包含突变tghVI等位基因的番茄植物的制作方法

包含突变tghVI等位基因的番茄植物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及其中VI型香毛簇的腺头部不存在，并且具有改变的黄酮类化合物和挥发性化合物的组成的番茄植物(番茄)。此外，典型的番茄气味不存在或几乎不存在。植物包含突变等位基因，所述基因可获自其代表性种子在保藏登录号NCIMB 41845下被保藏的番茄植物。所述突变等位基因在染色体9上位于番茄基因组的物理图谱上的位置1750800 bp与4517648 bp之间，优选位置1939546 bp与2970346 bp之间，最优选位于大致位置2454946 bp。
NCIMB41845
2011.06.13
【专利说明】包含突变tghVI等位基因的番茄植物
[0001] 本发明涉及未显示绿色染色或显示降低的水平的绿色染色和/或未显示气味或 显示减弱的气味的番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum L·))。本发明还涉及标志物和 标志物用于鉴定具有该表型的番茄植物的用途。本发明还涉及这样的植物的种子和后代以 及用于获得这样的植物的繁殖材料。此外，本发明还涉及显示该表型的植物、种子和繁殖材 料在育种程序中用作种质的用途。
[0002] 番茄是在世界范围内在所有条件和气候下，在设施栽培中或在露地中生长的蔬菜 作物。生长番茄植物需要大量劳力和注意力，在该过程中由不同人重复处理植物。处理植 物包括活动例如移植、种植、剪枝、卷绕（winding)以及当然的收获。
[0003] 从事番茄作物的人迅速地注意到对于番茄植物的绿色部分的每一接触，绿色物质 脱落在皮肤上或与其接触的任何表面上。物质在颜色上还可以是微黄色的。特别地手和 衣服变得被该物质覆盖，在非常密集的处理之后该物质可在例如手上导致几乎黑绿色的染 色。该物质的主要难处是其非常难通过常规洗涤从皮肤或衣服除去。绿色或微黄色的物质 导致绿色的染色。
[0004] 番茄植物的另一个方面是其散发的典型的番茄气味。当人频繁地暴露于番茄作物 时这可变得相当令人不适。
[0005] 番爺（番爺（Solanum Iycopersicum))的不同植物部分的表面覆盖有香毛簇 (trichomes)(非腺的和有腺的）。非腺毛通常被当作'毛发'并且不产生、贮存或分泌特定 生物化学化合物。
[0006] 然而番茄中的许多生物化学化合物在腺毛中产生。腺毛通常由茎（由一个或 多个细胞构成）和在茎尖的一个或多个腺细胞（形成腺头部）组成。4种不同类型的 腺毛已在番茄和相关茄属的种中被鉴定，即I、IV、VI和VII型。这些类型相异在于茎 的尺寸和长度以及形成腺头部的分泌细胞的数目（McDowell等人，Plant Physiology Vol. 155, 524-539(2011))。包含一个形成腺头部的腺细胞的单细胞腺被分类为分泌腺，而 多细胞腺被分泌为存储腺（storage glands)。
[0007] VI型香毛簇由在单细胞茎或双细胞茎的末端的4个盘状细胞或腺细胞组成。4个 盘状细胞形成多细胞腺头部（图1)。
[0008] 由番茄中的不同腺毛产生的生物化学化合物包括萜类化合物、黄酮类化合物、月旨 肪酸、生物碱和酰基糖例如酰基葡萄糖和酰基蔗糖。然而物质例如叶绿素不在已知由番茄 的腺毛产生或分泌的化合物中。已知产生的化合物在吸引和排斥不同昆虫中和在决定对某 些疾病的易感性中起着重要作用。然而，这些代谢产物的作用的许多方面仍然还不清楚，广 泛的研究正在进行来更精确地确定腺毛和它们分泌的物质的功能性。
[0009] 此外，关于哪种物质由什么类型的腺毛产生的分配的资料相当有限并且需要专门 的方法来获取。对于许多物质，假定它们由几种腺毛类型产生或可由几种腺毛类型产生，尽 管已指出由某一类型的腺毛产生的质量和数量上存在着差异。例如已知在昆虫抗性中起着 重大作用的酰基糖主要在番茄I型和IV型香毛簇中产生。
[0010] 本发明的目的是提供未显示绿色染色或显示降低的水平的绿色染色和/或未显 示典型的番爺气味或显示减弱的典型的番爺气味的番爺植物（Solanum lycopersicum)。 toon] 本发明的其它目的是提供可鉴定具有本发明的表型的植物的标志物。
[0012] 在导致本发明的研究过程中，通过应用EMS处理方案（实施例1)产生新型突变番 茄植物。从所得的群体鉴定导致本发明的植物为在接触绿色营养部分例如叶或茎时其未留 下绿色残留物或绿色染色。新型番茄植物的植物生长和植物类型与一般番茄植物是相当 的。突变植物在生长或植物习性上被认为是不弱的。在植物的生殖方面（例如不育症、果 实发育或种子发育）未观察到缺陷。
[0013] 分析了新型番爺植物的表型特征。种植的番爺（Solanum Iycopersicum)中最丰 富的腺毛是I型和VI型。令人惊讶地，该特定植物的绿色植物部分的表面的观察显示VI 型的野生型香毛簇未被检测到。由4个腺细胞组成的VI型香毛簇的典型腺头部不存在于 香毛簇中（图2B)，仅茎仍可被识别。
