一种培养表面多脂植物外植体的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其是植物组织培养技术领域，具体涉及一种培养表面多脂植物外植体的方法。

背景技术：

杨树属于杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L.)植物，为多年生木本乔木。杨树不仅是重要的造林绿化树种和工业用材树种，而且还是多年生林木基因工程的模式树种。因此，获得大量无菌的外植体是进行杨树组织快繁和基因工程研究的前提和基础。

在常规的植物组织培养中，外植体的消毒方法一般是先用自来水冲洗去除表面泥土，用酒精消毒30秒到1分钟，再用10％次氯酸钠或0.1％生汞消毒几分钟到十几分钟，无菌水冲洗后进行接种。

杨树树种的冬眠芽在萌发时分泌大量树脂，新生枝条、顶芽及侧芽表面也覆盖树脂。因此，对于杨树等表面多脂植物的全外植体而言，目前常规的采用水溶性消毒液进行消毒灭菌的方式，无法溶解外植体表面的树脂，常常导致外植体消毒不彻底、污染率较高或者消毒过度致使外植体死亡等情况发生。然而，针对表面多脂植物有效的消毒灭菌方式尚无报道，因此亟待开发一种针对杨树等表面多脂植物的高效安全消毒方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，为改善常规消毒灭菌方式无法彻底溶解杨树等外植体表面树脂的不足，提供了一种新的培养表面多脂植物外植体的方法，该方法不仅能溶解杨树等外植体表面的树脂，还能有效清除杨树等表面多脂植物外植体表面的细菌及真菌，使外植体保持充足的活力。

为此，本发明一方面提供了一种用于对表面多脂植物的外植体进行处理的溶脂混合液，其为0.1％的吐温20和10％的乙酸乙酯的水溶液，其中表面多脂植物优选为杨树，更加优选为欧洲黑杨。

本发明另一方面提供了采用本发明所述的溶脂混合液对表面多脂植物的外植体进行处理的方法，其中包括采用溶脂混合液对外植体分别进行预处理和二次处理的步骤，所述预处理为采用溶脂混合液处理外植体2-3分钟，用无菌水冲洗外植体1次，所述二次处理为采用溶脂混合液再次处理外植体2-3分钟，用无菌水冲洗外植体2次，表面多脂植物优选为杨树，更加优选为欧洲黑杨。

本发明再一方面提供了一种培养表面多脂植物外植体的方法，其包括以下步骤：

1、外植体采集植株的培养。

2、外植体的选择。

3、外植体的消毒灭菌：

(1)外植体的清洗；

(2)溶脂混合液预处理：采用溶脂混合液对外植体进行预处理2-3分钟，用无菌水冲洗外植体1次；

(3)溶脂混合液二次处理：采用溶脂混合液对外植体再次进行处理2-3分钟，用无菌水冲洗外植体2次；

(4)外植体的酒精灭菌；

(5)外植体的次氯酸钠灭菌；

(6)无菌水清洗。

4、外植体的培养。

其中，所述溶脂混合液为0.1％的吐温20和10％的乙酸乙酯的水溶液，表面多脂植物优选为杨树，更加优选为欧洲黑杨。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述外植体采集植株的培养为将冬眠植株的穗条剪成15厘米的长度，插入营养钵中，移入温室内进行培养，期间进行日常的肥水管理和病虫害防治，所述的外植体为半木质化的新发枝条。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述外植体的清洗为切取半木质化的枝条，在流水中冲洗0.5个小时。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述溶脂混合液预处理为将外植体浸泡于溶脂混合液中，处理3分钟，无菌水冲洗1次，所述二次处理为采用溶脂混合液再次对外植体处理3分钟，无菌水冲洗2次。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述的酒精灭菌为将无菌水冲洗后的外植体，在超净工作台内放入75％的酒精中消毒30秒，所述的次氯酸钠灭菌为采取次氯酸钠消毒的方式进行消毒处理，时间为8-10分钟，并用无菌水冲洗三次。

在本发明进一步优选的实施方案中，在对外植体进行培养之前，还包括在无菌条件下将外植体材料上与消毒剂接触过的界面进行切除的步骤。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述外植体的培养是将消毒灭菌后的外植体接种在添加有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的MS启动培养基中。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述外植体培养的环境条件为光周期16h/8h、光照强度2500Lux、温度27℃/21℃。

