快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，该方法是待小孢子胚状体产生时，将其转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养，3～7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂粉1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽；15～20d后，转入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%琼脂粉的MS固体培养基中，20～30d后大多数植株长成健壮且生根的幼苗，可驯化移栽，培养条件都为90uE/m2/s、12hr/d、25℃。再生植株平均成苗率达83.5%。本发明有效解决小孢子胚易褐化、玻璃化的问题；有效缩短利用游离小孢子培养获得DH株系的时间；不需添加任何激素，更安全。
【专利说明】快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，属于植物组织培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002]芸薹属蔬菜属于异花授粉植物，杂种优势明显，在育种上获得一个纯系需要5~7年的时间，而游离小孢子培养可以在I~2年获得双单倍体植株，大大节省纯化时间和工作量。同时由于再生群体中单倍体的存在也有利于隐性性状的表达，丰富了育种资源。此外，游离小孢子属于单细胞，应用于诱变育种、突变体筛选和基因转化等有其特殊的优势，自发或人工加倍获得的DH群体更是进行分子标记和绘制基因图谱的理想材料。
[0003]游离小孢子培养技术，是由Lichter (1982)在甘蓝型油菜上首创的单细胞培养技术，随后加拿大、德国等国家相继开展了此项研究工作，提高了小孢子的胚诱导频率，于20世纪80年代末初步建立了甘蓝型油菜的小孢子培养体系。此后小孢子培养技术在芸薹属不同蔬菜中得到了迅速发展，创造了从花蕾机械分离小孢子的方法，确立了可提高诱导率的花蕾标准并将热激处理用于培养，并在芥菜、结球甘蓝、花椰菜、青花菜、大白菜等作物上获得成功。我国在游离小孢子培养方面的研究起步较晚，主要是借鉴国外的经验，但发展迅速。20世纪90年代，曹鸣庆等(1993)、陈玉萍等(1998)和严准等(1999)分别首次在不结球白菜、紫菜薹和球茎甘蓝等作物的游离小孢子培养上获得成功。2003年，朱允华等(2003)首次报道菜心游离小孢子培养成功。此外芸薹属蔬菜中青花菜、芥蓝、花椰菜也先后获得了小孢子再生植株。
[0004]但前 人的研究主要聚焦在高效诱导胚状体的产生方面，对小孢子胚再生植株频率的研究甚少，而且缺乏深入的研究。但对于育种工作者来说，小孢子植株远比小孢子胚更具有实际意义。因此，如何获得高频率的小孢子再生植株非常关键，也是目前获得小孢子再生植株群体(DH)的主要限制因素。刘凡等(1997)的研究发现，小孢子胚能否顺利发育成植株，受内外两种因素的限制。小孢子胚在分化、继代培养过程中存在着褐化、玻璃化等现象，直接影响小孢子植株的再生率，因此本发明旨在建立稳定高频的不结球白菜和青花菜游离小孢子培养再生植株体系。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于针对上述现有技术中获得游离小孢子再生植株存在的成苗效率低的问题，提供一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法。
[0006]本发明的目的是通过以下方式实现的:
[0007]—种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，该方法包括如下步骤:
[0008](I)花蕾的选择、预处理和灭菌:在初花期和盛花期，选取发育时期为单核靠边期的花蕾；将花蕾保湿并置于冰箱中冷藏静置24h后灭菌；[0009](2)小孢子分离与纯化:向灭菌后的花蕾中加入B5-13液体培养基，采用挤压法使小孢子游离出来，然后过滤，收集滤液，离心，弃上清液，得到纯化后的小孢子；所述的花蕾与B5-13液体培养基的比例为每28-32个花蕾中加入I~2ml的B5-13液体培养基。
[0010](3)培养液的分装、热激诱导:将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液体培养基重新悬浮，然后分装，小孢子密度I蕾/ml，封口后、热激诱导；
[0011](4)胚状体形成:将热激后的小孢子悬浮液于25°C黑暗静置培养，2~3周后出现肉眼可见的胚状体；
[0012](5)振荡培养:将上述胚状体转到20001x、25°C、60r/min摇床上振荡培养；
[0013](6)诱导再生植株:振荡培养3~7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽，15~20d后，将其转入含10%椰汁，3%蔗糖，
0.78%琼脂的MS固体培养基中，培养20~30d。 [0014]上述单核靠边期对应的花蕾长度不结球白菜为2.0~3.0mm,青花菜为3.0mm~
4.0mm ；
[0015]所述的B5-13液体培养基为小孢子提取液，是通过以下方法制备得到的:分别吸取B5培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素IOml四种母液混合到500ml蒸懼水中，混匀，再加入130g鹿糖,搅拌至完全溶解，定容至1000ml,然后调pH至
