用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程，具体公开了一种用于剔除标记基因的CPP5-Cre融合蛋白及其应用，所述CPP5-Cre融合蛋白包括短的5氨基酸细胞穿膜肽CPP5（KLPVM）和位点特异重组酶Cre蛋白。利用表达纯化后的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞孵育后，获得筛选标记基因剔除的阳性克隆后进行体细胞克隆，获得F0代的筛选标记基因剔除的转基因猪。
【专利说明】用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程，具体地说，涉及一种用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]动物转基因技术是在经典遗传学、分子遗传学和DNA重组技术的基础上，运用基因工程等技术手段，将感兴趣的外源目的基因或重组基因稳定整合于宿主动物的染色体基因组并稳定遗传给后代的一种新兴生物技术。最早于1976年由Jaenisch首先利用逆转录病毒感染小鼠早期胚胎首次得到莫氏白血病病毒转基因小鼠。随着新技术新方法的出现，动物转基因技术也在不断的完善之中。利用传统的转基因方法，如显微注射法、精子载体法、电穿孔法、体细胞克隆法等，已经制备了转基因小鼠、大鼠、猪、牛、羊、鸡等多种转基因动物。而且由于猪于人类具有大量相似的解剖、生理、代谢、病理。例如，他们有一个非常相似的胃肠道解剖和功能、胰腺形态和代谢调节。因此猪比小鼠更适合用于人类疾病模型研究，同时猪肉又是人类主要的营养来源。伴随着ZNF/TALEN/Cas9等最新技术的出现，使得转基因大动物具有更加广阔的应用前景，如制备动物生物反应器、提高畜禽生产能力及肉奶品质、培育抗病动物、生产人类用动物器官、建立人类疾病模型等，将给人类带来巨大的经济效益。在我国，主要畜牧类品种则严重依赖于进口，在主要的畜牧类品种中，奶牛品种依赖程度达100%，猪、鸡品种依赖程度接近90%，这意味着作为动物农业整个产业链源头的畜牧类品种，严重依赖于国际市场。因此转基因技术提高迫切需要。目前最大限制转基因技术发展的障碍是筛选标记基因的存在。因为在转基因过程中，除了表达目的基因外，还需要筛选标记基因。标记基因即选择性标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞(或个体)从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。由于转基因效率低，因此必须利用标记基因对阳性克隆进行筛选和富集。但标记基因的存在不仅对邻近基因及其目的基因表达产生影响，同时还将带来严重的安全性问题。目前虽然有一些技术可以去除筛选标记基因，但是这些方法主要用于小鼠，而且有很大缺陷。例如通过瞬时表达Cre重组酶载体，需要额外的细胞转染过程，而且存在整合隐患和细胞毒性。在大动物的研究很少，2009年，本课题组利用体外转录mRNA瞬时表达Cre酶，获得标记基因敲除的转基因牛。目前为止，还没有对猪进行筛选标记基因即(marker free)的相关研究。因此建立简便、高效、快速标记基因敲除的转基因猪技术研究显得尤为重要。
【发明内容】
[0003]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用。
[0004]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于剔除标记基因的CPP5_Cre融合蛋白，所述融合蛋白包括细胞穿膜肽CPP5和位点特异重组酶Cre蛋白，所述细胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。[0005]进一步地，所述融合蛋白的氣基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所不。
[0006]本发明还提供了一种表达前述CPP5_Cre融合蛋白的载体。
[0007]本发明还提供了一种剔除转基因猪筛选标记基因的方法，所述方法包括以下步骤:
[0008]1)构建CPP5_Cre原核表达载体；
[0009]2)利用步骤1)表达载体进行CPP5_Cre融合蛋白的表达及纯化；
[0010]3)将步骤2)得到的CPP5_Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪体细胞共培养；
[0011]4)鉴定筛选标记基因剔除的阳性克隆；
[0012]5)通过体细胞克隆获得H)代，筛选标记基因剔除的转基因猪个体。
