百脉根erf类转录因子、其编码基因及表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了百脉根ERF类转录因子、其编码基因及表达载体和应用。本发明从百脉根中分离得到ERF类转录因子cDNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明还提供了含有该转录因子cDNA的表达载体及宿主细胞。功能分析实验证明，在植物中过表达ERF类转录因子cDNA能够有效提高或改善植物对包括高盐、干旱、低温等逆境胁迫的抗性。本发明进一步提供了它们在提高植物对逆境胁迫抗性或培育耐逆境胁迫转基因植物新品种中的应用，包括：构建含有所述ERF类转录因子cDNA的重组植物表达载体；将其转化到植物细胞中，培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物。
【专利说明】百脉根ERF类转录因子、其编码基因及表达载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转录因子，尤其涉及从百脉根（Lotus corniculatus L.)中分离的与 抗逆相关的ERF类转录因子及其编码基因，本发明进一步涉及它们在提高植物抗逆境胁迫 能力中的应用，属于ERF类转录因子及其应用领域。
【背景技术】
[0002] 土壤干旱、盐碱化严重阻碍了农作物的生长，降低了农作物的产量，已经成为制约 世界灌溉农业可持续发展和影响生态环境的重要因素。随着人口增加、耕地减少以及水资 源的匮乏，提高水资源利用效率、充分开发和利用盐碱地有着极其重要的现实意义。盐碱地 改良是世界性难题，传统措施投资大、效益低，经过数十年实践，利用基因工程技术提高植 物抗旱、耐盐碱的能力，是开发利用干旱、盐碱地资源最根本、最经济、最有效的途径之一。
[0003] 植物抗逆性是受多基因控制的复杂数量性状，单个基因表达的增强并不能从根本 上改良植物对多种不良环境的抵抗能力，而转录因子（Transcriptional Factors, TFs)是 能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在 特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白，是目前抗逆研究最多、应用最广的一类 基因。
[0004] 植物逆境抗性相关转录因子可以分：AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB、NAC五大类。其中 AP2/ERF转录因子是植物特有的一大类超基因家族，具有非常保守的DNA结合域，特异性的 与ERE、GCC-box等顺式元件结合，调控胁迫应答基因表达，是参与植物生长发育、生物/非 生物胁迫应答基因表达及信号转导的重要转录调控因子。其中DREB和ERF是首要的两大 类亚家族，在生物/非生物胁迫应答中发挥至关重要的作用，是提高植物抗逆性能的理想 候选基因。
[0005] 目前已从不同物种中分离克隆了上千个DREB/ERF基因，对近200个基因进行了功 能验证，转基因拟南芥、烟草等模式植物、水稻、玉米、大麦、小麦、大豆等粮食作物、番茄、马 铃薯、辣椒、花生、棉花等经济作物、苜蓿、三叶草、高羊茅、百脉根等牧草中过表达在不同程 度上提高了抗旱、耐盐、高温、冷冻、抗病虫等抗逆性能。尽管植物抗逆基因工程的研究取得 了一些进展，但是其重点均在导入个别功能基因来提高某种抗性，从而达不到使植物的抗 逆性得到综合、根本性的改良。
[0006] 百脉根（Lotus corniculatus L.)是世界范围内广泛种植的多年生优良豆科牧 草，具有营养丰富、耐贫瘠、耐酸碱、耐牧和饲用安全、适口性好等优点。百脉根不仅是建设 生态农业的优质草种，还是用于土壤改良的重要作物，在用作地被植物、保持水土、改良人 工草场、防止土壤荒漠化等方面具有独特作用。另外，百脉根在西方国家也常被作为路旁和 庭院观赏植物而栽培。植物抗逆相关的ERF转录因子基因的分离、鉴定及其功能分析，对阐 明抗逆分子机制、有效地进行分子育种研究十分必要。选择优质牧草百脉根为材料分离、鉴 定AP2/ERF转录因子并分析其抗逆功能，对于农牧业生产、生态环境建设以及土壤改良等 具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明目的之一是提供从百脉根（Lotus corniculatus L.)中分离的ERF类转录 因子及其编码基因。
[0008] 本发明目的之二是提供含有上述编码基因的重组植物表达载体以及含有该表达 载体的宿主细胞。
[0009] 本发明目的之三是将所述的转录因子及其编码基因应用于提高或改善植物对于 逆境胁迫的抗性。
[0010] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011] 为实现上述目的，本发明一方面提供了一种从百脉根（Lotus corniculatus L.) 所分离的ERF类转录因子cDNA(LcERF053)，其多核苷酸为（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示：
[0012] (a)、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或
[0013] (b)、编码SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或
[0014] (c)、与SEQ ID NO: 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸所编码蛋白质仍具有ERF类转录因子功能；或
[0015] (d)、与SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或
[0016] (e)、在SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代 或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有ERF类转录因子功能的功 能或活性。
[0017] 本发明目的之二是提供由上述转录因子cDNA(LcERF053)所编码的能够提高植物 对逆境胁迫抗性的ERF类转录因子，其氨基酸为（a)或（b)所示：
[0018] (a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；
[0019] (b)、将SEQ ID No. 2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有ERF类转录因子功能或活性的蛋白变体；
[0020] 其中，SEQ ID NO. 2的氨基端第100至163位氨基酸残基序列为AP2/ERF结合域 的编码序列（SEQ ID No. 3)，该结合域第14位（113位）氨基酸为丙氨酸（A)，第19位（118 位）氨基酸为天冬氨酸（D)，此类结构域能够与GCC box顺式作用元件结合而启动抗病防卫 基因或抗逆应答基因的表达。
[0021] 本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本 领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备ERF转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中 由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基 替换成具有相似性质的另一种氨基酸。
[0022] 本发明所述的ERF转录因子及其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。 "变体"意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处 一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码 的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的 分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所 得到的仍编码SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法（例如 DNA改组）。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所 编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活 情况或转基因植物中表达的效应等。
[0023] 本发明还提供了含有所述ERF转录因子cDNA(LcERF053)的重组植物表达载体以 及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。
[0024] 将所述ERF转录因子cDNA可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表 达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5'端非编码区，SEQ ID No. 1所示的多核苷酸和3'非编码区组成，其中，所述的5'端非编码区可以包括启动子序 列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、 组织或器官特异性启动子；所述的3'非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。 合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止 区。