6.0~6.2 ;于121。。，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。
[0016]所述的1/2NLN液体培养基是通过以下方法制备得到的:分别吸取NLN培养基的大量元素25ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素IOml四种母液混合到500ml蒸懼水中，混匀，再依次加入肌醇0.lg、谷氨酰胺0.8g、丝氨酸0.lg、谷胱甘肽0.03g、鹿糖130g,搅拌至完全溶解后，定容至1000ml,然后调pH至6.0~6.2 ;采用0.22 μ m的微孔滤膜抽滤灭菌。
[0017]所述的B5固体培养基是通过以下方法制备得到的:分别吸取B5培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素IOml四种母液混合到500ml蒸懼水中，混匀，再加入25g鹿糖,搅拌至完全溶解,定容至1000ml,加热至沸腾后,加入IOg琼脂粉,搅拌至完全溶解，调pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。
[0018]所述的MS固体培养基是通过以下方法制备得到的:分别吸取MS培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素IOml四种母液,椰汁100ml混合到500ml蒸懼水中，混匀，再加入30g鹿糖,搅拌至完全溶解,定容至1000ml,加热至沸腾后,加入7.8g琼脂粉，搅拌至完全溶解，调pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。
[0019]步骤(6)中再生植株的培养条件都为90uE/m2/s、12hr/d、25°C。
[0020]所述的灭菌步骤是将预处理后的花蕾依次用体积浓度为75%的酒精和7% (v/v)的NaClO溶液消毒，无菌水冲洗。
[0021]所述的热激诱导是将小孢子悬浮液置于33°C高温下黑暗静置24h。
[0022]所述的花蕾的选择是通过醋酸洋红压片法镜检确定小孢子的发育时期及与花蕾长度的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾。
[0023]培养基中的大量元素可为NH4NO3、KNO3、MgSO4.7H20、(NH4)2S04、NaH2PO4.H2O、Ca(NO3)2 MH2CKKH2PO4XaCl2 中的一种或多种。微量元素可为 MnSO4.H2O、H3B03、ZnSO4.7Η20、K1、Na2MoO4.2H20、CuSO4.5H20、CoCl2.6Η20 中的一种或多种。Fe 盐可为=Na2-EDTA,FeSO4.7Η20中的一种或多种。有机元素可为肌醇、烟酸、VB6, VB1、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、谷胱甘肽、叶酸、生物素中的一种或多种。
[0024]上述快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，具体包括如下步骤:
[0025](I)花蕾的选择:在初花期和盛花期，通过醋酸洋红压片法镜检确定小孢子的发育时期及与花蕾长度的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾；
[0026](2)花蕾预处理:将选取的适宜花蕾保湿并置于4°C冰箱中处理24h ；
[0027](3)灭菌:选取的花蕾用75%的酒精消毒30s，然后用7% (v/v)的NaClO溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3次，每次3~5min ；
[0028](4)小孢子分离与纯化:将消毒后的花蕾置于研钵中,加入I~2ml B5_13液体培养基，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用300目滤网过滤，将滤液收集于IOml离心管，1000rpm离心3min,弃上清液,重复3次；
[0029](5)培养液的分装:将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液体培养基重新悬浮，然后分装于60X 15mm培养皿中，每皿3ml，小孢子密度约I蕾/ml，用Parafilm膜封Π ；
[0030](6)热激诱导:将上述小孢子悬浮液置于33°C高温下黑暗处理24h ；
[0031](7)胚状体形成:将热激后的小孢子悬浮液于25°C黑暗静置培养，2~3周后即可出现肉眼可见的胚状体；
[0032](8)振荡培养:将上述胚状体转到20001x、25°C、60r/min摇床上振荡培养；
[0033](9)诱导再生植株:振荡培养3~7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽，15~20d后，将其转入含10%椰汁，3%蔗糖，
0.78%琼脂的MS固体培养基中，20~30d即可长成健壮且生根的幼苗，可驯化移栽；
[0034]游离小孢子培养的各种母液配方如下:`[0035]
【权利要求】