[0014] 因此发现在不显示绿色染色的新产生的番茄植物中，VI型香毛簇的腺细胞不存 在。
[0015] 还发现该特定植物也缺乏典型的番茄-植物气味。
[0016] 进行新型番茄植物的进一步分析以测定各种生物化学化合物的存在。对3组挥发 物：萜类、倍半萜类和醛类进行了测量。分析显示本发明的植物具有显著减少的在这些组内 被分析的几乎所有挥发物。一些挥发物不能被检测到并被认为不存在或几乎不存在。生物 化学分析详细地描述于实施例5中。
[0017] 对于所有测量的萜类，在本发明的植物中，相较于其它植物（包括野生型和同基 因的植物），面积减小100 - 10, 〇〇〇倍（图3、8和11)。倍半萜类在本发明的植物中也显示 了相似的100-10, 〇〇〇倍范围的面积减小（图4、9和12)。
[0018] 至于醛类，当考虑年度时，对于本发明的植物，化合物顺-3-己醛显示显著的3倍 减少，这使用不平衡方差分析（ANOVA)法来计算，并且己醛减少约40倍（图5、10、13和14)。
[0019] 属于本发明的植物因而显示除了 VI型腺的不存在、绿色染色的不存在以及典型 的番茄气味的不存在或强有力减少之外，还有萜类、倍半萜类和醛类的显著减少。
[0020] 对在与绿色营养部分接触后由已知番茄植物产生的绿色染色进行进一步的实验。 分析已知番茄植物的染色并将其与在与本发明的番茄植物接触后释放的物质相比较。在茎 表面的乙醇提取物中测定染色颗粒的吸光度。如本领域技术人员所公知的，植物中的绿色 是由叶绿素的存在来特征性决定的。
[0021] 因此令人高度惊讶地，分析显示从本实验中使用的番茄植物获得的物质都不包含 叶绿素（实施例6)。叶绿素通常显示两个吸收峰，一个约在420与460nm之间，一个在约 620与700nm之间，这两个峰明显不存在于所有提取物中。因此，必然推断本发明的番茄植 物的绿色染色的不存在并非是因为叶绿素含量的改变。
[0022] 同样地，在分析的物质中也未发现负责或促成许多有色植物组织的类胡萝卜素。 类胡萝卜素在400与500nm之间具有吸收峰，所述吸收峰也明确地不存在于所有样品中，如 可从图6看到的。叶绿素和类胡萝卜素都是不溶于水的。到目前为止，因此在潜在地可负 责绿色染色的化合物中未发现差异。
[0023] 然而，来自确实显示绿色染色的植物的提取物在约355与370nm之间，特别地在约 360nm处显示吸收峰。该吸收峰已知与属于黄酮类化合物的种类的色素相关。
[0024] 来自本发明的植物的提取物的吸光度低于0.05的检测阈值。因此确定本发明的 番茄植物不存在黄酮类化合物，该黄酮类化合物存在于获自已知番茄植物的染色中（图6， 表1)。
[0025] 该额外的研究显示本发明的植物不包含存在于现有技术的番茄植物的绿色营养 部分中的黄酮类化合物。
[0026] 本发明因而提供了番茄植物，其特征在于：
[0027] -所述植物不包含VI型香毛簇的腺细胞或具有至少显著减少的数目的所述腺细 胞，
[0028] -所述植物在接触后不引起绿色染色，
[0029] -所述植物具有显著降低的水平的挥发物，特别地萜类、倍半萜类和醛类，
[0030] -所述植物不具有典型的番茄气味或至少显著减少典型的番茄气味，和
[0031 ]-所述植物不包含黄酮类化合物或具有至少显著降低的水平的黄酮类化合物。 [0032] 根据本发明发现这些表型参数具有突变等位基因形式的遗传基础。
[0033] 进行了遗传作图以测定突变等位基因的遗传定位和确认牵涉的基因的数目（实 施例4)。所述作图确认了本发明的性状是单基因因素的作用，并且牵涉一个隐性突变等位 基因。该突变等位基因被命名为tghVI (番茄无腺毛VI型）。
[0034] 根据本发明发现导致本发明的表型的突变tghVI等位基因在番茄基因组的染色 体9上位于番茄基因组的物理SL2. 30图谱的物理位置1750800bp与4517648bp之间，优选 位置1939546bp与2970346bp之间，最优选大致位置2454946bp上。
[0035] 突变tghVI等位基因可通过与tghVI等位基因连锁的分子SNP标志物的存在来鉴 定。在保藏NCMB41845中，与tghVI等位基因连锁的SNP标志物在染色体9上位于番茄物 理图谱SL2. 30的1750800bp，并且是从A至G的核苷酸变化。
[0036] 突变tghVI等位基因在本发明的植物中的存在优选还与在染色体9上位于番茄基 因组的公共SL2. 30图谱的1750800bp上的分子SNP标志物连锁，其中SNP是从A至G的核 苷酸变化。然而，SNP标志物的不存在并不意味着突变等位基因不存在。不具有SNP标志 物但具有由突变等位基因引起的本发明的表型的植物从而可仍然是本发明的植物。
