拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2在调控植物花期转换中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因，AtCDKG2，在调控植物花期转换中的应用。实验发现AtCDKG2基因发生缺失突变后会导致拟南芥开花时间提前，利用转基因技术在拟南芥中过表达AtCDKG2基因后，明显推迟了过表达转基因株系的开花时间，并且AtCDKG2对拟南芥花期转换的负调控作用不受光周期的影响。植物的开花时间与产量品质密切相关，本发明提供的AtCDKG2基因在调控植物花期转换中的应用，有望通过控制该基因的表达，缩短或增长植物营养生长的时间，为加快育种或提高作物生长量，有望在农作物品种改良以及作物产量或品质提升上提供帮助和支持，对农业生产具有重要意义。
【专利说明】拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2在调控植物花期转换中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因的功能及应用，尤其涉及拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2在调控植物花期转换中的应用，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002]Q3KG2属于细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,(DKs)的G类亚家族，G类亚家族有两个成员，CDKGl和CDKG2，他们含有保守的PLTSLRE基序(Menges M etal.Global analysis of the core cell cycle regulators of Arabidopsis identifiesnovel genes,reveals multiple and highly specific profiles of express1n andprovides a coherent model for plant cell cycle control.The Plant Journal，2005)。已有研究表明，AtCDKGl参与CalS5基因的前体mRNA的剪接，进而参与到花粉壁早期形成的调控过程，敲除拟南芥的⑶KGl基因后会导致雄性育性的严重下降(Huang etal.CYCLIN-DEPENDENT KINASE Glis Associated with the Spliceosome to RegulateCALL0SE SYNTHASE5 Splicing and Pollen Wall Format1n in Arabidopsis.The PlantCell Preview, 2013)0
[0003]芯片数据显示，AtCDKG2在种子初级休眠的末期及次级休眠的初期表达量相对较高，推测AtCDKG2可能在调控种子休眠过程中起作用。在叶片中，AtCDKG2的表达量在保卫细胞中要明显高于叶肉细胞，而且在保卫细胞中At⑶KG2的表达并不受ABA诱导，推测该基因不参与ABA对气孔运动的调控作用。经检索，拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2在植物花期转换调控中的作用及应用目前未见报道。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2在调控植物花期转换中的应用。
[0005]本发明所述拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2在调控植物花期转换中的应用。
[0006]其中:所述拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2的序列已公布(基因编号为NW_001843868.1);所述植物是指十字花科植物，优选拟南芥、油菜或白菜。
[0007] 申请人:前期以cdkg2-l和cdkg2-2突变体为实验对象，发现无论是在长日照还是短日照条件下，cdkg2-l和cdkg2-2突变体均表现出早花性状。进一步通过RT-PCR技术克隆到拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2，构建该基因的植物过表达载体，并进行植物转基因操作，获得转基因植物。结果发现At⑶KG2基因过表达后明显推迟了植物的开花时间。
