一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其制备方法。本发明通过液体高密度发酵，固体发酵，低温烘干等易于工业化生产的生产工艺，生产高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂产品。按照本发明的方法制备得到的酿酒酵母微生物制剂，其每克含活菌数20～40亿个，杂菌率低，尤其是该酿酒酵母微生物制剂中的酿酒酵母的谷胱甘肽产量高，可达400mg/kg以上，转化率高、生产速率快的。本发明方法的菌种易于培养，原料来源方便廉价，反应条件温和、反应步骤简单，成本低廉。制备得到的酿酒酵母制剂用作微生物饲料添加剂，能够促进动物的生长。
【专利说明】一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于饲料领域，具体涉及一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其制备方法。
【背景技术】
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[0002]酿酒酵母是我国农业部允许作为饲料添加剂的菌种之一，其已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。酿酒酵母其代谢产物富含氨基酸、维生素B、蛋白质和多种酶等多种生理活性成分，尤其是含有丰富的谷胱甘肽(glutath1ne，GSH)，它是一种含Y _酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。酵母菌及其代谢产物能够提高动物抗氧化能力，增强动物免疫功能，提高动物抗病能力等，这些特性对保护动物肠粘膜、调节免疫系统、促进氨基酸、葡萄糖等营养物质消化吸收，增强动物抗氧化能力，提高动物的饲料转化率和防病促进生长起到重要作用。
[0003]因此在饲料中添加高产谷胱甘肽的酵母菌是一个十分绿色健康的选择。
[0004]目前国内外生产谷胱甘肽的方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法、酶法，液体发酵法是当前生产谷胱甘肽的主要方法，普遍使用的菌种是酵母菌，应用微生物液体发酵的方法生产谷胱甘肽比较易于工业化，但其制备的酿酒酵母微生物制剂中，损失了酵母菌产生的所有代谢产物,仅保留酵母菌菌体,并且产量低,价格较高，同时添加到饲料中会提高饲料成本，制约其大规模使用。
【发明内容】
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[0005]本发明旨在提供一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其制备方法，利用该方法制备的酿酒酵母微生物制剂，其谷胱甘肽含量高、转化率高、生产速率快，并且该方法反应条件温和，反应步骤简单，成本低廉。
[0006]本发明的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007]a、菌种活化:将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139活化后转接到YEPD液体培养基中，28 ± I °C培养至菌浓度为1.0X107cfu/mL?2.0X108cfu/mL，形成种子培养液；
[0008]b、将种子培养液以质量百分比3%?5%的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度28 ± I °C，搅拌速率200?350rpm，通气量0.8?0.9V/V -min,溶氧浓度80?90%，发酵至酿酒酵母生长到对数生长期，将此对数生长期的菌液作为一级种子液；
[0009]C、将一级种子液以质量百分比2?10%的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度28土 1°C，搅拌速率150?250rpm，通气量0.8?0.9V/
V-min,溶氧浓度70?80%，发酵至酿酒酵母生长到对数生长期，将此对数生长期的菌液作为二级种子液；
[0010]d、在无菌环境中，将二级种子液以质量百分比2?10%的接种量接入麸皮固体培养基中，混合均匀，控制通风量为:3?10换气次数/小时，温度25?32°C，湿度80%?90%条件下培养60?72小时，培养期间翻动麸皮固体培养基，经半成品检验，每克湿菌体含活菌数20亿?40亿个活菌，30-45°C干燥处理后，得到高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂；
[0011]所述的一级和二级发酵培养基都为:每升含有葡萄糖5?30g、蔗糖2?20g、糖蜜2?30g、NaC13?10g、蛋白胨5?20g、磷酸氢二钾l_15g，余量为水，ρΗ6.0±0.2 ；
[0012]所述的麸皮固体培养基为:按总质量分数100%计，由麸皮38%?50%、豆柏10%?23%、尿素0.1%?0.5%、氯化铵0.1%?0.5%和水38%?51%组成。
[0013]该高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂经包装，成品检测，储存，可作为商品出售。
