植物绿色组织特异性表达启动子pGreen及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物绿色组织特异性表达启动子pGreen，其为SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。该植物绿色组织特异性表达启动子pGreen包含烟草花椰菜病毒35S启动子的增强子序列和玉米的10kDa光系统蛋白II（photosystem?II10kDa）基因（GenBank?ID：EU961665）的部分启动子序列。本发明还公开了上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在制备具有抗虫能力的转基因植物的应用。本发明还公开了上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在提高植物抗虫活性中的应用。
【专利说明】植物绿色组织特异性表达启动子pGreen及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种在植物绿色组织中驱动基因表达的启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]随着世界人口的不断增加，人们对农产品的需求也日益增大，作为生命能源供应的粮食尤为重要，如水稻和玉米等。然而在农业生产中，人类赖以生存的粮食和经济作物极易受到虫害的侵袭而减产或使得农产品品质下降甚至产生对人体有毒、有害的物质，造成较大损失。在现代农业中，使用化学杀虫剂是减少虫草害的重要方法。但是，化学杀虫剂的长期、大量使用不仅令生产成本增高，还给生态环境和人畜安全带来一系列危害。
[0003]当今，人们对食物安全性和环保性日益重视，减少甚至杜绝化学农药的使用是农业生产的新要求。培育转基因抗虫作物成为一种有效的途径。这种新的技术从1996年开始在世界范围内大规模地应用。目前，世界上应用最为广泛的抗虫基因是Bt (Bacillusthuringiensis)杀虫基因[1’2]。2010年全球转基因作物种植面积达到1.48亿111]12，占全球耕地总面积的10%，其中39%是转入Bt杀虫基因M。转基因抗虫作物的种植可以大幅度减少杀虫剂的使用量，这不仅大大降低了农民的种植成本，而且对保护人类健康和生态环境都有积极的意义。
[0004]随着对转Bt基因作物的进一步的研究和广泛的应用，问题也日益凸显，主要体现在两方面，一是害虫对转基因作物产生抗性；二是转基因作物食用安全性问题，尤其是水稻，它作为全球一半以上人口的口粮，公众对转基因水稻的食用安全性更是存在着顾虑和质疑。目前用于转基因抗虫的Bt杀虫蛋白中Cry(Crystal Protein, Cry)蛋白是目前研究最深入、应用最广 泛的Bt杀虫毒素，但目前已发现多种害虫对其产生了抗性[4_7];而VIP(Vegetative Insecticidal Protein,VIP)杀虫蛋白是一种与ICPs完全不同的新型杀虫蛋白，对于扩大杀虫谱、延缓害虫抗性都具有深远意义[8’9]。这些基因资源都已成为构建抗虫农作物新品种的重要武器。但是这些基因在转基因植株中多利用组成型的启动子驱动其表达，这种表达方式由于违背了植物的自然生理活动规律，不仅可能达不到转基因的目的，甚至对转基因植物自身的生理活动造成了极大伤害[1°_12]。
[0005]针对以上问题，人们做了诸多研究以延缓昆虫抗性、提高杀虫活性并最大限度地降低转基因作物的安全隐患问题，例如堆叠多种杀虫基因，或使用组织特异性启动子。启动子(PiOmoter)是一段位于结构基因5’端上游调控基因表达的DNA序列，有组成型表达、诱导型表达和组织特异型表达3种类型。组织特异型表达的启动子现在被认为是对目的基因实现高量表达的重要途径，也是培育高效、安全的转基因作物的首选[13]。
[0006]绿色组织特异启动子是高等植物组织特异性启动子中的一种，驱动外源基因在茎叶等绿色组织中特异表达，它既可以用于以茎叶为主要收获产物的作物，使蛋白质产物富集于茎叶中，减少宿主植物无谓的物质能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以种子、果实为主要收获产物的作物，让抗虫、抗除草剂等外源基因只在茎叶部分而不在种子果实等器官中表达，解除人们对转基因作物食品安全性的顾虑[14]。同时，植物来源的启动子不会造成基因的逃逸。鉴于此，绿色组织特异性启动子在植物基因工程研究中具有广泛的应用前景。
[0007]上文中涉及的参考文献具体如下:
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【发明内容】
[0022]本发明要解决的技术问题是提供一种植物绿色组织特异性表达启动子pGreen及其应用植物绿色组织特异性表达启动子PGreen及其应用。
[0023]为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物绿色组织特异性表达启动子pGreen,为SEQ ID NO:1 (即，序列表NOl)所示的核苷酸序列。
[0024]当然，该启动子pGreen也可以为满足以下任意一个条件的启动子:
[0025]在严格条件下能与SEQ ID NO:1所示序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0026]与SEQ ID NO:1所示序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
[0027]作为本发明的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen的改进:植物绿色组织特异性表达启动子pGreen包含烟草花椰菜病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S启动子的增强子序列(NCBI Reference Sequence:NC_001497.1)和玉米的IOkDa光系统蛋白II (photosystem III OkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分启动子序列(具体为 TIGRmaize database (http://maize, jcv1.0rg/)中的 AZM5_84822genome序列中 EU961665基因上游-471bp~_41bp的序列)。
[0028]备注说明:上述增强子序列和启动子序列在SEQ ID NO:1中为带有不同下划线的序列。
[0029]作为本发明的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen的进一步改进:玉米的IOkDa 光系统蛋白 II (photosystem IIIOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分启动子序列为以下任一:[0030] I) SEQ ID NO:2 (即，序列表N02)所示的核苷酸序列；
[0031]2)SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；
[0032]3)由SEQ ID NO:2产生的具有控制基因在植物绿色组织特异表达的DNA功能片段。
[0033]本发明还提供了一种表达盒，利用上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen与目的基因连接所构建而得。
[0034]本发明还提供了一种植物表达载体，利用上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen构建而得。
[0035]作为本发明的植物表达载体的改进:植物表达载体为pCambial300-p35S-G6-pGreen—CrylAc。
[0036]本发明还同时提供了上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在制备具有抗虫能力的转基因植物的应用。植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆或高粱。
[0037]本发明还同时提供了上述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在提高植物抗虫活性中的应用。植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆或高粱。
[0038]备注说明:本发明中玉米绿色组织特异表达启动子的来历:水稻中photosystemlIΙΟ-kDa的蛋白基因名为D540,玉米中与水稻D540的同源基因为GenBankID:EU961665,该基因上游的部分启动子序列被发明人分离出来，也可以在植物绿色组织中特异性表达，该段启动子为TIGR maize database (http://maize, jcv1.0rg/)中的AZM5_84822genome序列中EU961665基因上游_471bp~_41bp的序列。发明人在这段启动子上游又加上了 35S增强子序列，从而形成了在植物绿色组织中高效特异表达的启动子pGreen。
[0039]本发明目的在于提供一种由玉米的IOkDa光系统蛋白II(photosystem IIlOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分启动子序列(见SEQ ID N0:2)并添加CaMV (35S)启动子的增强子序列而得的启动子，其DNA序列为SEQ ID N0:1。该启动子驱动基因在植物茎、叶等绿色组织特异、高效表达，而在胚和胚乳中不表达或表达量极低至可检测水平以下，命名为 pGreen。
[0040]本发明另一目的在于提供该启动子在制备转基因植物以及提高植物抗虫和/或抗除草剂活性中的应用。
[0041]本发明涉及分离、改良和应用一种包含玉米的IOkDa光系统蛋白IKphotosystemIIlOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分启动子序列的DNA片段，该片段包含调控基因在植物茎、叶等绿色组织中特异表达的调控原件。其中所述片段如序列表SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示，或基本上相当于SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列的亚片段。
