品中 药物的残留。因此，预防禽类的疾病发生，解决其副产品中药物的残留是亟待解决的问题。
[0003] 益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，可以改善宿主体内的微生态平衡，发挥 有益作用。益生菌的作用特点是形成生物保护膜防止致病菌入侵；产生乳酸或醋酸、过氧 化氢、细菌素和类似抗菌素的物质,并以此来抑制病原菌的生长,调整宿主免疫反应,改善 消化道细菌代谢病降低粪中有害酶的活性；减少细菌易位的发生率等，因此益生菌具有加 强肠道微生物区域的屏障功能或增进非特异性免疫功能，调节特异性免疫功能，增强抗病 力和体质，防治病菌感染，提高饲料利用率和动物生长率的功能。因此对不同益生菌进行搭 配，提高它们的作用成为研究热点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种禽用复合益生菌制剂，能够调节肠道的微生态环境，抑 制肠道病原菌的生长，增强机体免疫力，提高饲料利用率。
[0005] 本发明的目的还在于提供一种禽用复合益生菌制剂的制备方法。
[0006] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种禽用复合益生菌制剂， 将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液 按体积比20-40:5-20:10-30:12-35:15-30混合，然后加入羧甲基纤维素制成混悬液，再将 混悬液加入硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗后干燥即得；上述菌种菌液 中的活菌数均不低于l〇 9CFU/ml。
[0007] 所述禽用复合益生菌制剂中活菌总数不低于5X 109CFU/g。
[0008] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种禽用复合益生菌制剂的制备方法，包括 以下步骤：将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸 梭菌菌液按体积比混合，然后加入混合菌液质量〇. 5-1%的羧甲基纤维素制成混悬液，再将 混悬液加入混悬液体积1-2倍的质量分数3-5%的硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝 聚囊，水洗，干燥得到禽用复合益生菌制剂；上述菌种菌液中的活菌数均不低于l〇 9CFU/ml。
[0009] 所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备方法包括以下步骤：
[0010] (1)菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤 培养基中，在37°C、180-200r/min条件下培养12-14h ;
[0011] (2)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液 体培养基，在37°C条件下通氧发酵培养36-48h，过滤然后将发酵液3000-4000r/m离心 5-10min，倒去上清液，加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液，所得 菌液中活菌数均不低于l〇9CFU/ml。
[0012] 所述液体培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖0. 1%、淀粉0. 2%、豆柏水解液 2%、磷酸二氢钾0. 3%、磷酸氢二钾0. 2%，硫酸镁0. 05%、氯化铁0. 01%、碳酸钙0. 01%。
[0013] 所述粪肠球菌菌液的制备方法包括以下步骤：
[0014] (1)菌种的活化：将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培养 12-14h ；
[0015] (2)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基，在37°C条件下静置发酵培养 24-36h，然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min，倒去上清液，加入无菌水制得粪肠球菌 菌液，所得菌液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml。
[0016] 所述MRS培养基包括以下质量分数的组分：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0. 5%、葡萄糖 1%、蔗糖0. 5%、醋酸钠1. 5%、柠檬酸铵0. 2%、磷酸二氢钾0. 4%、硫酸锰0. 05%、硫酸镁0. 02%、 硫酸铁0. 003%、吐温800. 1%。
[0017] 所述嗜酸乳杆菌菌液的制备方法包括以下步骤：
[0018] (1)菌种的活化：将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培 养 12-14h ;
[0019] (2)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基，在37°C条件下静置发酵培 养24-36h，然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min，倒去上清液，加入无菌水制得嗜酸乳 杆菌菌液，所得菌液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml。
[0020] 所述发酵培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖3%、乳糖1%、脱脂乳粉5%、酵母 浸粉0. 8%、磷酸二氢钾0. 3%、磷酸氢二钠0. 4%、硫酸镁0. 02%、硫酸锰0. 008%。
[0021] 所述营养肉汤培养基包括以下质量分数的组分：蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%、氯化钠 0· 5%。
[0022] 本发明通过将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌等 好氧菌和厌氧菌合理搭配，得到具有多种生理功能的复合益生菌制剂。本发明的禽用复合 益生菌制剂能够调节肠道的微生态环境，抑制肠道病原菌的生长，增强机体免疫力，提高饲 料利用率。
[0023] 本发明的禽用复合益生菌制剂可在常温下保存一年。使用时，将禽用复合益生菌 制剂以1%的重量分数添加到饲料或者饮水中即可。
【具体实施方式】
[0024] 培养基的配制
[0025] 营养肉汤培养基包括以下质量分数的组分：蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%、氯化钠0. 5% ; ρΗ7-7· 2。
[0026] 液体培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖0. 1%、淀粉0. 2%、豆柏水解液2%、磷 酸二氢钾0. 3%、磷酸氢二钾0. 2%，硫酸镁0. 05%、氯化铁0. 01%、碳酸钙0. 01% ;ρΗ7-7. 2。
[0027] MRS培养基包括以下质量分数的组分：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0. 5%、葡萄糖1%、蔗 糖0. 5%、醋酸钠1. 5%、柠檬酸铵0. 2%、磷酸二氢钾0. 4%、硫酸锰0. 05%、硫酸镁0. 02%、硫酸 铁 0· 003%、吐温 800. 1% ;ρΗ6· 5-7。
[0028] 发酵培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖3%、乳糖1%、脱脂乳粉5%、酵母浸粉 0. 8%、磷酸二氢钾0. 3%、磷酸氢二钠0. 4%、硫酸镁0. 02%、硫酸锰0. 008% ;pH5. 7-6。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例的禽用复合益生菌制剂，将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠 球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比20:10:20:12:30混合，然后加入羧甲 基纤维素制成混悬液，再将混悬液加入硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗 后干燥即得；上述菌种菌液中的活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;禽用复合益生菌制剂中活菌总 数不低于5X109CFU/g。
