专利名称：：防治棉花黄萎病的菌株b221的制作方法
技术领域：
：本发明涉及防治棉花黄萎病的单一菌株，属于农作物防病治病
技术领域：
，专用于棉花黄萎病的无公害防治。二、
背景技术：
由棉花黄萎病菌大丽轮枝孢(d"W&eKleb.)引起的棉花黄萎病是世界性、毁灭性病害，素有棉花"癌症"之称。自1914年首次在美国报道以来，现已遍及世界各大棉区。我国自1935年由美国引进斯字棉时传入，后随棉种调运不断扩大。近年来，棉花黄萎病在国内各棉区连续流行为害，尤其是20022003年，在全国各棉区大面积流行，发病面积高达3xi(^hn^以上，对棉花生产构成极大威胁。由于该病是通过土壤和秸杆传播的维管束病害，所以防治难度较大。首先，目前对棉花黄萎病的药剂防治中没有有效的化学农药。即使有，使用化学农药不仅会产生农药残留，而且随着化学农药的逐年使用也会出现棉花黄萎病菌的抗药性问题。其次，我国目前对此病害主要是采用选育选用抗病品种为主的综合治理措施。但目前我国棉花品种的抗病性只能达到耐至抗病水平，致使该病在环境条件合适的情况下仍然连续流行危害。此外，随着经济的发展，人们生活水平的提高，人们越来越注重食品安全问题，绿色作物、有机农产品等也越来越受人青睐。社会对安全、健康食品的需求促进了利用无公害方法来控制有害生物的研究。通过几年的研究实践，现己开发出一些生物杀菌剂，如农用链霉素、井岗霉素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜软腐病、青枯病，后者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜霉病。因为迄今为止尚缺乏理想的高抗丰产品种和有效药剂，且化学防治对环境污染的问题日益突出，所以在注重发展无公害生产技术的今天，生物防治作为防治棉花黄萎病的一种新思路，将得到进一步的重视与发展。三、
发明内容技术问题针对棉花黄萎病没有较高防效的生防菌株制剂现状，提供开发一种防治棉花黄萎病的单一菌株及其菌剂，专用于防治棉花黄萎病，菌株的防效高，并且有增产功能。技术方案防治棉花黄萎病的菌株B221，为球毛壳属(Oiaeto脂'wwg/o6oswm)，于2008年05月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0.2493。用防治棉花黄萎病的菌株B221制备生防菌剂的方法为-将上述防治棉花黄萎病的菌株B221在PDA培养液25°C200rpm振荡培养7天，用8层灭菌纱布过滤后得到其孢子悬浮液菌剂成品，用血球计数法将菌剂成品中活菌总浓度调节为109个孢子/毫升。其应用方法为，菌株制剂在作物移栽前喷雾使用，也可以做成堆肥使用，或稀释后在移栽时灌根使用。有益效果本发明与现有棉花黄萎病防治技术相比，其优点和积极效果表现在本发明是专门针对棉花黄萎病开发的生防菌株，因而在防治棉花黄萎病方面与目前其他广谱生物杀菌剂相比防治效果显著提高。由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于作物的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治棉花黄萎病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于作物的出口。同时，生防菌株制剂还有增产功能，可为农民增加收入。B221菌株制剂可以在温室移栽前，喷在肥料中，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在栽苗时灌根使用。栽苗后，菌株通过多种生防机制起作用，从而达到防治棉花黄萎病的效果。试验表明，在温室中使用B221菌株制剂对棉花黄萎病有一定程度的防治效果，达到58.96%;B221菌株制剂对棉花还有一定程度的增产效果，达到51.20%。四图1温室试验中B221菌剂在播种55天后对棉花黄萎病的防治效果注.-左一CK，右^B221;防效图2温室试验中B221菌剂在播种55天后对棉花黄萎病的促生效果注左一CK，右^B221;促生图3温室试验中B221菌剂在播种55天后对棉花黄萎病的促生效果(根)注左一CK，右一B221;促生(根)五具体实施方式1菌株的鉴定防治棉花黄萎病菌大丽轮枝孢(FeW/d///w/wdaW&eKleb.)的生防菌株B221，它是由南通市如东县掘港镇丁字岸村某棉花黄萎病发生严重的田块中，棉花健株的根部分离得来，发明人对菌株B221的平板拮抗活性、产纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶活性和利用磷和氮元素的测定进行了研究，发现菌株B221对棉花黄萎病菌(Fert/d/"ww^W^e)具有较强的平板拮抗活性，但不具有蛋白酶，纤维素酶和几丁质酶活性，不能利用磷和氮元素，菌株用PDA培养基培养，于PDA斜面4'C保存。发明人还对其进行了温室防效和促生实验研究，发现B221菌株制剂有很好的防病增产效果，防效达到58.96%，生物量的增加达51.20%，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。将待测真菌B221接于PDA培养基，25'C培养5天，用无菌手术刀刮取成熟的菌丝，根据Wang""/.方法(Wang，H.，Qi，M.，andCutler,A丄1993AsimplemethodofpreparingplantsamplesforPCR.NucleicAcidsRes.21，4153-4154.)提取真菌的DNA。利用弓l物ITS!禾口ITS4(ITS!:5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')(生兴生物技术有限公司合成)进行PCR扩增待测真菌的ITS区域。