[0025] 另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No. 1所示的多核苷酸进行优化以增强或改 善在植物中的表达效率。例如。可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以 增强或改善在目标植物中的表达效率。
[0026] 该重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记 基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草 化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如半乳糖苷酶和荧光 蛋白等。
[0027] 本发明还涉及将所述的ERF转录因子cDNA引入到植物中以提高植物对逆境胁迫 的抗性。
[0028] 本发明提供了一种提高植物对逆境胁迫抗性的方法，包括：将本发明从百脉根中 分离的ERF转录因子cDNA引入到目标植物或植物细胞中，有效提高目标植物对逆境胁迫的 抗性。
[0029] 本发明还提供了一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，包括：构建含 有所述从百脉根中分离的ERF转录因子cDNA的重组植物表达载体；将所构建的重组植物 表达载体转化到植物或植物细胞中，培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品 种。
[0030] 其中，所述的逆境胁迫包括高盐、干旱、低温等逆境。
[0031] 所述的"引入"指将ERF转录因子基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷 酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习 知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法或病毒介导法等。"稳定转化"指被引入的多核苷 酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；"瞬时转化"指多核苷酸被引入 到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。
[0032] 转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物（单 子叶植物或双子叶植物）或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞 的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击 等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的ERF转录因子基因提供给植 物。在其它实施方案中，本发明的ERF转录因子基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触 来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的ERF转录因子基因构建体引入病毒DNA 或RNA分子中。
[0033] 利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株（McCormick et al. Plant Cell Reports. 1986. 5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植 物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如， 可以是玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等。
[0034] 为了分析本发明从百脉根（Lotus corniculatus L.)中分离的ERF类转录因子 cDNA(LcERF053)的功能，本发明首先构建了含有LcERF053基因的重组植物高效表达载体， 利用农杆菌介导将其转化到拟南芥中；通过Hyg抗性、基因组PCR及RT-PCR筛选鉴定阳性 苗，对转基因拟南芥苗进行高盐、干旱等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定， 通过测定生理生化指标分析看出，转LcERF053基因拟南芥植株的植株含水量、可溶性糖和 脯氨酸等含量高于对照，这些渗透调节物质的大量积累有助于减少渗透胁迫和干旱胁迫对 植物的伤害，说明过表达LcERF053基因能调节渗透调节物质的含量从而提高转基因拟南 芥的抗旱性和渗透胁迫抗性。功能转化实验证明，在植物中过表达LcERF053基因能够有效 提高或改善植物对包括高盐、干旱、低温等逆境胁迫的抗性，在提高植物抗逆反应中起着重 要作用，说明LcERF053基因所编码的蛋白具有ERF类转录因子的功能。
[0035] 本发明所渉及到的术语定义
[0036] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者 类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0037] 术语"转录因子"是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合， 从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。
[0038] 术语"多核苷酸"或"核苷酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷 酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生 的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包 括PNA (肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并 密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以 上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简 并密码子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))。
[0039] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白"在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。艮P， 针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨 基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如 本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基 酸残基经由共价肽键连接。
[0040] 本发明中所述"严谨杂交条件"意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的 条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可 检测程度更高（例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境 条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗 涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献 (Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ''Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定 离子强度PH下的热熔点（Tm)约5-10°C。T mS在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交 到目标序列时所处的温度（在指定离子强度、PH和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在， 所以在T m下在平衡状态下50%的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在pH7. 0到 8. 3下盐浓度低于约I. OM钠离子浓度，通常为约0. 01到I. OM钠离子浓度（或其它盐），并 且温度对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30°C，而对于长 探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）而言为至少约60°C。严谨条件也可通过加入 诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背 景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5 X SSC和1% SDS，在42°C下培养；或5XSSC，1% SDS，在65°C下培养，在0. 2XSSC中洗涤和在65°C下于 0. 1% SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