[0037] 本发明从而提供了包含突变等位基因的番爺植物（Solanum Iycopersicum)，所述 等位基因与下列表型特性相关：
[0038] -所述植物不包含VI型香毛簇的腺细胞或具有至少显著减少的数目的所述腺细 胞，
[0039]-所述植物在接触后不引起绿色染色，
[0040]-所述植物具有显著降低的水平的挥发物，特别地萜类、倍半萜类和醛类，
[0041]-所述植物不具有典型的番茄气味或至少显著减少典型的番茄气味，和 [0042]-所述植物不包含黄酮类化合物或具有至少显著降低的水平的黄酮类化合物。
[0043] 本发明的植物具有改良的VI型香毛簇，所述改良导致VI型腺细胞不存在或导致 非功能性IV型腺细胞或导致不恰当地发挥功能的VI型腺细胞。4个腺细胞（即完整腺头 部）优选完全不存在。具有不存在所有4个组成腺头部的腺细胞的改良VI型香毛簇的性 状可例如获自植物，所述植物的代表性种子在保藏号NCIMB41845下保藏在NCIMB中，但是， 不存在4个腺细胞或具有非功能性或功能紊乱的腺细胞的性状还可获自其它仍然未知的 来源。
[0044] 在现有技术中从未预期单突变会导致VI型香毛簇的腺细胞的不存在，并且同时 会产生染色的完全缺失和典型番茄气味的显著减少或不存在，因此本发明是高度令人惊讶 的。不同类型的香毛簇在番茄植物上的存在，以及所有腺毛产生或贮存不同的可释放的物 质，从而潜在地促成特征如香气、颜色、渗出物组合物和防御机制的认知，不会导致假定：单 突变可给出这样巨大且多样的作用。
[0045] 本发明的番茄植物的使用在番茄生长过程中导致较大的优势。在处理番茄植物之 前利用物质处理皮肤以防止染色的必要性被消除。当在番茄作物中工作时，保护性衣服或 手套的使用大大减少。此外，不再需要在处理番茄植物后除去染色的严格方法。本发明的 番茄植物的使用将大大有利于番茄生长。
[0046] 绿色染色的不存在和典型番茄-植物香气的减少或不存在是由本发明的植物的 挥发物和黄酮类化合物的组成的改变造成的。
[0047] 在一个实施方案中，突变tghVI等位基因可获自包含所述突变tghVI等位基因的 番茄植物，所述植物的代表性种子在保藏号NCMB41845下保藏在NCMB中。
[0048] 在一个实施方案中，本发明的具有突变tghVI等位基因的番茄植物可通过将 第一番茄植物与第二番茄植物杂交，其中所述植物之一从其代表性样品在保藏登录号 NCMB41845下保藏于NCMB中的种子或其后代植物生长而来，和优选在F2代中选择相较于 不具有tghVI等位基因的植物在接触后未显示来自植物的绿色营养部分的绿色染色的植 物来获得。
[0049] 在一个实施方案中，用于杂交以获得本发明的番茄植物的所述植物之一携带 tghVI等位基因·
[0050] 可针对表型进行包含tghVI等位基因的植物的选择，即测定一个或多个性状的表 型方面的存在，所述表型为绿色染色的不存在、黄酮类化合物不存在或几乎不存在、挥发物 的减少以及典型番茄气味的不存在。此外，可针对不存在腺头部的改良VI型香毛簇的存在 进行选择。
[0051] 可以例如通过使用一个或多个分子标志物，可选择地针对相关的突变tghVI等位 基因的存在在遗传上进行选择。分子标志物的使用导致可靠的结果，并且可以在极早的植 物时期进行。
[0052] 突变tghVI等位基因的存在还导致4个形成VI型香毛簇的腺头部的腺细胞的不 存在。本发明的番茄植物的叶从而不存在于完全发育的VI型香毛簇，并且仅具有不存在腺 头部的VI型香毛簇。然而，可在本发明的番茄植物上检测到除VI型以外的其它腺以及非 腺毛。
[0053] VI型香毛簇的腺的不存在与在接触后来自植物的绿色营养部分的绿色染色的不 存在相关。绿色营养部分包括植物的叶和茎。tghVI等位基因的存在优选还导致本发明的 番茄植物中典型番茄气味的不存在。绿色染色的不存在和典型番茄气味的不存在是因 VI 型香毛簇的腺不存在而引起的至少黄酮类化合物和挥发物的组成的改变的结果。
[0054] 在一个实施方案中，本发明的突变tghVI等位基因以纯合子的形式存在。本发明 的性状是单基因的，即由单个基因引起，并且以隐性方式遗传。关于本发明的性状，可适当 地通过从初次杂交和自交步骤导致的种子生长F2代植物，和选择显示期望的性状的植物， 来从不具有该性状的植物与确实具有所述性状的植物之间的杂交的后代中鉴定具有遗传 性状即突变tghVI等位基因的植物。选择植物可通过测定绿色染色的不存在和/或典型番 茄气味的不存在和/或黄酮类化合物的不存在和/或挥发物的不存在或减少和/或VI型 香毛簇的腺细胞的不存在来在表型上进行，或可通过鉴定突变等位基因（例如通过本文中 定义的标志物）来进行。
[0055] 通过与对照相比较来测定绿色染色的不存在。适当地，测定绿色染色的不存在的 对照是任何现有番茄植物，或同基因的番茄植物，即在遗传上与本发明的植物相同，但不具 有导致本发明的性状的突变tghVI等位基因的植物。