[0031] 本实施例的禽用复合益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0032] 1、菌液的制备
[0033] (1)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备
[0034] (a)菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤 培养基中，在37°C、200r/min条件下培养12h ;
[0035] (b)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体 培养基，在37°C条件下通氧发酵培养36h，过滤后然后将发酵液4000r/m离心5min，倒去上 清液，加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液，所得菌液中活菌数均 不低于 l〇9CFU/ml ;
[0036] (2)粪肠球菌菌液的制备
[0037] (a)菌种的活化：将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培养 12h ；
[0038] (b)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基，在37°C条件下静置发酵培养 24h，然后将发酵液4000r/m离心5min，倒去上清液，加入无菌水制得粪肠球菌菌液，所得菌 液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;
[0039] (3)嗜酸乳杆菌菌液的制备
[0040] (a)菌种的活化：将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培 养 12h ;
[0041] (b)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基，在37°C条件下静置发酵培 养24h，然后将发酵液4000r/m离心5min，倒去上清液，加入无菌水制得嗜酸乳杆菌菌液，所 得菌液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;
[0042] 2、将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌按比例混合， 然后加入混合菌液质量1%的羧甲基纤维素制成混悬液，再将混悬液加入混悬液体积1倍的 质量分数5%的硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗，42°C干燥得到禽用复合 益生菌制剂。
[0043] 实施例2
[0044] 本实施例的禽用复合益生菌制剂，将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠 球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比30:20:10:20:15混合，然后加入羧甲 基纤维素制成混悬液，再将混悬液加入硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗 后干燥即得；上述菌种菌液中的活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;禽用复合益生菌制剂中活菌总 数不低于5X109CFU/g。
[0045] 本实施例的禽用复合益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0046] 1、菌液的制备
[0047] (1)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备
[0048] (a)菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤 培养基中，在37°C、180r/min条件下培养14h ;
[0049] (b)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体 培养基，在37°C条件下通氧发酵培养48h，过滤后然后将发酵液3000r/m离心lOmin，倒去上 清液，加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液，所得菌液中活菌数均 不低于 l〇9CFU/ml ;
[0050] (2)粪肠球菌菌液的制备
[0051] (a)菌种的活化：将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培养 14h ；
[0052] (b)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基，在37°C条件下静置发酵培养 36h，然后将发酵液3000r/m离心lOmin，倒去上清液，加入无菌水制得粪肠球菌菌液，所得 菌液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;
[0053] (3)嗜酸乳杆菌菌液的制备
[0054] (a)菌种的活化：将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培 养 14h ;
[0055] (b)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基，在37°C条件下静置发酵培 养36h，然后将发酵液3000r/m离心lOmin，倒去上清液，加入无菌水制得嗜酸乳杆菌菌液， 所得菌液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;
[0056] 2、将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌按比例混合， 然后加入混合菌液质量〇. 5%的羧甲基纤维素制成混悬液，再将混悬液加入混悬液体积1. 5 倍的质量分数4%的硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗，60°C干燥得到禽用 复合益生菌制剂。
[0057] 实施例3
[0058] 本实施例的禽用复合益生菌制剂，将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠 球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比40:5:30:35:25混合，然后加入羧甲基 纤维素制成混悬液，再将混悬液加入硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗后 干燥即得；上述菌种菌液中的活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;禽用复合益生菌制剂中活菌总数 不低于 5X109CFU/g。
[0059] 本实施例的禽用复合益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0060] 1、菌液的制备
[0061] (1)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备
[0062] (a)菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤 培养基中，在37°C、190r/min条件下培养13h ;
[0063] (b)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体 培养基，在37°C条件下通氧发酵培养42h，过滤后然后将发酵液3500r/m离心8min，倒去上 清液，加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液，所得菌液中活菌数均 不低于 l〇9CFU/ml ;
[0064] (2)粪肠球菌菌液的制备
[0065] (a)菌种的活化：将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培养 13h ；