由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。

1、本发明提供了一种用于对表面多脂植物的外植体进行处理的溶脂混合液，其能有效溶解杨树等表面多脂植物外植体表面的树脂。

2、本发明提供了一种采用溶脂混合液对杨树等表面多脂植物的外植体进行处理的方法，其中包括采用溶脂混合液对外植体分别进行预处理和二次处理的步骤，其能有效溶解杨树等表面多脂植物外植体表面的树脂。

3、本发明提供了一种培养杨树等表面多脂植物外植体的方法，其通过采用溶脂混合液对杨树等表面多脂植物的外植体进行处理，不仅能溶解杨树等表面多脂植物外植体表面的树脂，还能有效清除杨树等表面多脂植物外植体表面的细菌及真菌，使外植体保持充足的活力。

附图说明

图1：欧洲黑杨半木质化新发枝条及其表面分泌的树脂。

图2：不同处理方式下，欧洲黑杨茎段外植体生长及染菌情况。

A：采用常规灭菌方法处理的茎段细菌污染情况；

B：采用常规灭菌方法处理的茎段真菌污染情况；

C：采用溶脂混合液处理15min导致外植体生活力降低；

D：采用溶脂混合液二次处理的外植体效果最佳。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

实施例1：欧洲黑杨外植体的培养

1、外植体采集植株的培养

将冬眠的欧洲黑杨无性系N08穗条剪成15cm长度，插入直径6cm的营养钵中，营养土为草炭土、珍珠岩和河沙混合配比(6:2:2)，放置于控温自动化日光温室中，温度25-28℃，期间进行日常的肥水管理和病虫害防治。

2、外植体的选择

扦插30天后，选取生长健壮、无病虫害、腋芽饱满的欧洲黑杨半木质化新发枝条，具体形态如附图1所示。剪去幼嫩的尖端及叶片，保留2mm叶柄，作为外植体。

3、外植体的消毒灭菌

(1)清洗

用流动的自来水进行外植体的清洗，时间为30分钟，之后用滤纸吸干表面水分，放入超净台中。

(2)溶脂混合液预处理

无菌条件下，用高温消毒后的医用手术剪刀将外植体剪成2-3cm的茎段，确保每个茎段有1-2个饱满的腋芽；将茎段放入大灭菌后的玻璃培养皿中，倒入30-50ml溶脂混合液(0.1％的吐温20和10％的乙酸乙酯的水溶液)，预处理3分钟，期间不停摇动，之后无菌水冲洗1次，无菌滤纸吸干。

(3)溶脂混合液二次处理

采用上述溶脂混合液对外植体再次处理3分钟，无菌水冲洗外植体2次。

(4)酒精灭菌

将上述茎段移入无菌培养皿中，加入75％的酒精，轻轻晃动，约30秒后，迅速取出。

(5)次氯酸钠灭菌

将上述茎段移入无菌培养皿中，倒入50-80ml 10％的次氯酸钠溶液，消毒8-10分钟，期间轻轻晃动2-3次。

(6)无菌水清洗

将上述茎段移入无菌培养皿中，用无菌水冲洗外植体3次，用灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分。

4、外植体的培养

将上述处理的茎段置于无菌培养皿中，用灭菌过的医用手术剪刀，将与消毒剂接触过的茎段两端界面切除1-1.5mm，之后接种在添加有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的MS启动培养基中。

将培养瓶移入组织培养箱，设置培养箱的培养条件为光周期16h/8h，光照强度2500Lux，培养温度为27℃/21℃。

5、外植体培养结果的统计分析

培养10天后，统计欧洲黑杨外植体污染情况。30天后，统计外植体成活及生长状况。由表1可见，溶脂混合液的不同处理方式以及不同处理时间对欧洲黑杨外植体的污染率和成活率具有不同的影响。溶脂混合液处理能有效去除欧洲黑杨枝条及腋芽表面分泌的杨树树脂，从而使枝条与杀菌剂有效接触，增加了杀菌剂的杀菌效果。但长时间接触，会使有机试剂进入植物的维管系统，对外植体造成毒害。从表1的数据可以进一步看出，采用溶脂混合液先处理3分钟，无菌水清洗后，再次采用溶脂混合液处理3分钟，然后采用无菌水冲洗2次的二次处理方法效果最佳。

表1溶脂混合液处理对欧洲黑杨外植体污染率和成活率的影响

不同处理方式下，欧洲黑杨茎段外植体生长及染菌情况如附图2所示。