一种棉花黄萎病防治菌剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种棉花黄萎病防治菌剂及其方法。本发明采用单因子试验筛选最佳表面活性剂、紫外防护剂、防腐剂和pH，并通过Box-Behnken设计和响应面法对其最佳配比进行优化。棉花黄萎病拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂中的最佳表面活性剂为吐温-20，防腐剂为尼泊金甲酯，紫外防护剂为山梨醇，调液体菌剂pH为7.8。拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂中各种助剂最佳配比为山梨醇0.375％、防腐剂尼泊金甲酯为0.1％、表面活性剂吐温-20为1％且pH为7.8。在此条件下，拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂中的活菌数最高为6.4×109cfu/mL。为开发棉花黄萎病拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂的商品性、简单性和有效性以及大规模生产奠定基础。
【专利说明】一种棉花黄萎病防治菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种棉花黄萎病防治菌剂及其制备方法，属于农业【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb)引起的一种真菌性病 害，也是棉花主要病害之一，其直接影响棉花质量，减少棉花产量，降低棉花经济效益，被称 为棉花的"癌症"。本世纪90年代以来，棉花黄萎病逐年加重，并造成巨大的经济损失。据 不完全统计，每年损失皮棉8万?10万吨。目前，棉农常用化学农药来防治棉花黄萎病，但 是化学农药不但影响人类健康还破坏生态环境，长期使用后还加强植物病原菌的耐药性。 近些年来，随着绿色农业、有机农业的兴起，利用生物防治棉花黄萎病备受人们关注。许多 学者研究发现细菌、真菌、放线菌都能很好的防治棉花黄萎病。生防细菌中芽孢杆菌是生防 细菌中研究最多的属。因为芽孢杆菌能产生热稳定的内生芽孢，繁殖速度快、抗逆能力强、 易定殖在植物表面，营养要求简单、并且对多种病原真菌、细菌均有较强的抑制作用，具有 广谱抗菌性，成为越来越受瞩目的生防研究材料之一。
[0003] 微生物生防菌剂，由于其有效成分是生物活体及其代谢物，为保证其在储存过程 中的稳定性，在田间条件下充分发挥作用，研制合理的剂型是非常必要的。从成本角度考 虑，利用全发酵液开发液体剂型为首选。
[0004] 阿萨尔基亚芽孢杆菌（Bacillus axarquiensis)是芽孢杆菌的一个种，具有繁殖 快、抗逆性强等特点，具有作为优势生防细菌的潜力。据文献调研，目前对B. axarquiensis 研究局限于其分类学方面，而对其生物活性方面未见相关报道。发明人研究发现其对棉花 黄萎病具有防治作用，活性成分为B. axarquiensis次生代谢产物，如用全发酵液为原料研 制剂型，不仅可降低成本，而且提高液体菌剂中活菌数量，为进一步开发生物活性奠定基 础。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种棉花黄萎病防治菌剂制备方法及其应 用。
[0006] 本发明开发棉花黄萎病防治菌剂利用的原料为棉花黄萎病拮抗菌 B. axarquiensis全发酵液，发酵液中出含有大量的拮抗菌外，还含有菌体分泌的蛋白（肽） 类物质，残留的碳源、氮源等营养物质。在助剂选择时应考虑添加下列助剂：（1)防腐剂，用 来保护发酵液，延长液体制剂贮藏期；（2)表面活性剂，在液体剂型中作为粘着剂，有利于 液体剂型的均匀、稀释；（3)紫外防护剂，可保护液体剂型中的活菌数，降低紫外线对其产 生的杀伤作用。（4) pH值，实验测出适于菌剂贮藏和发挥药效的pH值。
[0007] 在本发明中，通过单因素实验、Box-Behnken设计和响应面法对其各种助剂进行 筛选，并对其配比进行优化。本发明提供的棉花黄萎病防治菌剂，以棉花黄萎病拮抗菌 B. axarquiensis全发酵液为原料研制剂型，不仅可降低成本，降低成本，而且提高液体菌剂 中活菌数量。
[0008] 本发明提供的棉花黄萎病防治菌剂，主要成分为B. axarquiensis全发酵液，还含 有吐温-20、山梨醇、尼泊金甲酯、pH调节剂。
[0009] 作为一种优选，本发明提供的棉花黄萎病防治菌剂，吐温-20的体积浓度为1%。
[0010] 山梨醇的体积浓度为〇· 375%。
[0011] 尼泊金甲酯的体积浓度为〇. 1%。
[0012] 本发明的棉花黄萎病防治菌剂，pH为7. 8。
[0013] 上述棉花黄萎病防治菌剂的制备方法是：
[0014] 1)将在平板上NA培养基上生长良好的拮抗菌B. axarquiensis单菌落接种到 500mL培养液的三角瓶中（200mL)，于37°C、180r/min，振荡培养24h后，再按照5%的比例 接种到20mL NB培养液的三角瓶中（IOOmL)，于37°C、180r/min，振荡培养24h后制成种子 液，此过程得到B. axarquiensis种子液。