[0013]进一步地，所述步骤I)将含有CPP5序列及其NcoI和NdeI两个酶切位点的引物对，通过体外做成linker ;用Ncol+Ndel酶双切pET28.2-Cre,回收得到目的片段与linker连接，转化、摇菌、小提质粒、酶切鉴定阳性的PCPP5-CRE载体；所述pCPP5-CRE载体的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0014]进一步地，所述步骤3)将步骤2)得到的CPP5_Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞，进行孵育共培养获得克隆。
[0015]进一步地，所述步骤5)将步骤4)筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆获得H)代筛选标记基因剔除的转基因阳性猪。
[0016]本发明进一步提供了前述CPP5_Cre融合蛋白和表达该融合蛋白的载体在生产筛选标记基因剔除的转基因猪中的应用。
[0017]本发明的有益效果在于:本发明提供了简便、高效、快速的去除转基因猪筛选标记基因方法即marker free。其原理是利用短的5氨基酸的细胞穿膜肽和位点特异重组酶Cre/1xP系统构建融合的蛋白使其具有穿膜、入核、剪切marker gene的功能。而且只要将纯化出的蛋白与带有marker gene的猪成纤维细胞孵育3h后，共培养获得克隆，然后进行PCR鉴定，将阳性克隆用于后期核移植，即可在H)代获得marker free的转基因猪。
[0018]本发明解决了猪标记基因敲除的技术问题，对于大动物转基因未来的应用及其基础研究打下重要的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明含有短细胞穿梭肽和Cre酶的融合蛋白表达载体图；
[0020]图2为本发明CPP5_Cre蛋白纯化图；
[0021]图3为本发明蛋白处理后获得阳性克隆PCR鉴定结果；
[0022]图4为本发明marker free阳性H)代猪PCR检测结果；
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024]实施例中载体设计由本课题组完成，序列测定由北京华大基因完成。Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均购自北京NEB公司，体细胞克隆所用试剂均购自Sigma公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增、原核表达及其纯化等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。实施例I含有短细胞穿梭肽和Cre酶的融合蛋白表达载体图
[0025]将5氨基酸短肽CPP5构建到ρΕΤ28.2_Cre原核表达载体(addegene公司提供)中。
[0026]首先通过生工公司合成I对引物，引物中含有CPP5序列及其NcoI和NdeI两个酶切位点:
[0027]Up:catgggcAAACTGCCGGTTATGggcca ；
[0028]Down:tatggccCATAACCGGCAGTTTgcc。
[0029]然后通过体外做成linker, 50体系:引物各22.5 μ 1、5μ I的IOxbufferPCR0 99度变性5分钟室温复性10分钟，4度保存用于后面实验。
[0030]用Ncol+Ndel 酶双切 pET28.2_Cre，体系为 50μ1:载体 2μ1、酶各 2μ1、10xbuffer4加5μ 1、无菌水31 μ 1，37度酶切2h，跑胶回收得到6319bp的目的片段；将上述回收的片段和linker连接，体系10 μ 1:回收片段7 μ 1、大linker I μ I>IOxbuffer加I μ 1、Τ4连接酶I μ 1，16度过夜连接。
[0031 ] 转化、摇菌、小提质粒、酶切鉴定阳性的pCPP5-CRE载体(核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示)，备用。
[0032]实施例2 CPP5-Cre蛋白纯化图
[0033]1.CPP5-Cre 的原核表达 [0034]I)将含有表达载体的BL21菌接种到5ml的培养基中，37°C过夜培养；
[0035]2) 1:100转接至500ml的培养基中，37°C培养2.5h ；
[0036]3)加入 IPTG 至终浓度 0.2mM, 16°C诱导 16h。
[0037]2.N1-Nta 柱纯化
[0038]I)集菌，加入培养基体积1/10的solutionA，重悬并超声破碎细胞；
[0039]2) 13000g离心10min,上清液用0.45 μ m的滤膜过滤；
[0040]3) Ni柱用5倍体积的milli Q水洗潘，再用5倍体积的solutionA平衡；
[0041]4)上样；
[0042]5)样品全部流完后，用8倍体积的solutionA冲洗柱子；
