香蕉水通道蛋白基因启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种香蕉水通道蛋白基因启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。利用香蕉水通道蛋白基因启动子构建一种表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1304：MaPIP1；1-Promoter。本发明利用启动逆境相关基因的高效表达，应用于耐旱和耐盐的转基因植物中，对于解决干旱和盐害地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。
【专利说明】香蕉水通道蛋白基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程【技术领域】，具体是指一种香蕉水通道蛋白基因启动子和 在植物中高效表达的干旱和盐害的应用。
【背景技术】
[0002] 水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球约有 20%的耕地受到盐害威胁。干旱与盐害严重影响植物的生长发育，造成作物减产，并使生态 环境日益恶化。在自然条件下，由于环境胁迫而严重影响了作物生长发育，其遗传潜力难以 发挥，干旱、盐渍不仅影响了作物的产量，而且限制了植物的广泛分布，因此，提高作物的抗 旱、耐盐能力已经成为现代植物研究工作中急需解决的关键问题之一。
[0003] 香蕉是热带、亚热带地区的重要经济作物之一，被联合国粮农组织（FAO)定位为 发展中国家仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。香蕉前期植株较小，根系浅生， 易受旱、盐害等胁迫的影响，在栽培生产中，耗水量大，缺水会减少香蕉果实数量且使香蕉 变小，挂果期受旱，会影响果实膨大，在营养生长阶段遇上干旱，会使香蕉营养器官生长发 育不良，从而造成减产。而土壤盐分过多使根际土壤溶液渗透势降低，促使植物吸收水分困 难，造成生长速度和生长量显著下降，严重还可能造成死亡（Van et al.，2011)。解决香蕉 生产中严重的逆境胁迫问题，提高香蕉产量，除了常规育种技术以外，基于基因遗传转化的 生物育种技术是一个重要的选择。在基因工程中，用来控制目的基因表达的启动子主要以 CaMV35S等组成型表达启动子为主。该启动子虽能使目的基因过量表达，但它是无环境、组 织和时间特异性的组成型表达的启动子。利用组成型表达启动子控制抗性相关基因的过量 表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但正常环境条件下细胞内也会过量表达 抗逆蛋白，对植物来说是一种能量浪费。因此，利用逆境诱导型启动子实现高效、可控和特 异（定点、定时、定量）的调控抗逆基因在改良作物的抗性中成为当前研究的热点。
[0004] 对植物在干旱和盐害等逆境胁迫下大量表达的抗逆基因启动子研究表明，不同耐 旱和耐盐基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件，并受相同的反式作用因子的调控。
[0005] 非生物胁迫如干旱、高盐、低温等，可以诱导植物体内相关基因表达，其转录调节 的主要机制是逆境胁迫有关的转录因子（调节蛋白）与基因上游启动子中关键顺式元件 特异结合，增强启动子的活性，提高目的基因的表达量。国内外有一些关于逆境启动子的 报道，干旱诱导型启动子，拟南芥erdl (early responsive to dehydration stressl)基因 与干旱胁迫相关，其启动子区域存在保守的干旱响应顺式作用元件（Drought-Responsive cis-Element) CATGTG和CACG模体，融合⑶S检测其表达谱发现，它在盐胁迫下叶片中特 异性增强转录水平（Tran et al·，2004)。SNACl (STRESS-RESPONSIVE NACl)是 NAC 家 族的一员，超表达植株抗旱性大大增强，在受到干旱胁迫时能够正常结实，该基因的启动 子驱动GFP表达情况揭示其受到干旱诱导在保卫细胞中特异性表达（Hu et al.，2006)。 rd29A启动子受ΑΒΑ、干旱、高盐及低温等逆境诱导，是目前抗逆植物基因工程中应用最 广泛的诱导型启动子（李新玲等，2007 ;杨春霞等，2008 ;吴梅花等，2005 ;Yamaguehi - shinOZakiandshinOZaki，1993)。Yamaguehi - shinozaki 等（2001)分别利用 CaMV355 组成型启动子和rd29A逆境诱导型启动子获得了 DREBIA的转基因植株，结果显示 rd29A: =DREBIA转基因植株的胁迫耐性明显高于355: =DREBIA的转基因植株，表明rd29A启 动子能更有效地提高植物对低温、干旱和高盐等逆境胁迫的适应性。Brown等（2001)首次 在冬麦中发现了受低温诱导的bltlOl. 1基因启动子，并通过渐变缺失鉴定到了一个高度 保守的T-Iike元件（TCATCTTCTT)，表明该元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密 切相关。Takumi等（2003)在小麦种分离到一个低温应答基因 WC0rl5上游I. 7kb的启动子 序列，结果显示该区段内包含有4个CRT/DRElike序列，包括CCGAC核心基序，实验证明该 启动子受低温和光诱导。