[0008]基于上述结果， 申请人:初步确认了一个拟南芥的开花抑制因子AtCDKG2，当AtCDKG2基因发生缺失突变后能促进拟南芥提前开花。进一步实验证实:利用转基因技术在拟南芥中高表达拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2，通过观察过表达植株的开花时间发现，At⑶KG2过表达后显著延长了植物的开花时间。
[0009]植物的开花时间与产量品质密切相关，本发明提供的拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2在调控植物花期转换中的应用，有望在农作物品种改良以及作物产量或品质提升上提供帮助和支持，对我国的农业生产具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1:细胞周期依赖性蛋白激酶基因⑶KG2的表达模式分析。
[0011]⑶S染色的结果表明，⑶KG2在干种子中的表达量很高(见图1-1 )，种子萌发后表达量降低，并且在早期幼苗的子叶中几乎没有表达(见图1-1KIIKIV ) O随着幼苗的生长，叶片中开始有表达，在微管组织、叶原基、根尖及侧根发生处表达量较高(见图1- V、V1、vn、wi)。⑶KG2在花组织中也有表达，其中柱头、花柄及雄蕊柄部的表达量较高，并且在成熟果荚中的表达量要高于幼嫩果荚(见图1-ΙΧ、Χ、ΧΙ、ΧΠ)。在拟南芥的不同生长阶段CDKG2的表达量是不一样的，它在花组织的表达量较高预示着CDKG2在植物的花期转换中起作用。
[0012]图2:cdkg2突变体与⑶KG2过表达株系在短日照条件下的开花情况。
[0013]其中，Col-O为野生型对照，cdkg2-l (SALK_012428)和 cdkg2_2 (SALK_090262)为两个突变体株系，均购自 ABRC(Arabidopsis B1logical Resource Center), VC 为空载体转化对照株系，OEl和0E2为两个⑶KG2的转基因过表达株系。短日照条件下，cdkg2_l和cdkg2-2突变体的抽薹时间明显早于野生型Col-O (见图2-A)。相反，两个⑶KG2过表达株系的抽薹时间则晚于空载体对照(见图2-B)。该性状说明，AtCDKG2基因在拟南芥的花期转换过程中起负调控作用。
[0014]图3:cdkg2突变体中开花相关基因的表达情况。
[0015]Realtime-PCR结果显示，自主开花途径中开花抑制基因FLC的上游基因:FCA、FY、FPA、LD、FLD及FLK等在野生型Col-O和突变体cdkg2_l，cdkg2_2中的表达量没有明显区别(见图3-A)。开花抑制基因FLC在突变体cdkg2-l和cdkg2-2中的表达降低，开花途径整合因子FT以及花分生组织特异基因APl和LFY在突变体cdkg2-l和cdkg2-2中的表达量高于野生型Col-O (见图3-B)。因此，我们推测拟南芥细胞周期依赖性蛋白At⑶KG2位于开花抑制基因FLC的上游，通过调控FLC的表达进而抑制植物开花。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例用于阐明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照产品制造生产厂商的使用说明。
[0017]实施例1拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因CDKG2的分子克隆
[0018]1.拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因⑶KG2的克隆
[0019]根据已公布的拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因At⑶KG2的cDNA序列(基因编号为NW_001843868.1)设计引物，其中:
[0020]正向引物为CDKG2-F: 5，-ATTGTTCAATGGGAAAACGG-3’ ；[0021 ]反向引物为 CDKG2-R: 5’ -TTCACAAATCACCACGGACC-3’。