[0014]所述的将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139活化优选为将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GIM2.139划线接种到麦芽汁琼脂培养基试管斜面,28°C培养24小时。
[0015]所述的步骤d的培养期间翻动麸皮固体培养基优选每隔3?5小时翻动一次。
[0016]所述的麦芽汁琼脂培养基属于现有技术中的常规培养基，其配方为:每升含有麦芽膏粉130g,琼脂20g,氯霉素0.1g,余量为水，ρΗ6.0?6.2。
[0017]所述的YEro液体培养基属于现有技术中的常规培养基，其配方为:每升含有酵母粉1g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸懼水100mL, pH自然，115°C湿热灭菌20min。
[0018]本发明相比于现有技术，具有优点:
[0019]按照本发明的方法制备得到的酿酒酵母微生物制剂，其每克含活菌数20?40亿个，杂菌率低，尤其是该酿酒酵母微生物制剂中的酿酒酵母的谷胱甘肽产量高，可达400mg/kg以上，转化率高、生产速率快的。本发明方法的菌种易于培养，原料来源方便廉价，反应条件温和、反应步骤简单，成本低廉。制备得到的酿酒酵母制剂用作微生物饲料添加剂，能够促进动物的生长。
【专利附图】
【附图说明】
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[0020]图1是实施例1中一级发酵中的酿酒酵母生长曲线图；
[0021]图2是实施例1中二级发酵中的酿酒酵母生长曲线图。
【具体实施方式】
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[0022]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0023]实施例1:
[0024]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GIM2.139 (保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号GIM2.139，该菌种对外销售，可以购买到)的冻干种上挑取一环菌体接种至麦芽汁琼脂培养基试管斜面培养基中，28°C培养24小时；再将试管斜面种子转接到YEH)液体培养基中，28°C培养24h，形成种子培养液，其菌浓度为1.0X108cfu/mL。所述的麦芽汁琼脂培养基的配方为:每升含有麦芽膏粉130g，琼脂20g，氯霉素0.lg，余量为水，pH6.0?6.2，115°C高压灭菌20min。YETO液体培养基配方为:每升含有酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g,蒸懼水100mL, pH自然，115°C湿热灭菌20min。
[0025]将种子培养液以质量百分比5%的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70 %，发酵温度28土 1°C，搅拌速率200rpm，通气量0.8?0.9V/
V.min，溶氧浓度85?90%，自接种后每2h取样一次测560nm的吸光值，用未接种的培养基作为空白对照，制作酿酒酵母生长曲线图(图1)，由曲线可知酿酒酵母在8?12h菌数急剧增加，表明菌体已经到达对数生长期，取用发酵时间为8小时的菌液制成一级种子液；将一级种子液以10%的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70 %，发酵温度28 ± I °C，搅拌速率250rpm，通气量0.8?0.9V/V -min,溶氧浓度70?80%，自接种后每2h取样一次测560nm的吸光值，用未接种的培养基作为空白对照，制作酿酒酵母生长曲线图(图2)，由曲线可知酿酒酵母在12?25h菌数急剧增加，表明菌体已经达到对数生长期，因此取用该时期的菌液得到二级种子液，本实施例中选取的是发酵时间为16小时的菌液作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为，每升含有葡萄糖10g、鹿糖20g、糖蜜15g、NaC13g、蛋白胨5g、磷酸氢二钾5g,余量为水，pH6.0±0.2,将上述组份混合均匀后，121°C高压灭菌30min。
[0026]接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积:25m2，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级种子液以质量百分比3%的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为:10换气次数/小时，温度280C，湿度为80?90%的条件下培养60小时，培养期间每隔3小时翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂。所述的麸皮固体培养基，按总质量分数100 %计，由麸皮38 %、豆柏23%、尿素0.5%、氯化铵0.5 %和水38 %组成，原料混合，搅拌均匀。然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机，压力，温度分别为:1.05?1.3Kg/cm3，121?125°C条件下，灭菌30?40min,冷却至40?50°C分装浅盆,每盆5kg,备用。