[0006] 利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因的高效表达，从而改良作物对逆境胁迫的适 应性已成为目前的研究热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因 此，对于新的逆境相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作 用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种香蕉水通道蛋白基因启动子，其核苷酸 序列如SEQ IDN0. 1所示。该序列长度为841bp。通过对该启动子序列中的顺式作用元件进 行预测分析，发现该启动子具有响应干旱和高盐的元件，含有1个响应干旱元件CBFHV，1个 ABA和干旱响应元件DRE2C0REZMRAB17,1个干旱、高盐响应元件DRECRTCOREAT，1个早期响 应干旱元件MYCATERD1。
[0008] 本发明还提供了一种用于获得香蕉水通道蛋白基因启动子的引物对，所述引物对 为：
[0009] 正向兼并引物：5' -NTCGASTWTSGWGTT-3'（5, -NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T) GTT-3，）；
[0010] 三轮反向引物：
[0011] 第一轮反向引物prl:
[0012] 5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3' ；
[0013] 第二轮反向引物pr2:
[0014] 5,-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3，；
[0015] 第三轮反向引物pr3:
[0016] 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。
[0017] 本发明还提供了一种香蕉水通道蛋白基因启动子的获得方法，该方法以具有香蕉 水通道蛋白基因的香蕉基因组DNA为模板，采用以下引物对：
[0018] 正向兼并引物：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3' ；
[0019] 三轮反向引物：
[0020] 第一轮反向引物prl
[0021] :5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3' ；
[0022] 第二轮反向引物pr2:
[0023] 5,-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3，；
[0024] 第三轮反向引物pr3:
[0025] 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。
[0026] 进行三轮PCR扩增，其所获得的香蕉水通道蛋白基因启动子为SEQ IDN0. 1。
[0027] 本发明还提供了一种重组表达载体，它含有权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因 启动子的植物表达载体。所述植物表达载体为PCAMBIA1304。该表达载体可使外源目的基 因的高效表达。
[0028] 本发明还提供了一种重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：
[0029] 1)以香蕉水通道蛋白基因启动子SEQ IDN0. 1为模板设计引物对，且引物对分别 上加 ECORI、SPeI酶切位点和保护碱基：
[0030] 正向引物Pl:
[0031] 5'-CGGAATTCATCGAGTATGGTGTTCCTATGCT-3' ，
[0032] 反向引物P2:
[0033] 5'-GGACTAGTCTATCACTATCTATCTCCCCTGT-3' ；
[0034] 2)以香蕉水通道蛋白基因启动子SEQ IDN0. 1为模板进行PCR，PCR扩增条件如 下：
[0035] 94°C预变性 3min ;94°C变性 40s、55°C退火 40s、72°C延伸 40s，共 35 个循环；72°C 延伸8min ;获得PCR产物；
[0036] 3)用ECORI、SPeI将PCR产物进行酶切，纯化回收；同时，用ECORI、SPeI将 PCAMBIA1304载体进行双酶切，去除CaMV35S启动子，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回 收大片段；
[0037] 4)在IOul体系中，将回收的pCAMBIA1304载体大片段和回收的PCR产物用T4 连接酶4°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将筛选得到的阳性克隆 用ECORI、SPeI进行酶切验证，获得得到表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1304 : MaPIPl "-Promoter。
[0038] 本发明还提供了一种含有权利要求4和5所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿 主细胞为农杆菌EHA105。
