一种去除植物组织培养时外植体内生菌的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其是植物组织培养技术领域，具体涉及一种去除植物组织培养时外植体内生菌的方法。

背景技术：

杨树属于杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L.)植物，为多年生木本乔木。杨树不仅是重要的造林绿化树种和工业用材树种，而且还是多年生林木基因工程的模式树种。因此，获得大量无菌的外植体是进行杨树组织快繁和基因工程研究的前提和基础。

在常规的植物组织培养中，外植体的消毒方法一般是先用自来水冲洗去除表面泥土，用酒精消毒30秒到1分钟，再用10％次氯酸钠或0.1％的生汞消毒几分钟到十几分钟，无菌水冲洗后进行接种。

内生菌是指那些分布于健康植物体内，对植物组织没有引起明显病害症状的菌类，如腐生菌、潜伏性病原菌、菌根菌及固氮菌等等。杨树为多年生植物，树体内部常寄生有各种细菌及真菌。内生菌由于受到植物体的保护，因此常规的消毒灭菌方法难以去除。截止到目前为止，对于植物外植体内生菌消毒灭菌的方式报道极少，常规的方式由于仅能杀灭表面病菌，而内生菌往往在培养后造成培养物的再次污染。因此，开发高效安全的内生菌消毒灭菌方法是杨树组织培养的关键一环，亟待开发一种针对杨树的去除外植体内生菌的方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，为改善常规消毒灭菌方式无法去除杨树等外植体内生菌的不足，提供了一种新的去除植物组织培养时外植体内生菌的方法，该方法能够有效清除杨树等外植体表面及内部的细菌及真菌，使外植体保持充足的活力。

为此，本发明提供了一种去除植物组织培养时外植体内生菌的方法，其包括以下步骤：

1、扦插土壤的消毒处理：采用50％的多菌灵对扦插土壤进行消毒处理。

2、扦插枝条的消毒处理：采用含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对扦插枝条进行消毒处理，处理后，对扦插枝条进行顶端封腊处理。

3、外植体的选择和消毒预处理：采用含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对半木质化的新发枝条进行预处理。

4、外植体的酒精灭菌处理。

5、外植体的次氯酸钠灭菌处理。

6外植体的培养。

在本发明优选的实施方案中，扦插土壤的消毒处理为用50％的多菌灵，以30-40g/m³的用量与扦插土壤拌匀，装入塑料袋，密闭，5天后打开，阳光下晾晒2-3天。

在本发明优选的实施方案中，扦插枝条的消毒处理为将冬眠的穗条清洗后，剪成15cm长度，放入含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液中，处理24小时后，进行顶端封腊处理，处理后扦插到营养钵中，移入温室内进行培养。

在本发明优选的实施方案中，外植体的选择和消毒预处理为剪取半木质化的新发枝条，插入含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素无菌水溶液中，处理12小时后，剪去叶片，采用1％的洗洁精溶液清洗，流水冲洗后，沥干水分，放入超净工作台。

在本发明优选的实施方案中，外植体的酒精灭菌处理为剪取5cm左右的茎段，采用75％的酒精灭菌30秒，无菌水冲洗3次。

在本发明优选的实施方案中，外植体的次氯酸钠灭菌为采取添加0.1％吐温20的10％次氯酸钠消毒8-10分钟，用无菌水冲洗外植体3次，灭菌滤纸吸干。

在本发明优选的实施方案中，在对外植体进行培养之前，还包括在无菌条件下将外植体材料上与消毒剂接触过的界面进行切除的步骤。

在本发明优选的实施方案中，外植体的培养是将消毒灭菌后的外植体接种在MS启动培养基中。

在本发明优选的实施方案中，外植体培养的环境条件为光周期16h/8h、光照强度2500Lux、温度27℃/21℃。

在本发明优选的实施方案中，外植体为杨树的外植体，优选为美洲黑杨的外植体。

由上述描述可知，与现有技术相比，本发明采用50％的多菌灵对扦插土壤进行消毒处理，采用含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对扦插枝条进行消毒处理，以及采用含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对半木质化的新发枝条进行预处理，从而能够有效清除杨树等外植体表面及内部的细菌及真菌，使外植体保持充足的活力。

附图说明

图1：经本发明方法处理的美洲黑杨茎段外植体的生长状况。

图2：采用常规消毒方法处理的美洲黑杨茎段外植体的生长状况。

A：培养35天后产生内生细菌污染；

B：培养35天后产生内生真菌污染。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

实施例1：美洲黑杨外植体的培养

1、扦插土壤的消毒处理

将草炭土、珍珠岩和河沙按6:2:2的比例充分混合用作扦插土壤，施入50％多菌灵(30-40g/m³)，充分拌匀，装入塑料袋，密闭5天后打开，阳光下晾晒2-3天后，装入直径6cm的培养钵中。

2、扦插枝条的消毒处理

将冬眠的美洲黑杨穗条剪成15cm长度，自来水冲洗，并用软毛刷清除表面污垢。之后，将穗条全部浸入抗生素消毒混合液(200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素无菌水溶液)中，处理24小时。用无菌滤纸吸干穗条表面水分，并将穗条顶端0.5cm浸入融化的石蜡中，进行顶端封腊处理。处理后的穗条扦插到上述营养钵中，放置于控温自动化日光温室中，温度25-28℃，期间进行日常的肥水管理和病虫害防治。

3、外植体的选择和消毒预处理

扦插30天后，选取生长健壮、无病虫害、腋芽饱满的美洲黑杨半木质化新发枝条，进行抗生素消毒预处理。方法是将半木质化新发枝条底端插入含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素无菌水溶液中处理12小时。

新发枝条抗生素消毒预处理后，用医用手术剪去除幼嫩的尖端及叶片，保留2mm的叶柄，用1％的洗洁精溶液清洗，并用流动的自来水充分冲洗，之后用滤纸吸干外植体表面水分，放入超净台中。

4、外植体的酒精灭菌处理

在无菌条件下，用高温消毒后的医用手术剪刀将外植体剪成2-3cm的茎段，确保每个茎段有1-2个饱满的腋芽。将茎段放入大灭菌后的玻璃培养皿中，倒入75％的酒精，轻轻晃动，约30秒后，迅速取出。

5、外植体的次氯酸钠灭菌处理

将上述茎段移入无菌培养皿中，倒入30-50ml添加0.1％吐温20的10％次氯酸钠，消毒8-10分钟，期间轻轻晃动2-3次。

将上述茎段移入无菌培养皿中，用无菌水冲洗外植体3次，用灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分。

6、外植体的培养

将上述处理的茎段置于无菌培养皿中，用灭菌过的医用手术剪刀，将与消毒剂接触过的茎段两端界面切除1-1.5mm，之后接种在MS启动培养基中。

将培养瓶移入组织培养箱，设置培养箱的培养条件为光周期16h/8h，光照强度2500Lux，培养温度为27℃/21℃。

7、外植体培养结果的统计分析

培养5-10天后，统计美洲黑杨外植体表面污染情况；培养30-40天后，统计外植体内生菌污染、成活及生长状况。不同消毒方法的结果比对具体如表1所示。

不同处理方式下，美洲黑杨茎段外植体生长及染菌情况如附图2所示。

表1不同消毒方法结果对比

注：1：常规消毒方法；2：本发明的消毒方法。