[0015] 2)将种子液接种于NB培养液中继续扩大培养，培养48h后得B. axarquiensis全 发酵液，向其全发酵液中添加1 %吐温-20表面活性剂、0. 375%山梨醇紫外防护剂、0. 1 % 尼泊金甲酯防腐剂以及调整液体菌剂的pH为7. 8,此过程得到B. axarquiensis液体菌剂。
[0016] 3)采用平板菌落计数法检测B. axarquiensis液体菌剂中活菌数量。
[0017] 小拮抗菌B. axarquiensis发酵液组和液体菌剂组对棉花黄萎病有一定生防效 果，其中发酵液组相对生防值为38. 04%?43. 07%，而液体菌剂组相对防效值为40. 29? 46. 23%。接种后130d，拮抗菌B. axarquiensis发酵液组对棉花黄萎病相对防效最大为 43. 07%，而液体菌剂组对棉花黄萎病相对防效最大为46. 23%。拮抗菌B. axarquiensis液 体菌剂组对棉花黄萎病相对防效优于B. axarquiensis发酵液组。
[0018] 总之，本发明B. axarquiensis液体菌剂对棉花黄萎病菌有防治作用，且防治效果 优于B. axarquiensis发酵液组。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为表面活性剂和紫外防护剂交互影响活菌数的等高线图（1-1)和响应曲面图 (1-2)。
[0020] 图2为表面活性剂和防腐剂交互影响活菌数的等高线图（2-1)和响应曲面图 (2-2)。
[0021] 图3为表面活性剂和pH值交互影响活菌数的等高线图（3-1)和响应曲面图 (3-2)。
[0022] 图4为紫外防护剂和防腐剂交互影响活菌数的等高线图（4-1)及响应曲面图 (4-2)。
[0023] 图5为紫外防护剂和pH值交互影响活菌数的等高线图（5-1)及响应曲面图 (5-2)。
[0024] 图6为防腐剂与pH值交互影响活菌数的等高线图（6-1)及响应曲面图（6-2)。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1 :拮抗菌B. axarquiensis种子悬液制备
[0026] 将在平板上NA培养基上生长良好的拮抗菌B. axarquiensis单菌落接种到500mL 培养液的三角瓶中（200mL)，于37°C、180r/min，振荡培养24h后，再按照5%的比例接种到 20mL NB培养液的三角瓶中（IOOmL)，于37°C、180r/min，振荡培养24h后制成种子液。 [0027] 实施例2 :菌剂活菌数的检测方法
[0028] 平板菌落计数法：用标准方法将待测样品稀释，然后取适宜的稀释度样品与固体 培养基混匀，凝固后培养，每一个活细胞就形成一个单菌落，然后计数平板上出现的菌落数 乘以样品稀释度，即可计算出样品的含菌数。注：本文中稀释倍数为1〇_ 4。
[0029] 实施例3 :剂型分散性检测方法
[0030] 将IOOmL待检样本一次性注入加有900mL标准硬水的烧杯中，均匀搅拌Imin静置 30min，用尺子量出没有悬浮或溶解的样品占总体积的百分比。用100%减去未悬浮或溶解 的样品百分比则得出该样品分散性。
[0031] 实施例4 :表面活性剂筛选
[0032] 按表1进行表面活性剂的筛选。以分散性好，活菌数多为筛选标准。
[0033] 表1齐麵表面活性剂的筛选
【权利要求】
1. 一种棉花黄萎病防治菌剂，主要成分为阿萨尔基亚芽孢杆菌全发酵液，还含有吐 温-20、山梨醇、尼泊金甲酯和pH调节剂。
2. 根据权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂，其特征在于，吐温-20的体积浓度为 1%。
3. 根据权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂，其特征在于，山梨醇的体积浓度为 0· 375%。
4. 根据权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂，其特征在于，尼泊金甲酯的体积浓度 为 0· 1%。
5. 根据权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂，其特征在于，菌剂pH为7. 8。
6. 权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将在平板上NA培养基上生长良好的拮抗菌B. axarquiensis单菌落接种到500mL培 养液的三角瓶中，于37°C、180r/min，振荡培养24h后，再按照5 %的比例接种到20mL NB培 养液的三角瓶中，于37°C、180r/min，振荡培养24h后制成种子液； 2) 将种子液接种于NB培养液中继续扩大培养，培养48h后得B. axarquiensis全发酵 液，向其全发酵液中添加1 %吐温-20表面活性剂、0. 375%山梨醇紫外防护剂、0. 1 %尼泊 金甲酯防腐剂以及调整液体菌剂的pH为7. 8。
【文档编号】A01P3/00GK104255806SQ201410422107
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】曾红, 万传星, 罗晓霞, 蒋卉, 杨生强 申请人:塔里木大学