[0039] 本发明还提供了一种下述各项之一在培养干旱性和盐害性植物中的应用，
[0040] (1)权利要求1所述的启动子；
[0041] (2)权利要求4或5所述的重组表达载体；
[0042] (3)权利要求7所述的农杆菌EHA105。
[0043] 作为优选方案，所述的植物为拟南芥。
[0044] 本发明还提供了一种培育具有干旱性和盐害性的转基因植物的方法，包括以下步 骤：
[0045] 1)启动子克隆；
[0046] 2)植物表达载体构建；
[0047] 3)受体的遗传转化；
[0048] 4)阳性转基因植株的鉴定；
[0049] 5)抗旱性和耐盐性表型及生理分析。
[0050] 本发明的有益效果在于：
[0051] 本发明利用启动逆境相关基因的高效表达，应用于耐旱和耐盐的转基因植物中， 对于解决干旱和盐害地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0052] 图1为本发明的利用TAIL-PCR扩增启动子三轮PCR产物鉴定电泳图；
[0053] 图2为本发明的MaPIPl ;1启动子连接pCAMBIA1304质粒酶切鉴定电泳图；
[0054] 图3为本发明的植物表达载体构建示意图；
[0055] 图4为本发明pCAMBIA1304:MaPIPl ; I-Promoter转化农杆菌PCR鉴定电泳图；
[0056] 图5为本发明的MaPIPl ;1启动子序列中含有的顺式作用元件的分析结果图；
[0057] 图6为本发明的35S启动子和MaPIPl ;1启动子转基因拟南芥干旱和盐胁迫处理 表型图；
[0058] 图7为本发明的35S启动子和MaPIPl ;1启动子转基因拟南芥叶片中⑶S酶活定 量分析结果图。
【具体实施方式】
[0059] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0060] 实施例1香蕉水通道蛋白基因 MaPIPl ;1启动子的分离
[0061] 1、香蕉基因组DNA的制备
[0062] 取生长1个月的香蕉组培苗，采用CTAB法提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测 后于-20°C进行保存。
[0063] 2、MaPIPl ;1启动子的克隆和序列分析
[0064] 以香蕉基因组DNA为模板，通过TAIL-PCR法设计三轮引物对，该引物对为：
[0065] 正向兼并引物：5' -NTCGASTWTSGWGTT-3'（5, -NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T) GTT-3，）；
[0066] 三轮反向引物：
[0067] 第一轮反向引物prl:
[0068] 5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3' ；
[0069] 第二轮反向引物pr2:
[0070] 5'-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3' ；
[0071] 第三轮反向引物pr3:
[0072] 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。
[0073] 第一轮PCR反应体系为：模板为香蕉基因组DNAl μ?，正向简并引物 0· 5μ 1(10μΜ/μ 1)，第一轮反向引物 prio. 5μ 1(10μΜ/μ 1)，Ex Taq by ffer2. 5μ 1，Ex TaqO. 25μ 1，dNTP4y 1，（ΜΗ2017μ I 共 25μ 1。
[0074] 第一轮PCR反应条件为92°C预变性3min，95°C变性lmin，1个循环；94°C变性30s， 65°〇退火111^11，721：延伸21^11，5个循环 ；941：变性3〇8,251：退火21^11，721：延伸21^11，1 个循环；94°C变性 30s，65°C退火 lmin，72°C延伸 2min，94°C变性 30s，65°C退火 2min，72°C 延伸211^11，941：变性3〇8,441：退火11^11，721：延伸21^11，15个循环；721：延伸51^11，1个循 环。
[0075] 第二轮PCR反应体系为：模板为第一轮反应产物稀释50倍取1 μ 1，正向简并引物 0· 5μ 1(10μΜ/μ 1)，第二轮反向引物 pr20. 5μ 1(10μΜ/μ 1)，Ex Taq by ffer2. 5μ 1，Ex TaqO. 25 μ I，dNTP4 μ I，ddH2017 μ I 共 25 μ I。
[0076] 第二轮PCR反应条件为94°C变性30s，65°C退火lmin，72°C延伸2min，94°C变性 30s，65°C退火 lmin，72°C延伸 2min，94°C变性 30s，45°C退火 lmin，72°C延伸 2min，12 个循 环；72°C延伸5min，1个循环。
[0077] 第三轮PCR反应体系为：模板为第二轮反应产物取Ιμ?，正向简并引物 0· 5μ 1(10μΜ/μ 1)，第三轮反向引物 pr30. 5μ 1(10μΜ/μ 1)，Ex Taq by ffer2. 5μ 1，Ex TaqO. 25μ 1，dNTP4y 1，（ΜΗ2017μ I 共 25μ 1。
[0078] 第三轮PCR反应条件为94°C变性40s，45°C退火lmin，72°C延伸2min，20个循环； 72°C延伸5min，l个循环。