[0027]一、活菌数和杂菌率的检测:
[0028]1、平板菌落计数法
[0029]1.1、称取本实施例的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂1g作为样品，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床200rpm振荡20min，静置20?30S，制成样品悬液。
[0030]1.2、用Iml无菌吸管吸取ImL样品悬液，放入盛有9mL灭菌水的试管中，充分振摇使混合均匀，即制成1:100均匀稀释液。
[0031]1.3、用ImL无菌吸管吸取1:100稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌水试管内，振摇试管，混合均匀，做成1:1000的稀释液。另取ImL灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液，分别制成10_4、10_5、10_6……10_9梯度稀释液，如此每递增稀释一次，即换用I支ImL灭菌吸管。
[0032]1.4、选择2-3个适宜稀释度(一般取10_6、10_7、10_8)，用灭菌100^微量移液器，各取0.1mL接种于已制备好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平皿内，每个稀释度做3个平板，用无菌推棒均匀涂于整个表面。
[0033]1.5、将平皿倒置于28°C ± I °C恒温培养箱内培养48h±2h后，选取菌落数在30-300之间的平板计数。
[0034]2、酿酒酵母菌菌落形态
[0035]形态特征:乳白色，圆形，隆起，外形光滑，不透明，边缘整齐。
[0036]3、菌落计数
[0037]3.1、稀释度的选择
[0038]3.1.1、应选择平均菌落在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。
[0039]3.1.2、若有两个稀释度。其生长的菌落数均在30-300之间，则视两者之间如何来决定若其
[0040]比小于或等于2，应报告其平均数；若大于2，则报告其中较小的数字。
[0041]3.1.3、若所有稀释度的平均菌落数均大于300。则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
[0042]3.1.4、若所有稀释度平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
[0043]3.2、可疑菌落鉴定
[0044]3.2.1随机挑选5个菌落进行鉴定，包括菌落形态、菌体形态和子囊孢子形态显微镜观察，以及生理生化鉴定。其操作方法参见《酵母菌鉴定与分类手册》(1991年出版)。
[0045]3.2.2鉴定结果
[0046]菌落形态:菌落大而湿润，隆起，乳白色，表面光滑无皱褶，边缘清晰。
[0047]菌体形态:菌体于显微镜下观察，细胞呈卵圆形、椭圆形或圆形。
[0048]子囊孢子形态:子囊孢子于显微镜下观察，呈光滑的圆形或卵圆形。
[0049]生化鉴定:酿酒酵母能发酵葡萄糖，麦芽糖，不能发酵乳糖，不能同化硝酸盐。
[0050]3.2.3菌落数的报告
[0051]挑取菌落总数在30-300之间的平板计数，随机挑取5个可疑菌落鉴定后，根据以下公式计算得出每克样品中酿酒酵母菌数，公式为:
[0052]A = BXC/5XfX10
[0053]式中:
[0054]A一测定的酿酒酵母菌落数,单位为cfu/g ；
[0055]B—同一稀释度三次重复的可疑酿酒酵母平均菌落数；
[0056]C-5个鉴定的菌落中确认为酿酒酵母的菌落数；
[0057]f—稀释倍数；
[0058]10—转换因子。
[0059]杂菌率(％ )=杂菌总数/(酿酒酵母活菌数+杂菌总数)
[0060]将本实施例的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂进行检验发现，其每克含活菌数30亿个活菌，杂菌率0.05%。
[0061]酿酒酵母产谷胱甘肽:将高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂中的酿酒酵母接入麸皮固体培养基，接种量为重量百分比:2%，温度28°C，培养60小时。将经过上述发酵固形物溶于水中，85°C水浴15min,于离心机中5000rpm离心10?15min。取上清液用DTNB (5-硫代-2-硝基苯甲酸)法测定谷胱甘肽含量，测得谷胱甘肽含量达500mg/kg以上。
[0062]将此高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂经30_45°C真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。
[0063]实施例2:
[0064]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GIM2.139 (保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号GIM2.139，该菌种对外销售，可以购买到)的冻干种上挑取一环菌体接种至麦芽汁琼脂培养基试管斜面培养基中，28°C培养24小时；再将试管斜面种子转接到YEH)液体培养基中，28°C培养24h，形成种子培养液，其菌浓度为8.0X107cfu/mL。所述的麦芽汁琼培养基的配方为:每升含有麦芽膏粉130g，琼脂20g，氯霉素0.1g,余量为水，pH6.0?6.2，115°C高压灭菌20min。YETO液体培养基配方为:每升含有酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g,蒸懼水100mL, pH自然，115°C湿热灭菌20min。
[0065]将种子培养液以质量百分比3%的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70 %，发酵温度28土 1°C，搅拌速率350rpm，通气量0.8?0.9V/
V.min，溶氧浓度85?90%，发酵时间为10小时的菌液(已进入对数生长期)制成一级种子液；将一级种子液以质量百分比10%的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70 %，发酵温度28土 1°C，搅拌速率150rpm，通气量0.8?
0.9V/V.min，溶氧浓度70?80%，发酵时间为22小时的菌液(已经进入对数生长期)作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为，每升含有葡萄糖30g、蔗糖10g、糖蜜30g、NaC15g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾lg，余量为水，pH6.0±0.2，将上述组份混合均匀后，121°C高压灭菌30min。
[0066]接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积:25m2，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级种子液以10% (质量百分比)的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为:10换气次数/小时，温度25°C，湿度为80?90%的条件下培养72小时，培养期间每隔3小时翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂。所述的麸皮固体培养基，按总质量分数100%计，含有麸皮38.8 %、豆柏10 %、尿素0.1 %、氯化铵0.1 %和水51%组成，原料混合，搅拌均匀。然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机，压力，温度分别为:1.05?1.3Kg/cm3,121?125°C条件下,灭菌30?40min,冷却至40?50°C分装浅盆,每盆5kg,备用。
[0067]按照实施例1的方法，将本实施例的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂进行检验发现，其每克含活菌数20亿个活菌，杂菌率0.08%。
[0068]酿酒酵母产谷胱甘肽:将高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂中的酿酒酵母接入麸皮固体培养基，接种量为重量百分比:4%，温度25°C，培养70小时。将经过上述发酵固形物溶于水中，85°C水浴15min,于离心机中5000rpm离心10?15min。取上清液用DTNB (5-硫代-2-硝基苯甲酸)法测定谷胱甘肽含量，测得谷胱甘肽含量达400mg/kg以上。
[0069]将此高产谷胱甘肽酿酒酵母经30_45°C真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。
[0070]实施例3:
[0071]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GIM2.139 (保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号GIM2.139，该菌种对外销售，可以购买到)的冻干种上挑取一环菌体接种至麦芽汁琼脂试管斜面培养基中，28°C培养24小时；再将试管斜面种子转接到YEH)液体培养基中，28°C培养24h，形成种子培养液，其菌浓度为1.0X107cfu/mL。所述的麦芽汁琼培养基的配方为:每升含有麦芽膏粉130g，琼脂20g，氯霉素0.lg，余量为水，pH6.0?6.2，115°C高压灭菌20min。YEH)液体培养基配方为:每升含有酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸懼水100mL, pH自然，115°C湿热灭菌20min。
[0072]将种子培养液以质量百分比4%的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70 %，发酵温度28土 1°C，搅拌速率350rpm，通气量0.8?0.9V/
V.π?η，溶氧浓度80?90%，发酵时间为12小时的菌液(已经进入对数生长期)制成一级种子液；将一级种子液以质量百分比2%的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70 %，发酵温度28土 1°C，搅拌速率150rpm，通气量0.8?
