铁皮石斛‑苔藓共伴生培养系统的制作方法

本发明涉及一种铁皮石斛-苔藓共伴生培养系统，属于园艺林业技术领域。

背景技术：

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是我国传统名贵中药材，主要分布在安徽、浙江、福建等地。具有益胃生津、滋阴清热等独特的功效。早在秦汉时期，《神农本草经》就记载铁皮石斛“味甘，平。主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳、赢弱，强阴。久服，厚肠胃、轻身、延年”。1000 多年前的《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首；李时珍在《本草纲目》中评价铁皮石斛“强阴益精，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年”。民间称其为救命仙草，国际药用植物界称为“药界大熊猫”。现代药理研究证明，铁皮石斛具有增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症等作用，对咽喉疾病、肠胃疾病、白内障、心血管疾病、糖尿病、肿瘤均具有显著疗效。为此，2010年版《中国药典》将其单独收载。20世纪 90年代以前，铁皮石斛主要依靠野生资源。由于毁灭性采挖、生存环境的破坏以及自身繁殖能力低下，野生资源基本枯竭，1987年国务院将其列为国家二级保护植物。2011年，全国人工种植面积突破10000多亩，以铁皮石斛为原料的药品与保健品30多个，形成了从铁皮石斛种植、加工、销售完整的产业链，铁皮石斛产值超过30亿元，成为国内产销量最大的保健产品之一。

目前，铁皮石斛的栽培和规模种植主要分为设施仿生栽培模式和林内生态种植模式两大类，两种种植方式各存在不同的优缺点。设施仿生栽培模式，即利用玻璃温室或塑料薄膜大棚等设施，以树皮等为栽培基质，配备遮阳网、喷雾和灌溉等设施，模仿野生环境培育铁皮石斛的一种栽培方法，其优点是温度、湿度、肥力等条件控制精准，铁皮石斛生长速度较快，但由于没有自然环境因子的作用，次生物质的积累不够；林内生态种植模式，主要有林下栽培和活树附生原生态栽培模式两种，主要是充分利用林内的自然环境条件作用，达到原生态栽培的目的，其优点是生长环境人工干预较少，属于完全的自然环境下生长，采后的铁皮石斛的品质高，次生物质积累量多。但生长较慢，且对条件适合的林地利用率低，产量稀少，同时，由于林地树木生长不规则，山林斜坡等地形，也会导致生长环境不稳定、水流对林地种植冲刷侵袭，影响种植成活率和生长稳定性。

基于此，做出本申请。

技术实现要素：

针对现有铁皮石斛种植过程中所存在的上述缺陷，本申请提供一种可实现立体种植、提高林区利用面积、减少生长环境影响的铁皮石斛立体种植方法。

铁皮石斛-苔藓共伴生培养系统，在耐腐木基上包被伴生苔藓或伴生苔藓与树皮的组合，耐腐木基、伴生苔藓/伴生苔藓和树皮两者形成支撑物，将铁皮石斛组培苗固定在支撑物上，将其固定在树荫遮蔽林地（指沿竖直方向，树枝下方的范围均为树荫遮蔽区域）上，即可。

进一步的，作为优选：

所述的耐腐木基上固定有培养基，苔藓附着在该培养基上分芽繁殖，并包被在耐腐木基上。更优选的，所述的苔藓需进行消毒再进行附着；所述的培养基为Knop液体培养基、Benecke液体培养基、淀粉、葡萄糖、淘米水、洗菜水或河水，上述培养基浸泡木板，取苔藓，加入液氮，将其磨成粉末，均匀的涂布在木板上，25℃，弱光，喷雾保湿培养，即可使苔藓附着在培养基上；所述的苔藓以喷雾保湿方式进行养护。