[0041] 本发明中所述的"多个"通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于ERF转录因 子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的"替换"是指分别用不同的氨基酸 残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的"缺失"是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别 缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的"插入"是指氨基酸残基序列的改变，相对天然 分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。
[0042] 术语"重组宿主细胞株"或"宿主细胞"意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管 使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组 中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。
[0043] 术语"可操作的连接"指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元 件可为邻接或非邻接的。
[0044] 术语"转化"：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
[0045] 术语"表达"：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
[0046] 术语"编码序列":转录成RNA的核酸序列。
[0047] 术语"重组植物表达载体"：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中 这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介 导转化的。二元载体通常包括=T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够 在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
【专利附图】
【附图说明】
[0048] 图 I LcERF053cDNA 全长序列的扩增结果；M :DNA Marker 100bp，l :PCR 产物。
[0049] 图2 LcERF053结构保守域分析。
[0050] 图3 LcERF053二级结构分析。
[0051] 图4进化起源分析。
[0052] 图5 LcERF053在不同胁迫条件下的表达模式分析。
[0053] 图6植物表达载体pH7WG2D-LcERF053构建流程图。
[0054] 图7重组质粒pH7WG2D-LcERF053菌落PCR扩增结果。
[0055] 图8含有表达载体pH7WG2D-LcERF053的农杆菌GV3101的菌落PCR ;M: 100 ;+ :阳 性对照，-:农杆菌GV3101 (阴性对照）。
[0056] 图9转LcERF053基因拟南芥的DNA水平的PCR检测结果；M: IOOOObpMarker ;+ : 阳性对照，-:阴性对照。
[0057] 图10转LcERF053基因拟南芥的RNA水平的PCR检测；M: IOOOObp marker ;+ :阳 性对照，-:阴性对照。
[0058] 图11盐胁迫下转基因 LcERF053拟南芥以及野生型拟南芥的存活率。
[0059] 图12盐胁迫下转基因 LcERF053拟南芥以及野生型拟南芥的相对含水量和电导 率变化结果；Wt为野生型拟南芥；L4、LlO和L12为转基因 LcERF053拟南芥的不同株系。
【具体实施方式】
[0060] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0061] 实施例1百脉根LCERF053转录因子的分离、鉴定与克隆
[0062] 1材料与方法
[0063] I. 1 材料
[0064] I. I. 1植物材料培养及胁迫处理
[0065] 以百脉根-"Leo"为材料，选成熟饱满、无病虫害的种子，用0. 1 %升汞浸泡 15-20min，无菌水冲洗3次，瞭干，把消过毒的种子置于B5培养基上，于光照培养箱中培养 30天，用150mM的氯化钠处理12h、24h，采集叶片立即液氮速冻，保存于-80°C冰箱中备用。
[0066] I. 1. 2菌株与质粒
[0067] 大肠杆菌（Escherichia coli) :DH5 α 本发明人实验室保存
[0068] PMD19-T克隆载体 购自TaKaRa生物公司
[0069] 1.2实验方法
[0070] I. 2. 1百脉根总RNA的提取（试剂盒法）
[0071] L 2. 2第一链cDNA的合成（按天跟公司反转录试剂盒说明书进行）
[0072] I. 2. 3 ERF转录因子基因 cDNA的克隆 [0073] 1. 2. 3. 1引物的设计与合成
[0074] 表1克隆LcERF053cDNA全长的引物序列
[0075]
【权利要求】
1. 从百脉根（Lotus corniculatus L.)分离的ERF类转录因子cDNA，其特征在于，其 多核苷酸为（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或 (b) 、编码SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、与SEQ ID NO: 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷 酸所编码蛋白质仍具有ERF类转录因子功能；或 (d) 、与SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或 (e) 、在SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插 入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有ERF类转录因子功能的功能或 活性。
2. 权利要求1所述cDNA编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸为（a)或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸； (b) 、将SEQ ID No. 2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有ERF类转录因子功能或活性的蛋白变体。
3. 与顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因表达的ERF类转录因子 的结构域，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示。
4. 含有权利要求1所述cDNA的表达载体。
5. 按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是重组植物表达载体。
6. 权利要求1所述的cDNA在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。
7. 按照权利要求6所述的应用，包括：构建含有权利要求1所述cDNA的重组植物表达 载体；将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中，培育筛选得到对逆境胁迫 抗性提高的转基因植物。
8. -种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，包括：构建含有权利要求1所述 cDNA的重组植物表达载体；将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中，培育 筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。
9. 权利要求2所述的蛋白或权利要求3所述的结构域在提高植物对逆境胁迫抗性中的 应用。
10. 按照权利要求6、7或9所述的应用，其特征在于：所述的逆境胁迫包括高盐、干旱 或低温。
【文档编号】A01H5/00GK104293802SQ201410488539
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】吴燕民, 李诗刚, 孙占敏, 周美亮, 李金博 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 深圳市铁汉生态环境股份有限公司