[0043]6)8倍体积solutionA+洗漆柱子；
[0044]7)用3倍体积的solution B将蛋白从柱子上洗漆下来；
[0045]8)用超滤柱将蛋白置换到10%甘油的DMEM中。
[0046]3.去内毒素
[0047]I)将Iml去内毒素凝胶加入柱床中，自然沉降；
[0048]2 )用5倍体积的0.2N NaOH洗涤凝胶并过夜浸泡；
[0049]3)用5倍体积的NaCl洗涤柱床；
[0050]4 ) 5倍体积Mi 11 iQ水洗涤柱床；
[0051 ] 5 )用5倍体积10%甘油DMEM洗涤柱床；
[0052]6)上样，收集流出液；
[0053]7)用2倍体积10%甘油DMEM洗涤柱床，收集流出液；
[0054]8)步骤3.2到3.4步骤再生柱床，蛋白测定浓度后分装及冻在_80°C保存。
[0055]实施例3蛋白处理后获得阳性克隆PCR鉴定结果
[0056]1、长白胎儿成纤维细胞建立[0057]I)取妊娠30d的长白猪，处死后取输卵管子宫、包扎出口、2h内运回实验室。
[0058]从子宫内取出胎儿，用含抗生素的DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用眼科剪去除胎儿头部、四肢、内脏、用DPBS冲洗。
[0059]2)在直径IOOmm细胞培养皿内用眼科剪将剩余部分尽量剪碎。
[0060]3)加入少许血清，将Iml枪头尖端用剪刀剪断，留下直径约为40mm以上部分，接上Iml枪，将组织块转移到3个T25细胞培养瓶的底壁，用弯头吸管将组织块均匀铺开。
[0061]4)将铺有组织块的一面向上，各加入5ml细胞培养液，放入CO2培养箱，39°C、5%C02、100%湿度培养。
[0062]5)待培养6_8h后，将铺有组织块的一面翻转，使细胞培养液浸没组织块。
[0063]6)培养5天左右观察组织块周围是否有细胞爬出。
[0064]7)待细胞生长至80%汇合时，进行传代培养或进行冷冻保存。
[0065]2、重组蛋白与成纤维细胞孵育然后培养出克隆
[0066]将实施例2中表达的CPP5_Cre重组蛋白与长白胎儿成纤维细胞孵育培养。将5um-10um浓度的CPP5_Cre蛋白加入，常规培养猪成纤维细胞的培养基中，然后进行细胞培养，作用3-24小时后，PBS清洗然后换不含CPP5-Cre重组蛋白的细胞培养基，然后进行单细胞培养2周后获得克隆，用于后面PCR鉴定。
[0067]3、蛋白去除marker gene后阳性克隆PCR鉴定
[0068]将上面获得的克隆部分细胞冻存、部分细胞细胞提取基因组进行PCR鉴定(PCR分子鉴定图如图3-A所示)，鉴定原单敲猪原代细胞用Ml和M2两个引物扩增会扩出2374bp和1102bp两个片段，当标记基因删除后，再用Ml和M2两个引物扩增会扩出664bp和1102bp两个片段，当PCR扩增过程中，延伸时间设为45s的时候，扩不2374bp条带。出图3-B显示PCR扩增结果，其中2、4、5、7、9、11、12、14、15、17和18扩增除664bp和1102bp条带，证明是标记基因删除的阳性克隆，)，用于后续克隆实验。
[0069]实施例4marker free阳性FO代猪PCR检测结果
[0070]1、猪卵母细胞体外成熟
[0071]从屠宰场取卵巢，放入28°C _35°C，含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，2h内运回实验室用配有18号针头的20mL注射器抽吸卵巢上3-6mm的卵泡。将抽取液放于50mL离心管中，37°C水浴静置15min去上清，加入PVA-TL-HEPES重悬沉淀，再静置15min，重复一次，将重悬液放入直径60_的塑料培养皿中，在体式显微镜下，用口吸管挑选卵丘包裹2层以上，致密，而且胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(Cumy Lus-Oocyte-complexes,COCs)，用成熟培养液洗涤3遍转入在培养箱中至少已经平衡4h的培养液滴内(每100 μ L液滴放25枚)。每一直径35mm的塑料培养皿中做4个液滴，用胚胎级矿物油覆盖。将COCs先在成熟培养液中培养20±2h，然后转移到无hCG以及eCG的成熟液中继续培养20±2h。
[0072]2、体细胞准备
[0073]利用血清饥饿法，将实施例3中获得的打靶阳性细胞待其生长至80%汇合时，进行血清饥饿处理，即把培养液中的FBS (Gibco, Life Technologies)浓度从20%降至0.5%继续培养2-5d，按常规方法消化，离心洗涤，最后加ImL显微操作液重悬细胞沉淀备用。
[0074]3、受体卵母细胞去核及供体细胞核移植