[0042]本领域技术人员可以将本发明启动子用于构建绿色组织特异表达的表达载体。此外还可以将目的基因与本发明的启动子连接构建表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，获得绿色组织特异表达的重组表达载体。因此，本发明还包括由上述启动子构建的表达载体、表达盒，以及含有上述表达盒的重组载体。
[0043]本发明的启动子可以用于制备转基因植物。例如，通过农杆菌介导、基因枪法或花粉管通道等方式获得转基因植物，从而可以通过引入抗虫、抗除草剂、抗病等基因，培育出抗虫、抗除草剂、抗病等植物，提高植物抗虫、抗除草剂、抗病活性。植物可以是水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、高粱等。这些植物转基因技术是已经现有的技术。这些被转入植物的抗性基因可以是现有的或/和根据现有基因改良的或/和新发现的基因。
[0044]本发明提供了一种可以增强植物转基因安全性的方法。这种方法包括将上述具有启动子功能的DNA片段和需要的功能基因连接转入植物，由于该启动子不在胚和胚乳中表达或表达量极低至可检测水平以下，避免了转基因作物可能产生的食品安全问题。
[0045]本发明能够进一步提供或应用利用上述具有启动子功能的DNA片段获得的转基因植株和相应的种子，可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其它的植株。
[0046]在本发明实施例中，利用SEQ ID NO:1所述启动子pGreen构建得到植物表达载体pCambial300-p35S-G6-pGreen_CrylAc (如图1b所示)，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述载体转化水稻品种，可以获得对棉铃虫幼虫和除草剂草甘膦均具有良好抗性的植株。且外源的杀虫蛋白在转基因水稻茎、叶特异性表达，而在其种子中不表达或表达量极低至可检测量以下。
[0047]本发明的启动子为绿色组织特异表达，可以用于基因在绿色组织特异表达的研究。
[0048]本发明适用于所有植物，包括单子叶和双子叶植物。即，包括水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、高粱等粮食作物和经济作物。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0050]图1是本发明实施例1中载体示意图；
[0051]a:初始载体pCambial 1300结构示意图；
[0052]b:植物转化载体 pCambial 1300-p35S-G6-pGreen_CrylAc 的 T-DNA 结构不意图；
[0053]c:植物转化载体 pCambial 1300-p35S-G6-pZmUb1-CryIAc 的 T-DNA 结构不意图。其中Ubi表示玉米ZmUbi启动子，35S表示花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子，pGreen表示本发明提供的绿色组织特异性启动子。
[0054]图2是转基因和非转基因水稻对棉铃虫一龄幼虫的生物测定图；
[0055]A:携带pGreen启动子的转基因水稻,对棉铃虫一龄幼虫有很好的抗性；
[0056]B:非转基因亲本水稻“秀水-134”作为阴性对照。
[0057]图3是转基因水稻对草甘膦的抗性检测图；具体为:对温室水培长至约15cm的秧苗喷施稀释100倍的41%草甘膦水剂，7天后拍照;A1、A2是转pCambial1300-p35S-G6-pGreen-CrylAc抗虫抗除草剂水稻，CK是非转基因亲本水稻。
[0058]图4是通过棉铃虫生物测定和Western blot分析筛选出抗虫基因表达量高的转基因株系，重新提取叶片和种子的可溶性蛋白测定融合蛋白表达水平图；
[0059]M,预染蛋白marker ；+,阳性对照，pET28a_Del_CryIAc-CryIIe表达载体表达的蛋白；_，阴性对照，非转基因植株“秀水-134” ； 1，2和3分别表示携带pGreen启动子的不同转基因株系；4和5分别表示携带ZmUbi启动子的不同转基因株系；L，代表从植株叶片中提取的蛋白；S，代表从植株种子中提取的蛋白。携带pGreen的株系种子中检测不到抗虫蛋白，而ZmUbi株系中可以检测到。
[0060]图5是转基因水稻T1代S20株系单棵植株叶片、种子中抗虫蛋白表达分析图；
[0061]a:随机选取株系S20中10棵植株提取叶片可溶性蛋白进行Western Blot检测；M,预染蛋白marker ;+，原核菌株表达阳性蛋白；_，非转基因植株“秀水-134”作为阴性对
昭.[0062]b:选取编号为7，8, 9的植株提取叶片和种子中的可溶性蛋白进行检测；L,表不从植株叶片中提取的蛋白；S，表示从种子中提取的蛋白…和+同上；-，从非转基因水稻种子中提取的蛋白。
【具体实施方式】
[0063]以下结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0064]若未特别指明，本发明以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法。