1.一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)花蕾的选择、预处理和灭菌:在初花期和盛花期，选取发育时期为单核靠边期的花雷；将花雷保湿并直于冰箱中冷减静直24h后灭囷； (2)小孢子分离与纯化:向灭菌后的花蕾中加入B5-13液体培养基，采用挤压法使小孢子游离出来，然后过滤，收集滤液，离心，弃上清液，得到纯化后的小孢子；所述的花蕾与B5-13液体培养基的比例为每28-32个花蕾中加入I~2ml的B5-13液体培养基。 (3)培养液的分装、热激诱导:将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液体培养基重新悬浮，然后分装，小孢子密度I蕾/ml，封口后、热激诱导； (4)胚状体形成:将热激后的小孢子悬浮液于25°C黑暗静置培养，2~3周后出现肉眼可见的胚状体； (5)振荡培养:将上述胚状体转到20001x、25°C、60r/min摇床上振荡培养； (6)诱导再生植株:振荡培养3~7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽，15~20d后，将其转入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%琼脂的MS固体培养基中，培养20~30d。
2.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于:单核靠边期对应的花蕾长度不结球白菜为2.0~3.0mm,青花菜为3.0mm~4.0mnin
3.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于:所述的B5-13液体培养基为小孢子提取液，是通过以下方法制备得到的:分别吸取B5培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素IOml四种母液混合到500ml蒸懼水中，混匀，再加入130g鹿糖,搅拌至完全溶解,定容至1000ml,然后调pH至6.0~6.2 ;于121。。，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。
4.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于:所述的1/2NLN液体培养基是通过以下方法制备得到的:分别吸取NLN培养基的大量元素25ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素IOml四种母液混合到500ml蒸懼水中，混匀，再依次加入肌醇0.lg、谷氨酰胺0.8g、丝氨酸0.lg、谷胱甘肽0.03g、鹿糖130g,搅拌至完全溶解后，定容至1000ml,然后调pH至6.0~6.2 ;采用0.22 μ m的微孔滤膜抽滤灭菌。
5.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于:所述的B5固体培养基是通过以下方法制备得到的:分别吸取B5培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素IOml四种母液混合到500ml蒸懼水中，混匀，再加入25g鹿糖,搅拌至完全溶解,定容至1000ml,加热至沸腾后,加入IOg琼脂粉,搅拌至完全溶解，调pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。
6.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于:所述的MS固体培养基是通过以下方法制备得到的:分别吸取MS培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素IOml四种母液,椰汁100ml混合到500ml蒸懼水中，混匀，再加入30g鹿糖,搅拌至完全溶解,定容至1000ml,加热至沸腾后,加入7.8g琼脂粉，搅拌至完全溶解，调pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。
7.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于:步骤(6)中再生植株的培养条件都为90uE/m2/s、12hr/d、25°C。
8.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于所述的灭菌步骤是将预处理后的花蕾依次用体积浓度为75%的酒精和7% (v/v)的NaClO溶液消毒，无菌水冲洗。
9.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于所述的热激诱导是将小孢子悬浮液置于33°C高温下黑暗静置24h。
10.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于所述的花蕾的选择是通过醋酸洋红压片法镜检确定小孢子的发育时期及与花蕾长度的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾。
【文档编号】A01H4/00GK103718965SQ201310726458
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】李英, 刘环环, 侯喜林, 刘同坤 申请人:南京农业大学