[0056] 在一个实施方案中，可通过测定4个形成VI型香毛簇的腺头部的腺细胞的不存在 来在表型上选择F2代的植物。在植物的绿色营养部分上测定本申请从始至终提及的VI型 香毛簇的腺头部的不存在。不应当在果实上测定VI型香毛型的腺的不存在。
[0057] 本发明还涉及所述番茄植物的细胞。这样的细胞可以以分离的形式存在或可以为 完整番茄植物或其部分的部分并且其仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞在其遗传组 成中具有导致确定本发明的番茄植物的特征的遗传信息。本发明的番茄植物的每一个细胞 具有导致所述性状的表型表达的遗传信息。因而每一个细胞在其基因组中具有突变tghVI 等位基因。
[0058] 本发明还涉及所述植物的组织。组织可以是未分化的组织或已分化的组织。未分 化的组织是例如茎尖、花药、花瓣、花粉，并且可用于微组织繁殖法来获得可生长为本发明 的具有上述鉴定的特征的新型植物的新植株。
[0059] 根据其另外方面的本发明涉及所述植物的种子。虽然种子未显示本发明的番茄植 物的遗传性状，但它们具有当从种子生长植物时使该植物成为本发明的具有上述鉴定的特 征的植物的遗传信息。
[0060] 本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织和种子的后代。这样的后代本身可以是植 物、细胞、组织或种子。
[0061] 如本文中所用，单词"后代"意欲指来自与本发明的包含突变tghVI等位基因（所 述突变等位基因导致VI型香毛簇的腺头部不存在）的植物杂交的第一后代和所有其它后 代。本发明的后代是与本发明的植物的任何杂交的后代，所述本发明的植物具有导致VI型 香毛簇的腺头部不存在或导致上文中鉴定的其它特征的性状。
[0062] "后代"还包括具有本发明的性状并且通过营养繁殖或增殖从其它植物或本发明 的植物的后代获得的植物。
[0063] 本发明从而还涉及所述植物的种子和适合于有性生殖的植物的部分。这样的部分 例如选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。此外，本发明还涉及适合营养生殖的植 物的部分，具体地插枝、根、茎、细胞和原生质体。
[0064] 根据其另外的方面，本发明提供了所述植物的组织培养物。组织培养物包含可再 生细胞。这样的组织培养物可源自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖、花药、花、 种子和茎。
[0065] 本发明还涉及杂交种子和产生杂交种子的方法，所述方法包括将第一亲本植物与 第二亲本植物杂交和收获所得的杂交种子，其中所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植 物是本发明所述的植物。适当地，在这样的杂交种子中，tghVI等位基因以纯合形式存在并 且植物表达上述表型。
[0066] 本发明还涉及本发明的番茄植物的近亲交配和加倍单倍体。
[0067] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的具有突变tghVI等位基因的番茄植物， 并且所述番茄植物通过从适当的来源引入（通过常规育种，或遗传修饰，特别地通过同源 转基因技术或异源转基因技术）来获得所述等位基因。同源转基因技术是利用编码（农业） 性状的天然基因对植物的遗传修饰，所述基因来自作物植物本身或来自两性相容的供体植 物。异源转基因技术是利用来自非可交配的物种的基因或合成基因对植物的遗传修饰。 [0068] 本发明还涉及本发明的植物的种质。种质由生物的所有遗传特征组成并且根据本 发明包含至少本发明的tghVI等位基因。种质可在育种程序中用于产生这样的番茄植物， 所述植物在接触后不存在来自植物的绿色营养部分的绿色染色或具有减少的绿色染色，和 /或不具有典型的番茄植物气味，和/或不存在来自植物的绿色营养部分的黄酮类化合物， 和/或具有减少的挥发性化合物，和/或不存在番茄VI型香毛簇的腺。
[0069] 本发明还涉及由本发明的植物产生的番茄果实。本发明还涉及包含所述番茄植物 的果实或其部分的食品。本发明还涉及以加工的形式存在的食品。
[0070] 在一个方面，本发明涉及用于产生包含tghVI等位基因的番茄植物的方法，包括
[0071] a)将包含突变tghVI等位基因的植物与另一种植物杂交：
[0072] b)将所得的Fl自交以获得F2代植物；
[0073] c)选择F2中包含tghVI等位基因的植物；
[0074] d)任选地进行另外的一轮或多轮自交或杂交，随后选择包含tghVI等位基因的植 物。
[0075] 很明显提供本发明的性状的亲本不一定是直接从保藏的种子生长而来的植物。亲 本还可以是从种子产生的后代植物或从通过其它方法鉴定具有本发明的性状的种子产生 的后代植物。