[0079] 将第三轮PCR产物检测并回收测序，获得长度为841bp的MaPIPl ;1启动子，其 序列为 SEQ ID NO :1，使用 PLACE 软件(http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/),图 5 为 MaPIPl ;1启动子含有的顺式作用元件的分析结果，香蕉水通道蛋白基因启动子序列中的 顺式作用元件进行预测分析，发现该启动子含有真核生物启动子的基本保守元件TATA-box 和 CAAT-box。
[0080] 实施例2表达载体的构建
[0081] 1)以实施例1中回收的第三轮PCR产物为模板设计引物，引物上加 EC0RI、SPeI酶 切位点和保护碱基：
[0082] 正向引物Pl:
[0083] 5'-CGGAATTCATCGAGTATGGTGTTCCTATGCT-3' ，
[0084] 反向引物P2:
[0085] 5'-GGACTAGTCTATCACTATCTATCTCCCCTGT-3' ；
[0086] 2)?0?扩增条件为：941：预变性31^11;941：变性4〇8、551：退火4〇8、721：延伸4〇8， 共35个循环；72°C延伸8min。
[0087] 3)用EC0RI、SPeI将PCR产物进行酶切，纯化回收。同时，用EC0RI、SPeI将 PCAMBIA1304载体进行双酶切，去除CaMV35S启动子，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回 收大片段。在10 μ 1体系中，将回收的PCAMBIA1304载体大片段和回收的PCR产物用T4连 接酶4°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，
[0088] 4)将筛选得到的阳性克隆用EC0RI、SPeI进行酶切验证（图2)，获得重组质粒，从 而使香蕉水通道蛋白基因启动子取代载体PCAMBIA1304上的CaMV35S启动子，与Gus基因 融合，得到表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1304 :MaPIPl ; I-Promoter (图3)。
[0089] 实施例3转基因植株的获得
[0090] 通过电击转化法，将在实施例2中构建的表达Gus基因的植物重组表达载体 PCAMBIA1304 :MaPIPl ;l-Promoter转化到农杆菌中EHA105中，提取质粒并进行PCR鉴定 (图4)，确定质粒真正的转入到了农杆菌中。
[0091] 将拟南芥野生型种子撒播在花钵中，并在表面铺一层细砂，将其放置在2?4°C， 湿润、黑暗条件下春化处理1?3天，保湿待种子萌发。于人工气候箱中培养，以蛭石为基 质，温度控制在21?23°C，营养生长期每日光照时间为8h，生殖生长期每日为光照为16h， 光照强度为20001x，培养室相对湿度为70?90%。当幼苗长出真叶后，可进行移植。移栽 后保湿一星期左右，直至幼苗长出新叶。每隔4d浇适量的拟南芥营养液，待花苔长至5? IOcm及侧苔抽出时，可用于转化。
[0092] 将已转化有pCAMBIA1304 :MaPIPl ;l-Promoter的农杆菌，加到含有Kan和Rif抗 生素的LB培养基中，28°C振荡10h，加入拟南芥转基因浸润液（l/2MS，50g/L Sucrose)中， 将拟南芥倒置浸染到菌液中，采用花序浸染法进行转化。
[0093] 将晾干的种子以75%乙醇+0. 02% Triton XlOO溶液浸泡lOmin，移除乙醇溶液， 重复2-3次，将种子吹打到无菌滤纸上，风干；将晾干的种子撒播在选择培养基（1/2MS， L 5% Sucrose，0. 7%Agra，25y g/mL hygromycin B)上进行抗性筛选,收获T3代种子进行 后续实验分析。
[0094] 实施例4转基因植株干旱和盐胁迫处理表型分析
[0095] 将生长4周的转基因拟南芥控水20天进行干旱胁迫，20天后，具有35S启动子的 转基因株系叶片大部分失绿，存活率已降至16%，而MaPIPl ; 1启动子转基因植株还保持较 强生命力，存活率为81 %，证明该转基因植株具有更强的抗旱能力。同时，将生长4周的转 基因拟南芥用350mM NaCl溶液浇灌15天进行盐胁迫，15天后，具有35S启动子的转基因株 系叶片大部分萎蔫，存活率下降至12%，而MaPIPl ;1启动子转基因植株仍保持较高的存活 率为76%，证明该转基因植株具有更强的耐盐能力（图6)。
[0096] 实施例5转基因植株Gus表达活性分析
[0097] 取对照及进行干旱和盐胁迫处理的转基因拟南芥叶片，在液氮中研磨成粉末，力口 入⑶S蛋白提取缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液、Ph = 7. OlOmM Na. EDTA、0. 1% Triton X-100、 ΙΟΟπιΜβ-巯基乙醇）混匀。4°C 13000rpm离心10分钟，取上清用于⑶S酶活分析。⑶S酶 活高低用GUS蛋白粗提液催化底物4-甲基伞形酮-β -D-葡糖醛酸苷（4-MUG)生成产物四 甲基伞形酮（4-MU)的量进行测定。用多功能酶标仪Varioskan Flash(Thermo公司）测定 荧光值，用酶标仪Model680 (Bio-Rad公司）以考马斯亮蓝法测定GUS蛋白粗提液中总蛋白 含量。测定结果显示：香蕉MaPIPl ;1启动子能够增强基因的表达，同时该启动子也受干旱 和高盐胁迫诱导表达。