[0022]利用TRIzol试剂盒(Roche)提取野生型拟南芥RNA，RT-PCR方法扩增AtCDKG2基因的全长 CDS 序列。RT-PCR 扩增程序如下:94°C 4min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 90s，共 35个循环；最后72°C延伸lOmin。将获得的At⑶KG2基因cDNA经过回收、连接等操作克隆到pEASY-Blunt (Trans Gen)中间载体上，然后进行中间载体的基因全长PCR验证和双酶切验证，最后进行序列测定，获得cDNA正确序列。
[0023]2.拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2的序列信息与特性分析
[0024]AtCDKG2基因的编码区cDNA为2275bp。数据库预测，CDKG2具有丝/苏氨酸或酪氨酸蛋白激酶及一个类似Dehydrin功能结构域。
[0025]实施例2拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因CDKG2的表达模式分析
[0026]1.35S::CDGK2::GFP瞬时表达载体的构建
[0027]用BamH I和Sal I双酶切中间载体获得⑶KG2全长序列，连接于pBI121_GFP载体上，得到35S::CDGK2::GFP瞬时表达载体。使用MN除内毒素中量质粒提取试剂盒，提取质粒并转化野生型拟南芥叶肉原生质体，室温孵育16h，用激光共聚焦显微镜488nm波长下观察⑶KG2::GFP融合蛋白亚细胞情况。结果表明，⑶KG2主要在细胞核内表达。
[0028]2.⑶S染色分析
[0029](I)启动子序列克隆
[0030]设计引物，使用高保真酶Fast PFU从叶基因组DNA中克隆ATG上游2045bp的启动子序列(ATG前4个碱基克隆)，将PCR产物直接与pEASY-Blunt载体连接转化大肠杆菌DH5 α，经卡那抗生素筛选后直接挑取菌落进行菌落PCR，阳性克隆提取质粒后进行酶切验证，挑取酶切正确菌落送公司测序。
[0031 ] (2) pCDKG2:: GUS 载体构建
[0032]将P⑶KG2序列酶切回收，与酶切回收过的pCambia-UW Gus连接转化大肠杆菌DH5a,经卡那抗性筛选后，挑取长出的阳性克隆进行菌落PCR，并提取质粒进行酶切验证。
[0033](3)获得转基因拟南芥
[0034]提取PCR及酶切鉴定正确的P⑶KG2::⑶S质粒，转化农杆菌EHA105，菌落PCR检测阳性菌落，将鉴定正确的菌落扩大培养，并转化Col-O野生型拟南芥。收取Tl代种子，播种在含30 μ g/mL潮霉素抗性的MS培养基平板上，培养10天左右观察，具有潮霉素抗性的、成功转化外源基因的阳性植株可以长出真叶和正常的根，而阴性的苗不能萌发或只能长出子叶和很短的根。将阳性苗移至营养土中，待生长至4-6真叶期，剪取少许叶片提取DNA，PCR检测转基因株系。
[0035](4)⑶S染色分析
[0036]收获到CDKG2启动子+GUS融合基因转化的种子后，分别对种子、幼苗、花序等组织器官进行GUS染色，分析CDKG2启动子组织特异性表达情况。首先，对种子正常萌发过程进行分析。结果可以发现，P⑶KG2在干种子高表达，一旦浸润，表达量明显下降。种子开始萌发后，其表达局限在胚根尖端，随着胚根伸长，其表达量有所下降(见图1- 1、I1、II1、IV)。对幼苗进行⑶S染色，染色结果，P⑶KG2在根、茎顶端分生组织，微管组织，侧根发生区等局部高表达(见图1-V、V1、Vn、VDI)。花组织及果荚染色结果得知，P⑶KG2表达特点为:成熟组织表达量较幼嫩组织表达量要高(如花粉、花瓣、花柄及雄蕊柄等)，在柱头、成熟花粉、雄蕊柄、微管组织局部表达量较高(见图1-ΙΧ、Χ、ΧΙ、ΧΠ)。
[0037]实施例3拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因CDKG2的转基因应用
[0038]1.pSTART-CDKG2表达载体的构建
[0039]将测序正确的AtCDKG2-pEASY_Blunt质粒酶切，将回收到的目的片段与酶切后的PSTART载体连接，转化大肠杆菌DH5 α，在卡那抗性培养基上筛选阳性菌落，并对阳性菌落进行PCR及双酶切验证。
[0040]2.获得转基因植株
[0041 ] 提取构建好的pSTART-CDKG2质粒，转化农杆菌ΕΗΑ105，PCR检测阳性菌落，将阳性菌落扩大培养，并转化Col-O野生型拟南芥。收取Tl代种子，播种在含50 μ g/mL卡那抗性的MS培养基上，培养十天左右观察，具有抗性的阳性植株可以长出绿色真叶，未成功转化的阴性苗不长真叶或真叶呈现黄色。将阳性苗移至营养土中，培养两周后，剪取少许叶片提取DNA，利用PCR检测。鉴定出阳性苗后继续筛选，直至获得转基因纯合株系。