所有反应采用25-nL体系ITS!0.25pL，ITS40.25|aL，10xPCRbuffer2.5|oL，25mMMgCl21.5(jL，2.5mMdNTP1(jL，5n/mlr-Tagpolymerase(Takara)0.25pL,ddH2018.25pL，DNA1为模板。PCR反应条件为94°C5min，94°C30s，55。C30s，72°C30s，35cycles,with10minextensionat72。Cusedforthefinalcycle(WangWfl/.，1993)。PCR产物用1%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压卯V，15min，EB染色30min，找到目标条带(500-600bp),采用凝胶回收试剂盒(H.Q.&.Q.GelExtractionKitII)对所需条带进行回收。将目标片段连接至载体pMD18-T，然后转入￡.co/ZTop-10感受态细胞中，获得阳性克隆。通过测序获得ITS区域核酸序歹!j，在因特网中使用BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)于NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)NucleotideSequenceDatabase进4亍比对，获f寻鉴定结果B221为球毛壳属(C7w"ow/wwg/o6oww)。2温室防效试验将病原菌(Fer"'"7/fwwdaW/aeKleb.)(Li,X丄.，Li，Y.andZhang,T.Y.2003StudiesonCottonVerticilliumWiltControlbyFungalAntagonists.ActaGossypiiSinica15，2628.)接于PDA培养基，25。C恒温箱培养5天后，挑取菌丝于PDA培养液(Li,X丄.，Li,Y.andZhang,T.Y.2003StudiesonCottonVerticilliumWiltControlbyFungalAntagonists.ActaGossypiiSinica15,2628.)中，200rpm，25'C培养7天，8层灭菌纱布过滤后，利用血球记数法测得孢子悬浮液浓度，接于灭菌土壤中，使得每克土壤含有3.6><107个孢子，病原菌定殖10天后按照上述方法将生防菌B221接于土壤中(浓度为每克土壤约107个孢子)，同时播种品种为鲁棉研15的棉花包衣种子，设只接种病原菌的处理为对照。每个处理重复3次，每个重复20株棉花。播种55天后统计结果，计算病情指数和防效。调查结果时发病强度的分级标准(温室苗期)0级一健苗，子叶、真叶无病状；I级一l2片子叶发病，真叶未显病状；n级一子叶和i片真叶发病；ni级一2片或2片以上真叶发病；IV级一叶片大量脱落或棉花枯死。病情指数和防效计算公式如下-i:(病植株数x病级数)病情指数=-"00%总植株数x最高病级数对照病情指数一生防菌病情指数防效=-x100%对照病情指数苗期盆栽试验结果表明(表l，图l)，接种B221的棉花表现出一定程度的防治效果。表l生防菌施用后55天对棉花黄萎病的盆栽防效<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3温室促生试验在促生试验中，处理组植株只接种拮抗菌B221的孢子悬浮液，设清水处理植株为对照。方法同温室防效试验。播种55天后测量棉花的株高，根长，鲜重，并计算生物量的增加，用以估计生防菌对植物促生作用的影响。生物量的增加计算公式如下-处理组鲜重一对照组鲜重生物量增加=对照组鲜重xioo%表2生防菌施用后55天对棉花黄萎病的盆栽促生效果菌株编号根长(cm)株高(cm)鲜重(g)生物量的增加(％)B22112.4324.8515.0951.20CK15.4524.679.98/权利要求1.防治棉花黄萎病的菌株B221，其特征在于，该菌株为球毛壳属(Chaetomiumglobosum)，于2008年05月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.2493。2、权利要求1所述防治棉花黄萎病的菌株B221在防治温室棉花黄萎病方面的应用。3、用权利要求1所述防治棉花黄萎病的菌株B221制备的生防菌剂。4、权利要求3所述B221生防菌剂的制备方法，其特征在于将权利要求1所述防治棉花黄萎病的菌株B221在PDA培养液25。C200rpm振荡培养7d，用8层灭菌纱布过滤后得到其孢子悬浮液，菌剂成品中活菌总浓度109个孢子/毫升，即为所制备的B221生防菌剂。5、权利要求3或4所述B221生防菌剂在防治棉花黄萎病方面的应用。全文摘要本发明涉及防治棉花黄萎病的生防菌株B221，属于农作物防病治病
技术领域：
。经鉴定为球毛壳属(Chaetomiumglobosum)。菌种保藏号为CGMCCNO.2493。菌种在PDA培养液25℃200rpm振荡培养7d，用8层灭菌纱布过滤后得到其孢子悬浮液，成品中活菌总浓度10<sup>9</sup>个孢子/毫升，获得生防菌剂。菌株于PDA斜面4℃保存，B221菌株表现出较好的平板拮抗效果、温室防效和促生效果。试验表明，菌株B221温室防效达到58.96％，生物量的增加达51.20％；有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。文档编号A01P3/00GK101280280SQ200810123738公开日2008年10月8日申请日期2008年6月2日优先权日2008年6月2日发明者徐莉莉,郭坚华,莎鲁申请人:南京农业大学