[0098] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【权利要求】
1. 一种香蕉水通道蛋白基因启动子，其特征在于；其核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。
2. 用于获得权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因启动子的引物对，其特征在于；所述 引物对为： 正向兼并引物：5'-阶11^5了'^56161'1'-3'； 三轮反向引物： 第一轮反向引物prl : 5' -AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'； 第二轮反向引物pr2 : 5,-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3，； 第三轮反向引物pr3 : 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。
3. -种权利要求1或2所述香蕉水通道蛋白基因启动子的获得方法，其特征在于：以 具有香蕉水通道蛋白基因的香蕉基因组DNA为模板，采用以下引物对： 正向兼并引物：5'-阶11^5了'^56161'1'-3'； 三轮反向引物： 第一轮反向引物prl : 5' -AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'； 第二轮反向引物pr2 : 5,-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3，； 第三轮反向引物pr3 : 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。 进行三轮PCR扩增，其所获得的香蕉水通道蛋白基因启动子为SEQ IDNO. 1。
4. 一种重组表达载体，其特征在于：它含有权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因启动 子的植物表达载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，所述植物表达载体为pCAMBIA1304。
6. -种权利要求4或5所述重组表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 以香蕉水通道蛋白基因启动子SEQ IDNO. 1为模板设计引物对，且引物对分别上加 ECORI、SPeI酶切位点和保护碱基，如下： 正向引物Pl : 5'-CGGAATTCATCGAGTATGGTGTTCCTATGCT-3' ， 反向引物P2 : 5'-GGACTAGTCTATCACTATCTATCTCCCCTGT-3' ； 2) 以香蕉水通道蛋白基因启动子SEQ IDNO. 1为模板进行PCR，PCR扩增条件如下： 94°C预变性3min ;94°C变性40s、55°C退火40s、72°C延伸40s，共35个循环；72°C延伸 8min ;获得PCR产物； 3) 用ECORI、SPe I将PCR产物进行酶切，纯化回收；同时，用ECORI、SPe I将pCAMB IA1304 载体进行双酶切，去除CaMV35S启动子，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收大片段； 4) 在10 ill体系中，将回收的pCAMBIA1304载体大片段和回收的PCR产物用T4连接酶 4°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将筛选得到的阳性克隆用EC0RI、 SPeI进行酶切验证，获得得到表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1304 :MaPIPl ; l-Promoter。
7. 含有权利要求4和5所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为 农杆菌EHA105。
8. 下述各项之一在培养干旱性和盐害性植物中的应用，其特征在于： (1) 权利要求1所述的启动子； (2) 权利要求4或5所述的重组表达载体； (3) 权利要求7所述的农杆菌EHA105。
9. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的植物为拟南芥。
10. -种培育具有干旱性和盐害性的转基因植物的方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 启动子克隆； 2) 植物表达载体构建； 3) 受体的遗传转化； 4) 阳性转基因植株的鉴定； 5) 抗旱性和耐盐性表型及生理分析。
【文档编号】A01H5/00GK104313026SQ201410488543
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】许奕, 金志强, 徐碧玉, 刘菊华, 贾彩红, 张建斌, 胡伟, 苗红霞, 王卓, 王甲水, 李羽佳, 王安邦, 宋顺 申请人:中国热带农业科学院海口实验站