[0076] 在一个方面，本发明涉及用于产生包含tghVI等位基因的番茄植物的方法，包括
[0077] a)将包含导致VI型香毛簇的腺头部不存在的突变tghVI等位基因的植物与另一 种植物杂交；
[0078] b)任选地将所得的Fl代与优选的亲代回交；
[0079] c)在F2代中选择包含导致VI型香毛簇的腺头部不存在的tghVI等位基因的植 物；
[0080] d)任选地进行另外一轮或多轮自交或杂交，以及随后选择包含tghVI等位基因的 植物。
[0081] 本发明额外地提供了将另外的期望的性状引入包含tghVI等位基因的番茄植物 的方法，包括：
[0082] a)将包含tghVI等位基因的番茄植物（其代表性种子在保藏号NCMB41845下保 藏在NCMB)与包含另一期望的性状的第二番茄植物杂交以产生Fl后代；
[0083] b)选择包含tghVI等位基因和另一个期望的性状的Fl后代；
[0084] c)将选择的Fl后代与任一亲本杂交，以产生回交后代；
[0085] d)选择包含所述其它期望的性状和tghVI等位基因的回交后代；和
[0086] e)任选地连续重复步骤（C)和（d) -次或多次，以产生选择的第4代或更高代的 包含所述其它期望的性状和tghVI等位基因的回交后代。本发明包括通过该方法产生的番 茄植物。
[0087] 在所有这些方法中，利用上述SNP标志物，通过标志物分析适当地进行选择步骤。 可选地，还可或额外地基于上述表型特征的一个或多个特征进行选择。
[0088] 在一个实施方案中，在Fl代进行包含tghVI等位基因的植物的选择。在另一个方 面，在杂交或可选择地回交的F2代开始本发明的性状的选择。通过标志物适当地在Fl代 中进行选择。还可基于表型在F2代中进行选择。
[0089] 在一个实施方案中，在F3代或更晚代开始包含tghVI等位基因的植物的选择。
[0090] 在一个实施方案中，包含突变tghVI等位基因的植物是近交系、杂种、加倍单倍体 或分离群体的植物。
[0091] 本发明还提供了使用加倍单倍体产生技术产生包含tghVI等位基因的番茄植物 的方法，所述技术产生包含所述突变tghVI等位基因的加倍单倍体品系，所述等位基因导 致VI型香毛簇的腺头部不存在、黄酮类化合物和挥发物的组成的改变、绿色染色的不存在 和/或典型番爺植物气味的不存在。
[0092] 本发明还涉及杂交种子和用于产生杂交种子的方法，包括将第一亲本植物与第二 亲本植物杂交，和收获所得的杂交种子，其中所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植物 是本发明所述的植物。
[0093] 在一个实施方案中，本发明涉及用于产生杂交番茄植物的方法，包括将第一亲本 番茄植物与第二亲本番茄植物杂交和收获所得的杂交番茄种子，其中第一亲本番茄植物和 /或第二亲本番茄植物包含突变tghVI等位基因。
[0094] 本发明还涉及用于产生这样的番茄植物（通过使用在其基因组中包含突变tghVI 等位基因的种子以生长所述番茄植物）的方法，所述番茄植物包含黄酮类化合物和挥发物 的组成的改变、VI型香毛簇的腺头部的不存在，绿色染色的不存在，和/或典型的番茄植物 气味的不存在。种子适当地是其代表性样品在保藏号NCMB41845下保藏于NCMB的种子。
[0095] 本发明还涉及用于种子产生的方法，包括从其代表性样品在保藏号NCMB41845 下保藏于NCMB的种子生长番茄植物，使植物产生种子，和收获这些种子。通过杂交或自交 适当地进行种子的产生。
[0096] 在一个实施方案中，本发明涉及通过使用组织培养产生包含突变tghVI等位基因 的番茄植物的方法。本发明还涉及通过使用营养生殖产生包含突变tghVI等位基因的番茄 植物的方法。
[0097] 在一个实施方案中，本发明涉及通过使用遗传修饰的方法以将突变tghVI等 位基因种质渗入番茄植物，来产生包含突变tghVI等位基因的番茄植物的方法。遗传 修饰包括使用来自非可交配的物种的基因或合成基因的转基因修饰或异源转基因技术 (transgenesis)，和使用来自作物植物本身或来自两性相容的供体植物的编码（农业）性 状的天然基因的同源转基因修饰或同源转基因技术（cisgenesis)。
[0098] 本发明还涉及用于产生番茄植物的育种方法，所述番茄植物包含黄酮类化合物和 挥发物的组成的变化、VI型香毛簇的腺头部的不存在、绿色染色的不存在和/或典型的番 茄气味的不存在或所述气味的显著减少，其中使用包含突变tghVI等位基因的种质。包含 突变tghVI等位基因并代表所述种质的所述植物的代表性种子在保藏号NCIMB41845下保 藏于NCMB。
[0099] 在其它实施方案中，本发明涉及用于产生包含突变tghVI等位基因的番茄植物的 方法，其中包含突变tghVI等位基因的植物的后代或繁殖材料用作将突变tghVI等位基因 种质渗入另一种番茄植物的来源。所述包含突变tghVI等位基因的植物的代表性种子在保 藏号NCMB41845下保藏于NCMB。