[0065]实施例1:植物表达双元载体构建
[0066]选取crylAc (已公开基因，GenBank:AY225453.1)抗虫基因为研究对象，分别用本发明的绿色组织特异启动子PGreen (序列见SEQ ID NO:1)和组成型启动子ZmUbi (Zeamays Ubiquitin-1)(作为对照)驱动抗虫基因表达，以抗草甘膦基因G6 (专利申请号:200610052573.4)作为筛选标记基因，构建双元表达载体。
[0067]具体如下:
[0068]I)、对 pCambial300 (Cambia, Australia ;图1.a)载体进行改造:
[0069]将原有的抗潮霉素基因替换为抗草甘膦基因G6，改造过的载体可以用Hind观Kpn进I行酶切，以它作为构建T-DNA的基础载体pCambial300-p35S_G6。
[0070]具体为:首先用PCR方法分别扩增玉米Ubi基因和G6基因，通过PCR —方面在ZmUbi启动子基因两端分别加上HindIII和BamHI酶切位点，另一方面在G6基因两端分别加上BamHI和XhoI+SacI位点。然后将PCR获得的ubi基因和G6基因顺次克隆入通用载体PMD19-T (Takara, Japan)载体中。用HindIII和XhoI酶切上述所得的载体，从而获得pZmUb1-G6片段。接着，将载体pCambia 1300上的潮霉素抗性基因用XhoI酶切去除，将酶切后的载体回收后末端补平，与同样末端补平的片段pZmUb1-G6连接,得到基础载体pCambia1300-p35S-G6。
`[0071]2)、根据基因在水稻中表达密码偏好性合成抗虫基因(Sangon Biotech，上海):
[0072]用正向Sy-ACGGGATC CA TGGA T AA CA ATCCG AA CA TC 和反向5’-ACGGAGCTCCTATTCCTCCATAAGGAG引物(下划线部分分别为BamHI和SacI酶切位点)扩增CrylAc 基因；
[0073]扩增体系50 μ 1:
[0074]
【权利要求】
1.植物绿色组织特异性表达启动子pGreen，其特征是为SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen，其特征是:所述植物绿色组织特异性表达启动子pGreen包含烟草花椰菜病毒35S启动子的增强子序列和玉米的 IOkDa 光系统蛋白 II (photosystem IIlOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分启动子序列。
3.根据权利要求2所述的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen，其特征是:所述玉米的 IOkDa 光系统蛋白 II (photosystem IIlOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分启动子序列为以下任一: DSEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； 2)SEQID NO:2所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸,且具有相同功能的核苷酸序列； 3)由SEQID NO: 2产生的具有控制基因在植物绿色组织特异表达的DNA功能片段。
4.一种表达盒，其特征是:利用如权利要求1~3任一所述的植物绿色组织特异性表达启动子PGreen与目的基因连接所构建而得。
5.一种植物表达载体，其特征是:利用如权利要求1~3任一所述的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen构建而得。
6.根据权利要求5所述的植物表达载体,其特征是:植物表达载体为pCambial300-p35S-G6-pGreen_CrylAc0
7.如权利要求1~3任一所述的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在制备具有抗虫能力的转基因植物的应用。
8.根据权利要求7所述的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在制备具有抗虫能力的转基因植物的应用，其特征是:所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆或高粱。
9.如权利要求1~3任一所述的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在提高植物抗虫活性中的应用。
10.根据权利要求9所述的植物绿色组织特异性表达启动子pGreen在提高植物抗虫活性中的应用，其特征是:所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆或高粱。
【文档编号】A01H5/00GK103525818SQ201310476765
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月13日 优先权日:2012年10月14日
【发明者】秦毅, 方军, 张先文, 沈志成 申请人:浙江大学