所述的铁皮石斛组培苗固定前，支撑物上喷洒有共生菌液。

所述的伴生苔藓以单层或多层方式包被在耐腐木基上。

所述的铁皮石斛组培苗以单层或多层方式固定在支撑物上，当设置为多层时，铁皮石斛可在单层伴生苔藓上分多层设置，也可在每层伴生苔藓上各设置一层。

所述的支撑物相邻之间的间距为支撑物高度的0.8-1.5倍。

本申请的工作原理和有益效果如下：

（1）提高了林区利用率，降低了林区地势影响。本申请以耐腐木基作为立体培养的支撑物，将铁皮石斛组培苗按需求单层或多层固定在该支撑物上，将其按序固定在树荫遮蔽的林地上，使铁皮石斛的培养由单层铺展向竖直空间上延伸，不仅提高了林区利用率和相同面积上的种植率，还将铁皮石斛的生长环境由地面移动至地表上空，在最大程度的满足原生态培养的同时，也从根本上避免了地势对培养过程造成的影响，有效的解决了环境适宜林地树木生长不规则、山林斜坡水流对林地种植冲刷侵袭带来的危害，并能有效减少山地土壤中可能存在的重金属等有害物质的污染风险，为铁皮石斛的种植提供了稳定的附生环境，从而拓宽了铁皮石斛种植的可选区域，是能有效提高适宜林地利用率的培植体系。

（2）以苔藓植物作为共生体系，将组培技术与菌根技术相结合，可加速铁皮石斛的有机生长。共生植物，特别是苔藓植物作为野生植物栽培中重要的辅助微环境构建者，对耐腐木基表面进行结构处理，使之能固定内层苔藓培植基质，通过分芽繁殖方式，使苔藓包被在耐腐木基外，当苔藓生长时，其会自发的对水分进行吸收，从而为支撑物上附生的铁皮石斛提供了水分，是石斛栽培中最重要的保水性伴生植物，避免了干燥、缺水、施水不匀对铁皮石斛生长造成的影响，并在生长过程中为铁皮石斛提供了次生物质，从而有效加速了铁皮石斛的有机生长。

（3）共生菌确保了整个支撑物为铁皮石斛建立其适宜其生长的微环境，有助于铁皮石斛的有效附生。在铁皮石斛固定在支撑物上前，先在耐腐木基上喷洒共生菌液，并形成共生菌层，当铁皮石斛固定在该支撑物上时，其初始环境非常有利于铁皮石斛的生长，其与苔藓生长中产生的内生菌相互配合，促进内生菌和苔藓生长的同时，也有利于铁皮石斛在支撑物上的有机生长。

本申请以苔藓植物作为伴生体系，以耐腐木基作为附生支撑物，结合共生菌，构建耐腐性木材包被含有铁皮石斛共生菌和伴生苔藓植物的立体的拟生态种植共伴生体系，最大限度的利用适合铁皮石斛生长的有限的林业资源，并利用有益共生真菌和伴生苔藓植物与铁皮石斛形成的微生态环境，抑制其他有害菌的生长，并提供生长所需的水分养分，实现兼顾高品质-高产量，并减少病害的绿色立体拟生态栽培模式。同时有效的保护这一国家二级保护植物，有利于野生种群的恢复，为保护物种多样性，也为中医药自然资源的可持续利用提供途径。