[0100] 本发明优选提供这样的番茄植物，所述植物显示黄酮类化合物和挥发物的组成的 变化，VI型香毛簇的腺头部的不存在，绿色染色的不存在和/或典型的番茄植物气味的不 存在或所述气味的显著减少，所述植物可通过本文中描述的任何方法获得。
[0101] 突变等位基因可通过使用分子标志物来鉴定。突变等位基因可选择地可通过遗传 图谱上的位置，或通过连锁群或染色体上的位置的指示来鉴定。当突变等位基因不再与特 定分子标志物连锁，但其在染色体上的位置（如在遗传图谱中确定的）未改变时，该突变等 位基因仍然与当其与分子标志物连锁时相同。其赋予的遗传性状因而也仍然相同。
[0102] '遗传性状'是由突变tghVI等位基因赋予的性状或特征。遗传性状可以例如通过 进行目视观察或生物化学分析来在表型上进行鉴定。然而，不能进行表型测定的植物阶段 同样地也具有导致遗传性状的遗传信息。可使用'性状'或'表型性状'替代'遗传性状'。
[0103] 在分子标志物不存在的情况下，可通过等位性试验来测定突变tghVI等位基因的 等同物。为了进行等位性试验，将对于tghVI等位基因是纯合的材料与对于待测试的突变 等位基因是纯合的材料杂交。当在杂交的F2代中不存在待观察的性状的分离时，未知的突 变等位基因被证明与tghVI等位基因相同。
[0104] 遗传图谱可根据籍以装配它们的方法而变化。本领域技术人员已知比较和组合 遗传图谱的方法，通过所述方法可消除遗传图谱之间的差异或使所述差异最小化。来自 一个遗传图谱的信息从而可被转移至另一个遗传图谱或转变为另一个遗传谱图。如本文 中所用的位置是基于番茄基因组SL2. 30的公共物理图谱（2010年8月的版本，http:// solgenomics.net/organism/solanum_lycopersicum/genome)的物理位置。
[0105] 保藏
[0106] 包含本发明的突变tghVI等位基因的番茄11R-5000的种子于2011年6月13 日在保藏登录号 NCIMB41845 下被保藏在 NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB219YA, UK。
[0107] 附图
[0108] 图 I :VI 型香毛族番爺（Kang 等人 J. Exp. Bot61 (4), 1053-1064, detail Suppl. Material, (2010))
[0109] 图2:A:具有腺头部的野生型TR306-1VI型香毛簇。B:不具有腺头部的突变体 3432-1VI型香毛簇。
[0110] 图3:2011年本发明的植物（Toll/013)相较于正常野生型番茄植物 (Toll/012，Toll/014-019)的各种萜类的测量；n. d.=未被检测到的
[0111] 图4:2011年本发明的植物（Toll/013)相较于正常野生型番茄植物 (Toll/012，Toll/014-019)的各种倍半萜类的测量；n. d.=未被检测到的
[0112] 图5:2011年本发明的植物（Toll/013)相较于正常野生型番茄植物 (Toll/012，Toll/014-019)的各种醛类的测量；n. d.=未被检测到的
[0113] 图6:番茄染色颗粒的吸光度。图例中登记的顺序是从上至下的曲线的顺序。
[0114] 图7:酰基糖测量。以nmol/cm2叶盘给出葡萄糖的结果。
[0115] 图8:2012年本发明的植物（Το12/136, 137)相较于同基因植物（Tol2/135)、正常 野生型番茄植物和LA0259 (hi突变体）的各种萜类的测量；n. d.=未被检测到的
[0116] 图9:2012年本发明的植物（Το12/136, 137)相较于同基因植物（Tol2/135)、正常 野生型番茄植物和LA0259 (hi突变体）的各种倍半萜类的测量；n. d.=未被检测到的
[0117] 图10:2012年本发明的植物（Το12/136, 137)相较于同基因植物（Tol2/135)、正常 野生型番茄植物和LA0259 (hi突变体）的各种醛类的测量；n. d.=未被检测到的
[0118] 图11:图3与图8的组合数据
[0119] 图12:图4与图9的组合数据
[0120] 图13:图5与图10的组合数据
[0121] 图14:醛类测量数据的不平衡AN0VA。
[0122] 在下列实施例中将进一步举例说明本发明。 实施例
[0123] 实施例1
[0124] 本发明的番茄植物的产生
[0125] 通过在室温在24小时期间，将约10. 000粒种子浸入0. 5% (w/v) ems (乙基甲磺 酸）的充气溶液来利用ems处理两个番茄育种品系TR306和T029的种子。
[0126] 将处理的种子萌发，并且将所得的植物生长在温室中以产生M2种子。