[0042]3.转基因植株分子鉴定
[0043]对获得的纯合转基因株系进行基因表达水平的检测。首先，提取转基因植株和野生型植株的总RNA，利用RT-PCR方法，分析过表达转基因植株和野生型植株的CDKG2基因表达差异。筛选⑶KG2表达量明显高于野生型植株的过表达转基因株系进行开花相关生理性状分析。
[0044]4.CDKG2基因的功能验证
[0045](I)对突变体 cdkg2-l(SALK_012428)和 cdkg2_2 (SALK_090262)以及转基因过表株系OEl和0E2进行开花性状分析
[0046]首先将表面消毒的突变体、过表达及野生型和空载体对照种子铺到1/2MS培养基上，4°C黑暗春化3天后放到温室继续培养。2周后挑选大小长势一致的幼苗移到土中，在短日照温室培养，观察他们的开花时间和抽薹时的叶片数目。
[0047]在短日照条件下,突变体cdkg2_l和cdkg2_2的开花时间明显早于野生型对照，突变体的抽薹时间为22天，野生型对照的抽薹时间约为27天(见图2-A)。相应地，抽薹时突变体的莲座叶数目也比野生型的莲座叶数目要少3片左右。CDKG2过表达株系的开花时间比空载体对照的开花时间要晚(见图2-B)。长日照条件下，突变体的早花性状及过表达的晚花性状与短日照条件下表现一致。这说明拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因⑶KG2参与开花抑制途径，并且CDKG2对开花的抑制作用是不受光周期调控的。
[0048](2)分析一系列开花相关基因的表达情况，进一步确定DCKG2基因在植物花期转换中的作用。
[0049]植物的开花途径主要有四条，光周期途径、春化途径、赤霉素途径和自主途径。我们根据实验结果推测CDKG2主要是通过自主途径来调控植物的开花时间。为了进一步明确CDKG2抑制植物开花的分子机理，我们借助实时定量PCR研究了一下突变体中自主途径相关基因的表达情况。我们选取抽薹后的野生型和突变体拟南芥的地上部分为实验材料，利用TRIzoI试剂盒提取拟南芥RNA，并以反转录获得的cDNA为模板进行Realtime-PCR。
[0050]结果发现，突变体中开花抑制基因FLC的表达降低，自主开花途径中位于开花抑制基因FLC上游的基因:FCA、FY、FPA、LD、FLD及FLK等在野生型和突变体中的表达量则没有明显区别(见图3-A)。开花途径整合因子FT以及花分生组织特异基因APl和LFY在突变体中的表达量高于野生型(见图3-B)。实时定量PCR结果表明，细胞周期依赖性蛋白⑶KG2确实参与自主开花途径并通过调控FLC的表达，影响了开花途径整合因子及花分生组织特基因的表达，进而抑制植物开花。
[0051]基于上述实验，证实⑶KG2确为一个开花抑制因子，⑶S染色发现该基因在花组织以及果荚中有表达，预示着CDKG2可能在植物的开花过程中起某种作用。进一步实验发现当CDKG2基因发生缺失突变后导致植物提前开花，也就是说CDKG2在植物的花期转换中起负调控作用。实时定量PCR结果表明，CDKG2通过参与自主开花途径来调控FLC的表达，进而影响了开花途径整合因子及花分生组织特基因的表达，抑制植物开花。随后我们利用转基因技术在植物中高表达CDKG2基因，观察过表达植株的开花时间发现，CDKG2过表达后推迟了植物开花。植物的开花时间与其产量及品质密切相关，本发明所述的应用有望通过该基因的表达，缩短或增长植物营养生长的时间，为加快育种或提高作物生长量，以达到其高产优质的目的提供帮助和支持。
【权利要求】
1.拟南芥细胞周期依赖性蛋白激酶基因AtCDKG2在调控植物花期转换中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述植物是十字花科植物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述十字花科植物是拟南芥、油菜或白菜。
【文档编号】A01H5/00GK104388447SQ201410714134
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】张伟, 王美, 马晓艳, 周瑞佳, 杨维国, 陈冬花, 李春龙, 张尚立 申请人:山东大学