一种赪桐悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种赪桐悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的悬浮细胞培养等步骤。本发明方法可以获得大量的赪桐愈伤组织及悬浮细胞，有助于赪桐资源的充分开发和利用，并且有利于赪桐悬浮细胞的大规模工业化生产。
【专利说明】 一种赫桐悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下赪桐悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]赦桐，马鞭草科，C/eroofefli/r應japonicum) Sweet,又名:朱桐、红顶风、红菱等，多年生落叶或常绿灌木，产江苏、浙江南部、江西南部、湖南、福建、台湾、广东、广西、四川、贵州、云南。印度东北、孟加拉、锡金、不丹、中南半岛、马来西亚、日本也有分布。赪桐原产于亚洲热带低海拔林缘或灌木丛中。其性喜高温、湿润、半荫蔽的气候环境，喜土层深厚的酸性土壤，耐荫蔽，耐瘠薄，忌干旱，忌涝，畏寒冷，生长适温为23?30°C。每年12月至翌年3月，南方旱季低温，露天的植株落叶休眠，林下植株可常绿。4月始萌发。以根、叶、入药。全年可采，洗净切碎鲜用或晒干。根:祛风利湿，散瘀消肿。用于风湿骨痛，腰肌劳损，跌打损伤，肺结核咳嗽，咯血。叶:解毒排脓。外用治疔疮疖肿，赪桐采用播种和扦插繁殖，组培方法研究目前尚处于起步阶段，悬浮细胞培养还无人研究，悬浮细胞具有操作简单可控，生产成本低，繁殖率高等优点。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供赪桐悬浮细胞培养的快速繁殖方法，可以获得大量的赪桐愈伤组织及悬浮细胞，有助于赪桐资源的充分开发和利用，并且有利于赪桐悬浮细胞的大规模工业化生产。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
选用赪桐幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗20分钟，在超净工作台上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分钟，无菌水冲洗5-6次，将叶片切成IcmXlcm的小块，接种在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种3块，附加蔗糖60g/l，琼脂0.65%，培养条件光照12001x，光期8h，暗期16h，温度22±2°C，湿度70%，将诱导出来的愈伤组织接入MS+NAA2mg/L+2，4-D4mg/L培养基上进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/l，琼脂0.65%，培养条件光照25001x，光期12h，暗期12h，温度25 ±2。。，湿度70%，继代4-5次后，挑选嫩绿松散的愈伤组织接入到培养基改良MS+NAA0.3 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麦芽提取物中悬浮培养，采用旋转通气式培养，30天后，称重，检测增长量。
[0005]采用本发明制备的赪桐悬浮细胞，生长速度快，能耗小，污染小，可以短期内获得大量的次生代谢产物。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1 选用赪桐幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗20分钟，在超净工作台上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分钟，无菌水冲洗5-6次，将叶片切成IcmXlcm的小块，接种在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种3块，附加蔗糖60g/l，琼脂0.65%，培养条件光照12001x，光期8h，暗期16h，温度22±2°C，湿度70%，将诱导出来的愈伤组织接入MS+NAAlmg/L+2，4-D3mg/L培养基上进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/l，琼脂0.65%，培养条件光照25001x，光期12h，暗期12h，温度25 ±2。。，湿度70%，继代4-5次后，挑选嫩绿松散的愈伤组织接入到培养基改良MS+NAA0.1 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麦芽提取物中悬浮培养，采用旋转通气式培养，30天后，称重，检测增长量。
[0008]实施例2
选用赪桐幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗20分钟，在超净工作台上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分钟，无菌水冲洗5-6次，将叶片切成IcmXlcm的小块，接种在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种3块，附加蔗糖60g/l，琼脂0.65%，培养条件光照12001x，光期8h，暗期16h，温度22±2°C，湿度70%，将诱导出来的愈伤组织接入MS+NAA3mg/L+2，4-D5mg/L培养基上进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/l，琼脂0.65%，培养条件光照25001x，光期12h，暗期12h，温度25 ±2。。，湿度70%，继代4-5次后，挑选嫩绿松散的愈伤组织接入到培养基改良MS+NAA0.5 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麦芽提取物中悬浮培养，采用旋转通气式培养，30天后，称重，检测增长量。
[0009]实施例3
选用赪桐幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗20分钟，在超净工作台上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分钟，无菌水冲洗5-6次，将叶片切成IcmXlcm的小块，接种在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种3块，附加蔗糖60g/l，琼脂0.65%，培养条件光照12001x，光期8h，暗期16h，温度22±2°C，湿度70%，将诱导出来的愈伤组织接入MS+NAA2mg/L+2，4-D4mg/L培养基上进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/l，琼脂0.65%，培养条件光照25001x，光期12h，暗期12h，温度25 ±2。。，湿度70%，继代4-5次后，挑选嫩绿松散的愈伤组织接入到培养基改良MS+NAA0.1 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麦芽提取物中悬浮培养，采用旋转通气式培养，30天后，称重，检测增长量。
[0010]实施例4
选用赪桐幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗20分钟，在超净工作台上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分钟，无菌水冲洗5-6次，将叶片切成IcmXlcm的小块，接种在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种3块，附加蔗糖60g/l，琼脂0.65%，培养条件光照12001x，光期8h，暗期16h，温度22±2°C，湿度70%，将诱导出来的愈伤组织接入MS+NAA2mg/L+2，4-D4mg/L培养基上进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/l，琼脂0.65%，培养条件光照25001x，光期12h，暗期12h，温度25 ±2。。，湿度70%，继代4-5次后，挑选嫩绿松散的愈伤组织接入到培养基改良MS+NAA0.5 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麦芽提取物中悬浮培养，采用旋转通气式培养，30天后，称重，检测增长量。
【权利要求】
1.一种赪桐悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:赪桐的叶片经消毒处理，接种在MS+6-BA5mg/L+2，4_D lmg/L的培养基中进行愈伤组织诱导，将诱导出来的愈伤组织接入MS+NAAl-3mg/L+2,4-D3-5mg/L培养基上进行愈伤组织增殖培养，继代4_5次后，挑选嫩绿松散的愈伤组织接入到培养基改良MS+NAA0.1-0.5mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麦芽提取物中悬浮培养，采用旋转通气式培养，30天后，称重，检测增长量。
2.根据权利要求1所述的一种赪桐悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒处理为:选用赪桐幼嫩的叶片，用漂白粉浸泡三分钟，自来水冲洗20分钟，在超净工作台上用70%的乙醇消毒20s, 0.1 %的升萊消毒10分钟,无菌水冲洗5-6次,将叶片切成IcmX Icm的小块，每瓶接种3块。
3.根据权利要求1所述的一种赪桐悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:诱导愈伤组织附加蔗糖60g/l，琼脂0.65%，培养条件光照12001x，光期8h，暗期16h，温度22±2°C，湿度 70%ο
4.根据权利要求1所述的一种赪桐悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:愈伤组织增殖中附加蔗糖30g/l，琼脂0.65%，培养条件光照25001x，光期12h，暗期12h，温度25±2°C，湿度70%。
5.根据权利要求1所述的一种赪桐悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:悬浮细胞培养中改良MS为MS培养基中除硝酸铵外其他物质均减为原来的3/4。
6.根据权利要求1所述的一种赪桐悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是: 悬浮细胞培养基中附加了加入了麦芽提取物，可以促进悬浮细胞的生长，又可以缓冲PH值的变化。
【文档编号】A01H4/00GK104255481SQ201410463254
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司