[0127] 成熟后，收获M2种子，将其混合在一个库中。将所得的M2种子库用作鉴定个别M2 植物的起始材料，所述M2植物在与绿色营养植物部分接触后不存在绿色染色。
[0128] 遗传修饰法的效率通过测定漂白的植物的发生来进行评估，所述漂白的植物的发 生表明因直接或间接参与叶绿素的形成或积累的基因的修饰而导致的叶绿素丢失。
[0129] 实施例2
[0130] 本发明的植物的表型鉴定
[0131] 在土壤中萌发M2番茄种子，使其生长至小植株。随后，将约7000株随机选择的植 物转移以进行幼苗筛选。
[0132] 触摸植物以确定在接触后绿色营养部分是否会在皮肤上留下微黄色或绿色的物 质。鉴定出3株在接触后不留下绿色染色的突变植物。此外，还观察到突变植物未发出番茄 植物的典型的香气。产生该性状的突变植物具有标识码M2-2517、M2-4416和M2-T029-mut。 繁殖来自M2-2517的种子，导致群体11R-5000,将其在保藏号NCMB41845下保藏于NCMB。
[0133] 通过使用双目镜目视观察突变植物的绿色植物部分，将其与正常野生型（WT)番 茄植物相比较。显微镜观察显示由4个腺细胞组成的VI型香毛簇的腺头部不存在于突变 番茄植物的腺中。因此得出VI型腺的不存在与绿色染色的不存在之间存在联系。
[0134] 实施例3
[0135] 本发明的性状至其它番茄植物的转移
[0136] 将本发明的植物与不具有本发明的性状的野生型（WT)番茄植物杂交。来自该杂 交的所得的Fl代具有与WT植物相同的表型，即其在建立接触后确实显示绿色染色。当观 察香毛簇时，发现Fl代具有正常的VI型香毛簇，具有形成腺头部的4个腺细胞。
[0137] F2代以对应于本发明的性状的单基因隐性遗传的方式分离。绿色染色的不存在 和VI型香毛簇的4个腺细胞的不存在以相同的方式分离并且两个方面总是在相同的植物 中被一起观察到，这表明两个方面存在共分离。
[0138] 可通过将野生型植物与本发明的植物杂交，和在该杂交的F2代中选择期望的表 型（通过针对绿色染色的不存在的选择或通过针对VI型香毛簇的4个腺细胞的不存在的 选择）来将本发明的性状引入野生型番茄植物。
[0139] 实施例4
[0140] 遗传作图和标志物开发
[0141] 利用800个SNP标志物将将一群90株F2代植物（如从实施例3获得的）进行基 因分型。这些SNP标志物中的329个是可靠多态性的并且用于进行针对绿色染色的不存在 的QTL分析。如对于单基因性状所预期的，一个突变等位基因位于、被定位于染色体9上。 QTL作图导致将突变等位基因定位在公共SL2. 30图谱上的大致2454946bp的物理位置上， LOD分数为41。对于该位置，突变等位基因解释了 88%的性状方差，这确认了单基因性质。
[0142] 与突变等位基因最密切相关的SNP标志物在染色体9上位于番茄基因组的公共 SL2. 30图谱上的1750800bp上，其中SNP是从A至G的核苷酸变化。该分子标志物可用于 鉴定突变等位基因在从在NCMB号41845下保藏的种子生长成的植物中的存在。
[0143] 新型突变等位基因被临时命名为tghVI (番茄无腺毛VI型）。包含相同的本发明 的突变tghVI等位基因的其它植物也可能与公共SL2. 30图谱的位置1750800bp上的A/G SNP相关，但还可任选地与另一个分子SNP标志物或在某一群体中是多态性的任何其它分 子标志物相关。
[0144] 实施例5
[0145] 本发明的植物的挥发物分析
[0146] 分析本发明的植物的大量挥发物，并将其与不包含本发明的突变tghVI等位基因 的番茄植物相比较。将待测量的番茄植物置于塑料袋中进行10分钟。随后，触摸植物以使 待分析的相关化合物释放。随后，通过在室温将纤维材料引入塑料袋并暴露于内部的空气 15分钟来进行固相微萃取（SPME)。
[0147] 在挥发物的热解吸后，通过使用偶联至质谱法的气相色谱法（GC-MS)分析3组化 合物：萜类、倍半萜类和醛类。值得注意地，对于这些组内的所有挥发物，发现它们相较于 野生型植物显著减少（图3-14)。一些挥发物甚至低于检测水平，从而被认为不存在。
[0148] 实施例6
[0149] 染色颗粒的吸光度
[0150] 分析了许多番茄植物的绿色染色。包括的是本发明的植物、不存在本发明的突变 等位基因的同基因植物、野生型（正常）番茄植物以及来自本领域的包含hi (无毛）突变 等位基因的植物（图6)。
[0151] 在播种后约7-8周分析植物。将金属软膏刀用于在实验中沿着每一株植物的茎擦 拭，从而覆盖约75cm 2的表面积。将所得的存在于软膏刀上的物质溶解在I. Oml乙醇中。在 干燥软膏刀后，对于每一株植物在覆盖整个茎表面的不同位置上重复该方法数次。
[0152] 将来自单株植物的提取物以13000rpm离心5分钟来除去碎片，随后用等体积的乙 醇稀释每一个提取物。将UV-Vis分光光度计用于测量溶液的吸光度。