附图说明

图1为本申请的侧视图；

图2为本申请的俯视图；

图3为本申请中支撑物的结构示意图；

图4-1为Benecke培养基对苔藓组织培养的影响；

图4-2为Knop培养基对苔藓组织培养的影响；

图4-3为在Knop培养基上对苔藓组织培养长出的新芽；

图5-1为内生菌的长出；

图5-2为苔藓内生菌的分离；

图6-1为苔藓内生菌的PCR鉴定；

图6-2为苔藓内生菌的DNA提取；

图7-1为苔藓的不同培养基质；

图7-2为无基质状态下苔藓的附生状况；

图7-3为覆盖状态下苔藓的附生状况；

图7-4为河水为基质状态下苔藓的附生状况；

图7-5为河水基质20天时苔藓的附生状况；

图7-6为河水基质30天时苔藓的附生状况；

图 8-1为朽木+苔藓作为固定培养时铁皮石斛组培苗的生长状况；

图8-2为朽木+苔藓+松树皮作为固定培养时铁皮石斛组培苗的生长状况；

图8-3为松树皮+朽木作为固定培养时铁皮石斛组培苗的生长状况；

图8-4为朽木作为固定培养时铁皮石斛组培苗的生长状况；

图9-1为不同培养条件下的铁皮石斛的根系发育外观图；

图9-2为不同培养条件下的铁皮石斛的干湿重柱状图；

图10为本申请中支撑物的另一结构示意图。

其中标号：1. 树荫遮蔽林地；2. 支撑物；3. 耐腐木基；4. 共生菌层；5. 伴生苔藓层。

具体实施方式

材料与方法

1.1实验材料

苔藓：附近公园树上，墙上阴凉处的苔藓多种。

铁皮石斛：浙江省某大型铁皮石斛种植基地的组培苗。

主要仪器：荧光显微镜（Nikon）、PCR（Bio-rad）、凝胶成像系统（Bio-rad）、核酸蛋白质分析仪（Bio-rad）。

实验方法

1.2.1 苔藓的消毒

选取新鲜苔藓，用0.1%次氯酸钠浸泡30min，并在摇床上摇4小时，蒸馏水浸泡洗净，用无菌滤纸吸干水分。

苔藓培养基的配置

苔藓组织培养培养基选用Knop培养基和Benecke培养基两种。

苔藓DNA提取及鉴定

取新鲜苔藓，加入液氮研磨，加入CTAB（含0.1％的巯基乙醇），65℃保温90Min，氯仿或氯仿：异戊醇，混匀，分成后离心10000g 10min。将水相转移至新管中，加入2倍体积的冰乙醇，用含RNA酶的TE溶解。

苔藓内生菌的分离及培养

采回的苔藓用自来水洗净，并用无菌纸吸干水分，并用无菌纸吸干水分,切取细微小块，用75%酒精浸泡5m in、7m in、10m in，分别用0.1%升汞溶液处理 4 min、6 min、8 min，进行表面灭菌，此试验分别重复 3次，最后用无菌水冲洗4次。将组织块在研钵中充分研磨成匀浆，最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板（PDA、马丁氏、benecke培养基），26~ 28℃下培养2~ 3d，筛选出最佳消毒时间和培养基，将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次，取上清液涂抹于培养基上，以无菌水冲洗为对照试验。取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上，取匀浆涂布于不同培养基平板，每浓度重复 3次，然后将培养皿置于26~ 28℃恒温箱中培养2~ 3d，观察培养出的菌落形。

苔藓内生菌DNA提取及鉴定

选择纯化的菌株，在28℃下摇菌48h；取1ml离心后，用液氮碾磨破壁，利用CTAB法提取DNA，琼脂糖电泳检测DNA提取含量。

利用核糖体rDNA区通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，进行PCR扩增，火温度55℃；利用琼脂糖电泳初步判断产物大小。

苔藓附着

分别用Knop液体培养基、Benecke液体培养基、淀粉、葡萄糖、淘米水、洗菜水、河水等作为培养基浸泡木板。取苔藓，加入液氮，将其磨成粉末，均匀的涂布在木板上，25℃，弱光，喷雾保湿培养。

苔藓的养护

每天4次喷雾，保持湿润，25℃，弱光。

铁皮石斛的固定及养护

将铁皮石斛用稻草固定在朽木、经灭菌的松树皮的朽木、已灭菌的朽木上、未灭菌的松树皮的朽木上，作对比实验。其中，结合图3，支撑物2的主要组成部分为耐腐木基3，即实施例中选用的朽木，也可选用带树皮的朽木；支撑层上设置有由共生菌液形成共生菌层4，该共生菌层4可位于伴生苔藓层5与耐腐木基3之间，也可设置在伴生苔藓层5表面；而苔藓在耐腐木基3上则形成伴生苔藓层5；结合图1和图2，固定有铁皮石斛组培苗的支撑物2上按序固定在树荫遮蔽林地1上，相邻支撑物2之间的间距分别为支撑物2高度的0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍。在支撑物2上可如图3所示设置一组共生菌层4+伴生苔藓层5，也可如图10所示设置多组共生菌层4+伴生苔藓层5。