[0075] 利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核，即成熟40_44h猪卵母细胞，脱卵丘后选择胞质均匀，卵周隙清晰，胞膜完整的卵母细胞放入无Ca2+、Mg2+、HEPES缓冲NCSU-23备用转移到显微操作液滴内:核移植前Ih做好，直径60mm细胞培养皿盖中央(液滴50-80 μ l，2-3mm宽，8-10mm长，石蜡油覆盖)，作用15_30min，把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入其中于39%、5%C02、100%湿度平衡15min，安装显微固定管以及去核/注射针，调节好操作系统位置，在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜下，40X用固定管(内径25-35 μ m，外径100-120 μ m)吸持卵母细胞用内径15-25 μ m的去核/注射针拨动卵母细胞，使第一极体处于钟表1点钟位置200 X下，从钟表3点处将去核/注射针刺过透明带，吸出第一极体及其附近少许细胞质退出去核/注射针，将第一极体以及少许胞质吐出挑选直径15-20 μ m，折光性强，圆形，光滑的体细胞，200 X下用去核/注射针吸取一个供体细胞，从去核进针处将体细胞注射到透明带下的卵周隙内用注射针点压透明带，使供体细胞与受体卵胞质的细胞膜彼此紧密接触每批25-30个卵母细胞，构建完成后，结束后将供体细胞-卵胞质构成的细胞对(重构卵)转移到NCSU-23+4mg/ml BSA中，39°C、5%C02、100%湿度培养箱中修复l_2h。
[0076]4、融合与激活
[0077]将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，用融合/激活液洗涤3遍后，每批5个放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉制的且尖端很细的实心玻璃针拨动重组卵，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行用ECM2001融合仪施加一个30 μ s，2.0kv/cm的直流电脉冲诱导融合同时激活，用NCSU-23%+4mg/ml BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中、39°C、5%C02、100%湿度培养0.5h~Ih后取出，在体视显微镜下判定融合。
[0078]5、胚胎培养
[0079]在开始显微操作前至少4h预先做好培养液滴，在超净台内取35mm细菌培养皿，做6-8个30 μ L大的液 滴，小心加入2.5-3ml矿物油覆盖，做好标记后放入CO2培养箱内平衡将上述融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后转入，每个30 μ L的液滴培养8-10个重构胚，培养48h和168h时记录卵裂和囊胚形成结果。
[0080]6、胚胎移植
[0081]用公猪试情或者观察压背反应，挑选自然发情母猪，一般在构建克隆胚的当天将在CO2培养箱中培养12-30h的1-2细胞克隆胚取出，装入2.5ml细管内。用灭菌的锡箔纸包装好，做好标记，放到恒温运输箱中运到猪移植地点，用40-60ml( lmg/100kg体重)生理盐水溶解1-1.5mg硫喷妥钠和地西泮，耳静脉注射20ml，待受体猪初步麻倒后，将其抬到手术架上仰卧(青年后备母猪)或者侧卧(经产母猪)保定对后备母猪:在腹部下面第I对和第2对乳头之间，腹中线局部15X10cm2面积内清洁刮毛后先碘酒消毒，后酒精棉脱碘(对经产母猪:在腹部肷窝部15 X IOcm2的范围内清洁，刮毛碘酒消毒后酒精脱碘)在准备动刀切开腹中线之前，把前面余下的麻醉药再酌情注射20-30ml，沿腹中线切开一个长约8-10cm的口，打开腹腔，探进去一只手，取出卵巢后用润湿的灭菌脱脂纱布盖上(而对经产母猪:沿侧腹部做一个与腹中线面垂直的长约IOcm的切口)在手术人员即将取出卵巢，调整好输卵管伞之际，将装在吸管内的胚胎取出放在热台上，体视显微镜下将胚胎装入移植管内，手术人员和胚胎移植人员相互协调，将移植管从输卵管伞部探入输卵管至少5cm大致到了壶腹-峡部结合处，一边推动注射器，以便外撤移植管移植后体视镜下观察胚胎是否仍滞留在移植管内，确认没有后，开始卵巢回位，术口缝合胚胎移植后第IOd肌肉注射800IUhCG，13d注射500IU PMSG。[0082]7、囊胚细胞计数
[0083]取出重构胚囊胚，在含3.7%多聚甲醛的DPBS中洗涤3遍后再固定IOmin将固定后的囊胚转移到含10 μ g/ml Hoechst33342 (bisbenzimide)的DPBS中避光的暗盒中室温孵育IOmin染色结束后，将囊胚转移到载玻片上，尽量少带液体，尽快用9:1的凡士林/石蜡油在其四角点四个柱，盖上盖玻片，在实体显微镜下小心按压盖玻片，使卵受压后稍微膨大但不至于破碎为宜，用指甲油封片，NikonESOO显微镜，紫外光激发下观察、照相、计数。