[0153] 虽然在不属于本发明的的植物的峰的高度上存在差异，但所有植物都在约360nm 的相同波长上显示最大吸光度，这表明相同的色素类型。该波长上的吸光度表明色素属于 黄酮类化合物的种类。
[0154] 存在不同种类的黄酮类化合物，其通常在两个不同的波长范围显示最大吸光度， 由此确切的峰取决于结合于黄酮类化合物基本结构的取代基的数目和类型。第一吸收峰约 在210与290nm之间，其不在光谱的可见部分中。第二吸收峰可在300至400nm的范围内， 或甚至达到500nm，其部分地（从约380nm)存在于光谱的可见部分中。对于本发明的植物， 在360nm处测量的吸光度不高于0. 05的检测阈值（表1，图6)。
[0155] 表 1
[0156]
【权利要求】
1. 一种番爺植物（Solanum lycopersicum L.)，其特征在于： -所述植物不包含VI型香毛簇的腺细胞或具有至少显著减少的数目的所述腺细胞， -所述植物在接触后不引起绿色染色或绿色染色至少显著减少， -所述植物具有显著降低的水平的挥发物，特别是萜类、倍半萜类和醛类， -所述植物不具有典型的番爺气味或典型的番爺气味至少显著减少，和 -所述植物不包含黄酮类化合物或具有至少显著降低的水平的黄酮类化合物。
2. 权利要求1中所述的番茄植物，所述植物具有如存在于其代表性样品在登录号 NCMB41845下被保藏的种子的基因组中的突变tghVI等位基因，所述等位基因导致权利要 求1中定义的特征中的一个或多个，优选全部特征。
3. 权利要求2中所述的番茄植物，其中在其代表性样品在登录号NCIMB41845下被保藏 的种子的基因组中，突变tghVI等位基因与公共物理图谱SL2. 30的位置1750800上的分子 SNP标志物连锁，其中所述SNP为从A至G的核苷酸变化。
4. 权利要求1-3的任一项中所述的番茄植物，其能通过将来自从其代表性样品在登 录号NCMB41845下被保藏的种子生长而来的植物的突变tghVI等位基因种质渗入不具有 所述等位基因的植物来获得，其中所述植物已获得权利要求1中定义的特征中的一个或多 个，优选全部特征。
5. 番爺种子，其能生长成如权利要求1-4的任一项中所述的番爺植物。
6. 权利要求1-4的任一项中所述的番茄植物的种子，其中所述种子包含至少一个突变 tghVI等位基因，但优选对于所述突变tghVI等位基因是纯合的。
7. 权利要求1-4的任一项中所述的番茄植物的后代或权利要求5或6中所述的番茄 种子的后代，其中后代植物包含至少一个突变tghVI等位基因，但优选对于所述突变tghVI 等位基因是纯合的。
8. -种繁殖材料，其适合用于产生权利要求1-4和7的任一项中所述的植物或权利要 求5或6中所述的种子，其中所述繁殖材料适合用于有性生殖，并且具体地选自小孢子、花 粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞，或适合用于营养繁殖，并且具体地选自插枝、根、茎、细胞、原 生质体，或适合用于可再生细胞的组织培养，并且具体地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分 生细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎，其中从所述繁殖材料产生的植物包含至少一个突变 tghVI等位基因，但优选对于所述突变tghVI等位基因是纯合的。
9. 权利要求7中所述的番茄植物，其特征在于权利要求1中定义的特征中的一个或多 个，优选全部特征。
10. 权利要求1-4和7的任一项中所述的植物的番茄果实。
11. 一种食品，其包含权利要求10中所述的番茄果实或其部分，其任选地为加工的形 式。
12. 权利要求1_4、7和9的任一项中所述的番爺植物或从权利要求5或6的种子或从 权利要求8中所述的繁殖材料产生的植物在育种程序中用作种质的用途，用于产生包含突 变tghVI等位基因并且特征在于权利要求1中定义的特征中的一个或多个，优选全部特征 的番茄植物。
13. 突变tghVI等位基因用于产生番茄植物的用途，所述番茄植物的特征在于权利要 求1中定义的特征中的一个或多个，优选全部特征。
14.位于公共物理图谱SL2. 30的位置1750800上的分子标志物用于产生番茄植物的用 途，所述番茄植物包含突变tghVI等位基因并且特征在于权利要求1中定义的特征中的一 个或多个，优选全部特征，其中所述标志物为包括从A至G的核苷酸变化的SNP标志物。
【文档编号】A01H5/08GK104334010SQ201380005397
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年2月7日 优先权日:2012年2月7日
【发明者】R·韦尔霍夫, D·B·德拉戈尔, A·沃格拉尔, Z·O·万赫维伊恩 申请人:瑞克斯旺种苗集团公司