结果与分析

2.1不同培养基条件对苔藓组织培养的影响

使用Knop培养基和Benecke培养基两种培养基，对消毒的苔藓进行组织培养。Benecke培养基培养三批苔藓，没有新芽长出；Knop培养基上两周后开始长出新芽，比较两种培养基，Knop培养基中多了还原型的二价铁离子，具体参见图4-1、4-2、4-3。

苔藓内生菌的分离

将Knop培养基上培养两周的苔藓幼苗继代，在新培养基中再培养两周后，苔藓周围长出白色菌环即为内生菌。挑出菌落在真菌筛选培养基中培养。经两代纯化后，液体培养，具体参见图5-1、5-2。

苔藓内生菌的DNA提取及PCR鉴定

（1）选择纯化的菌株，在28℃下摇菌48h。

（2）去1ml离心后，用液氮碾磨破壁，利用CTAB法提取DNA，琼脂糖电泳检测DNA提取含量。

（3）利用核糖体rDNA区通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，进行PCR扩增，火温度55℃。

（4）利用琼脂糖电泳初步判断产物大小，对有条带的菌株PCR产物送上海英俊测序，将测序结果在GENBANK中比对，具体参见图6-1、6-2。

不同基质对苔藓附生的影响

分别用Knop液体培养基、Benecke液体培养基、淀粉、葡萄糖、淘米水、洗菜水、河水等作为培养基浸泡木板。取苔藓，加入液氮，将其磨成粉末，均匀的涂布在木板上，25℃，弱光，喷雾保湿培养。

参见图7-1、7-2、7-3、7-4、7-5和7-6，结果表明：营养较好的基质，并不利于苔藓的生长，河水浸泡两周的木板，苔藓长势最好。

不同基质固定培养

将铁皮石斛用稻草固定在朽木、经灭菌的松树皮的朽木、已灭菌的朽木上、未灭菌的松树皮的朽木上，作对比实验。参见图8-1、8-2、8-3、8-4，结果表明，在朽木上附生铁皮石斛的长势最好。

不同培养条件下的铁皮石斛生长情况比较

将不同培养条件下的铁皮石斛取出，观察其根系发育情况，具体参见图9-1；称量其干重与湿重，参见图9-2，从图9-2可以看出，苔藓共伴生培养的铁皮石斛根系粗壮，湿重干重都高于其他培养方式。

相邻支撑物2之间的间距分别为支撑物2高度的0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍时，均可实现总收益与铁皮石斛长势的良好匹配，但在1.0-1.3倍时，尤其是该间距为支撑物2高度的1.1倍时，铁皮石斛组培苗相互之间没有明显的相互弱光照的遮蔽，可以得到相对更优的生长数据。

铁皮石斛的有效成分就是石斛多糖含量，而这也是体现种植效果的一个关键指标，一般的野生的为20%左右，人工栽培在10%，而本申请种植的铁皮石斛，其液相色谱检测石斛多糖含量二年生的多糖含量接近30%，一年生的在25%，均高于常规人工栽培结果，品质可与野生铁皮石斛相媲美，但生长速度远高于野生铁皮石斛。

本申请通过苔藓植物作为伴生体系，以木材作为附生支撑物，结合共生菌，构建立体拟生态种植模式，并且对伴生的苔藓的种植条件进行探索，摸索伴生条件，探讨多种种植条件下，铁皮石斛的生长状况。所构建的立体拟生态种植模式具有以下两大优势：（1）由于本项目筛选和培育的共伴生体系系我省土著菌群和苔藓，其气候适应性较强，有利于在本地开展后期应用及野生珍稀资源恢复；（2）该体系能最大限度的利用适合铁皮石斛生长的有限的林业资源，并利用有益共生真菌和伴生苔藓植物与铁皮石斛形成的微生态环境，抑制其他有害菌的生长，并提供生长所需的水分养分，实现兼顾高品质-高产量，并减少病害的绿色立体拟生态栽培模式。

以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。