0.9V/V.min，溶氧浓度70?80%，发酵时间为14小时的菌液(已经进入对数生长期)作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为，每升含有葡萄糖5g、蔗糖2g、糖蜜2g、NaC110g、蛋白胨20g、磷酸氢二钾15g，余量为水，pH6.0±0.2，将上述组份混合均匀后，121°C高压灭菌30min。
[0073]接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积:25m2，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级种子液以质量百分比2%的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为:3换气次数/小时，温度32°C，湿度为80?90%的条件下培养65小时，培养期间每隔5小时翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂。所述的麸皮固体培养基，按总质量分数100%计，含有麸皮50%、豆柏10.4%、尿素0.3%、氯化铵0.3%和水39%组成，原料混合，搅拌均勻。然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机，压力，温度分别为:1.05?1.3Kg/cm3,121?125°C条件下,灭菌30?40min,冷却至40?50°C分装浅盆,每盆5kg,备用。
[0074]按照实施例1的方法，将本实施例的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂进行检验发现，其每克含活菌数25亿个活菌，杂菌率0.02%。
[0075]酿酒酵母产谷胱甘肽:将高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂中的酿酒酵母接入麸皮固体培养基，接种量为重量百分比:8%，温度32°C，培养65小时。将经过上述发酵固形物溶于水中，85°C水浴15min,于离心机中5000rpm离心10?15min。取上清液用DTNB (5-硫代-2-硝基苯甲酸)法测定谷胱甘肽含量，测得谷胱甘肽含量达400mg/kg以上。
[0076]将此高产谷胱甘肽酿酒酵母经30_45°C真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。
【权利要求】
1.一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: a、菌种活化:将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GIM2.139活化后转接到YEF1D液体培养基中，28 ± I °C培养至菌浓度为1.0X107cfu/mL?2.0X108cfu/mL，形成种子培养液； b、将种子培养液以质量百分比3%?5%的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度28土 1°C，搅拌速率200?350rpm，通气量0.8?0.9V/V.min,溶氧浓度80?90%，发酵至酿酒酵母生长到对数生长期，将此对数生长期的菌液作为一级种子液； C、将一级种子液以质量百分比2?10%的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度28 ± I °C，搅拌速率150?250rpm，通气量0.8?0.9V/V -min,溶氧浓度70?80%，发酵至酿酒酵母生长到对数生长期，将此对数生长期的菌液作为二级种子液； d、在无菌环境中，将二级种子液以质量百分比2?10%的接种量接入麸皮固体培养基中，混合均匀，控制通风量为:3?10换气次数/小时，温度25?32 °C，湿度80 %?90 %条件下培养60?72小时，培养期间翻动麸皮固体培养基，30-45°C干燥处理后，得到高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂； 所述的一级和二级发酵培养基都为:每升含有葡萄糖5?30g、蔗糖2?20g、糖蜜2?30g、NaCl 3?10g、蛋白胨5?20g、磷酸氢二钾l_15g，余量为水，pH6.0±0.2 ； 所述的麸皮固体培养基为:按总质量分数100%计，由麸皮38%?50%、豆柏10%?23%、尿素0.1%?0.5%、氯化铵0.1%?0.5%和水38%?51%组成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GIM2.139 活化为将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139 划线接种到麦芽汁琼脂培养基试管斜面，28°C培养24小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤d的培养期间翻动麸皮固体培养基为每隔3?5小时翻动一次。
4.一种按照权利要求1、2或3所述的制备方法制备得到的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂。
【文档编号】A23K1/16GK104286415SQ201410519741
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】许国焕, 张丽, 陈亚剑, 程炜轩, 郭莹姿, 魏逸峰, 梁建庆, 谭文俊 申请人:广东省微生物研究所, 广东碧德生物科技有限公司