[0066] (b)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基，在37°C条件下静置发酵培养 30h，然后将发酵液3500r/m离心8min，倒去上清液，加入无菌水制得粪肠球菌菌液，所得菌 液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;
[0067] (3)嗜酸乳杆菌菌液的制备
[0068] (a)菌种的活化：将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培 养 13h ;
[0069] (b)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基，在37°C条件下静置发酵培 养30h，然后将发酵液3500r/m离心8min，倒去上清液，加入无菌水制得嗜酸乳杆菌菌液，所 得菌液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;
[0070] 2、将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌按比例混合， 然后加入混合菌液质量〇. 8%的羧甲基纤维素制成混悬液，再将混悬液加入混悬液体积2倍 的质量分数3%的硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗，50°C干燥得到禽用复 合益生菌制剂。
[0071] 对比例
[0072] 本对比例的禽用复合益生菌制剂，将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪 肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液按体积比40:5:30:35混合，然后加入羧甲基纤维素制成混 悬液，再将混悬液加入硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗后干燥即得； 上述菌种菌液中的活菌数均不低于l〇 9CFU/ml ;禽用复合益生菌制剂中活菌总数不低于 5X109CFU/g。
[0073] 实验例1
[0074] 本发明禽用复合益生菌制剂的保存期试验
[0075] 将本发明的禽用复合益生菌制剂在25°C条件下放置12个月，并在0、1、2、4、8、12 个月时分别观察外观并测定活菌数，结果如表1所示。
[0076] 表1本发明禽用复合益生菌制剂的保存期试验
[0077]
【权利要求】
1. 一种禽用复合益生菌制剂，其特征在于，将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、 粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比20-40:5-20:10-30:12-35:15-30 混合，然后加入羧甲基纤维素制成混悬液，再将混悬液加入硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过 滤得到凝聚囊，水洗后干燥即得；上述菌种菌液中的活菌数均不低于l〇 9CFU/ml。
2. 根据权利要求1所述的禽用复合益生菌制剂，其特征在于，所述禽用复合益生菌制 齐U中活菌总数不低于5X 109CFU/g。
3. -种如权利要求1所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤：将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌 菌液按体积比混合，然后加入混合菌液质量〇. 5-1%的羧甲基纤维素制成混悬液，再将混悬 液加入混悬液体积1-2倍的质量分数3-5%的硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊， 水洗，干燥得到禽用复合益生菌制剂；上述菌种菌液中的活菌数均不低于l〇 9CFU/ml。
4. 根据权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽 孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备方法包括以下步骤 ： (1) 菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤培养 基中，在 37°C、180-200r/min 条件下培养 12-14h ; (2) 以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体培养 基，在37°C条件下通氧发酵培养36-48h，过滤然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min，倒 去上清液，加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液，所得菌液中活菌 数均不低于l〇 9CFU/ml。
5. 根据权利要求4所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述液体培 养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖0. 1%、淀粉0. 2%、豆柏水解液2%、磷酸二氢钾0. 3%、 磷酸氢二钾〇. 2%，硫酸镁0. 05%、氯化铁0. 01%、碳酸钙0. 01%。
6. 根据权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述粪肠球 菌菌液的制备方法包括以下步骤： (1) 菌种的活化：将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中，在37 °C条件下静止培养 12-14h ； (2) 以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基，在37°C条件下静置发酵培养 24-36h，然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min，倒去上清液，加入无菌水制得粪肠球菌 菌液，所得菌液中活菌数均不低于l〇 9CFU/ml。
7. 根据权利要求6所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述MRS培 养基包括以下质量分数的组分：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0. 5%、葡萄糖1%、蔗糖0. 5%、醋酸钠 1. 5%、柠檬酸铵0. 2%、磷酸二氢钾0. 4%、硫酸锰0. 05%、硫酸镁0. 02%、硫酸铁0. 003%、吐温 800. 1%。
8. 根据权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述嗜酸乳 杆菌菌液的制备方法包括以下步骤： (1) 菌种的活化：将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中，在37°C条件下静止培养 12-14h ； (2) 以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基，在37°C条件下静置发酵培养 24-36h，然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min，倒去上清液，加入无菌水制得嗜酸乳杆 菌菌液，所得菌液中活菌数均不低于l〇9CFU/ml。
9. 根据权利要求8所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培 养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖3%、乳糖1%、脱脂乳粉5%、酵母浸粉0. 8%、磷酸二氢 钾0. 3%、磷酸氢二钠0. 4%、硫酸镁0. 02%、硫酸锰0. 008%。
10. 根据权利要求4、6或8所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述 营养肉汤培养基包括以下质量分数的组分：蛋白胨1%、牛肉膏〇. 3%、氯化钠0. 5%。
【文档编号】A23K1/18GK104212735SQ201310405591
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】朱丽平, 陈建晖, 李凤娟 申请人:郑州后羿制药有限公司