[0084]实施例5R)代公猪阳性鉴定
[0085]FO代猪组织基因组DNA的提取:
[0086]将猪场出生的公猪(来源于实施例3中的阳性细胞克隆)取少量尾巴组织块，剪碎或细胞沉淀放入1.5ml离心管中，加700 μ I DNA抽提缓冲液，20 μ I蛋白酶K (20mg/ml),混匀56°C水浴消化18h以上，直至组织块或细胞沉淀完全消失，间歇摇动以获得更好的效果,加入700 μ ITris-饱和酹,温和摇动12min, 12000 rpm离心12 min。将上层液相转移至另一新的离心管中，重复上一步骤，将上层液相转移至另一新的离心管中，加入700μ I酚:仿(1:1)，温和摇动12min, 12000rpm离心12min。将上层液相转移至另一新的离心管中,加Λ 700 μ I氯仿,温和摇动12 min, 12000rpm离心12 min。将上层液相转移至另一新的离心管中，加2倍体积无水乙醇，颠倒混匀后，12000rpm离心10 min。弃上清，用70%乙醇洗沉淀和管壁，倾弃乙醇，浙尽残液，室温下敞口放置20~30min，使乙醇完全挥发，加适量(约100 μ DTE缓冲液，于56°C水浴中溶解DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA浓度，测量260/280nm波长下检测基因组DNA的浓度和纯度，将其调整至适当浓度，_20°C保存，同时进行PCR鉴定打靶阳性公猪。进行琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，假如扩出SOObp和388bp条带的既为marker free阳性,如果只扩出800bp为野生型或者单敲没有去处markergene的个体，检测结果如 图4所示，其中其中1_12号12头H)代猪都为marker free成功个体，其中WT即野生型和+/_单敲的为对照。
[0087]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种用于剔除标记基因的CPP5-Cre融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括细胞穿膜肽CPP5和位点特异重组酶Cre蛋白，所述细胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQID N0.1 所示。
2.根据权利要求1所述的CPP5-Cre融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.表达权利要求1或2所述CPP5-Cre融合蛋白的载体。
4.一种剔除转基因猪筛选标记基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:. 1)构建CPP5-Cre原核表达载体； .2)利用步骤I)表达载体进行CPP5-Cre融合蛋白的表达及纯化； . 3)将步骤2)得到的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪体细胞共培养； . 4)鉴定筛选标记基因剔除的阳性克隆； . 5)通过体细胞克隆获得H)代，筛选标记基因剔除的转基因猪个体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤I)将含有CPP5序列及其NcoI和NdeI两个酶切位点的引物对，通过体外做成linker ;用Ncol+Ndel酶双切pET_28.2CRE，回收得到目的片段与linker连接，转化、摇菌、小提质粒、酶切鉴定阳性的pCPP5-CRE载体；所述PCPP5-CRE载体的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)将步骤2)得到的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞，进行孵育共培养获得克隆。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤5)将步骤4)筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆获得H)代筛选标记基因剔除的转基因阳性猪。
8.权利要求1或2所述的CPP5-Cre融合蛋白在生产筛选标记基因剔除的转基因猪中的应用。
9.权利要求3所述的载体在生产筛选标记基因剔除的转基因猪中的应用。
【文档编号】A01K67/027GK103992409SQ201410158270
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】李宁, 孙照霖, 康倩倩, 李秋艳, 赵蕊, 孙永川 申请人:中国农业大学