IDA成熟多肽植物衰老促进剂、制备方法及应用与流程

本发明涉及植物衰老促进剂领域，尤其涉及一种IDA成熟多肽植物衰老促进剂及其制备方法和应用。

背景技术：

叶片衰老是影响农作物产量、品质等农艺性状的重要因素。以烟草为例，烟草是重要经济作物，叶片是其收获器官，随着烟草进入生育后期，叶片进入衰老阶段，烟草上部、中部、下部叶片成熟时期不相同，通常，生产上采用不同部位不同时期采收的策略完成，拖延了采收时间；另一方面，环境因素如接近采收时期连续雨天可能会造成烟叶“二次返青”影响采收。因此，利用衰老促进剂，可以促进植物叶片衰老，可有效解决不同部位烟草叶片成熟度不一致及返青问题。

目前，对植物衰老控制的应用主要集中在对植物激素的调节方面，生长素、细胞分裂素等可抑制叶片衰老，乙烯、脱落酸可促进叶片衰老；人为减缓叶片衰老进程，一方面可以通过减少衰老促进激素的合成或代谢，另一方面也可增加衰老抑制激素的合成或代谢。

衰老相关的功能解析的工作已较广泛和深入的开展。拟南芥2-氧化戊二酸依赖的双加氧酶基因缺失会使叶片衰老延迟表型。地塞米松(DEX)诱导该基因过量表达后，可使转基因拟南芥叶片衰老提前；拟南芥AtNAC家族成员NAP基因过量表达可使叶片提早衰老，而NAP基因缺失突变体则推迟衰老，同样，在水稻中该基因也能够影响叶片衰老；除此之外，植物小RNA，WRKY等转录因子家族等都可调控叶片的衰老。但至目前，已报道的衰老相关基因真正直接应用到作物生产中的还鲜有报道。

多肽是动植物体内的一类具有调控作用的小分子物质，植物多肽参与了多项发育过程，例如根分生组织发育、茎端分生组织发育等，但植物多肽是否参与衰老，还未见报道，成熟多肽是由前体蛋白经过翻译后剪切、修饰，最终形成只有较短氨基酸组成的功能分子，作为配体与定位在细胞膜上的受体识别，启动信号转导。成熟多肽直接外施对植物生长可产生影响，如根的伸长。目前成熟多肽在植物尤其是作物上的应用研究很少，目前更没有将其应用在促进植物衰老方面的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种IDA成熟多肽植物衰老促进剂、制备方法及应用。该IDA成熟多肽植物衰老促进剂可以促进植物的叶片衰老，使其衰老加速，并且无其它额外不良表现。

本发明一方面提供了IDA成熟多肽植物衰老促进剂，该植物衰老促进剂功能成份为IDA成熟多肽，IDA成熟多肽的氨基酸序列为Pro-Ile-Pro-Pro-Ser-Ala-Pro-Ser-Lys-Arg-His-Asn。

优选的，所述IDA成熟多肽植物衰老促进剂包括：IDA成熟多肽，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶解于MS液体培养基。

优选的，所述IDA成熟多肽植物衰老促进剂中，IDA成熟多肽的浓度为10-13μmol/L，2-(N-吗啉)乙磺酸的浓度为2.8-3mmol/L，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的pH为5.8-5.9。

更优选的，所述IDA成熟多肽植物衰老促进剂中，IDA成熟多肽的浓度为10μmol/L，2-(N-吗啉)乙磺酸的浓度为2.8mmol/L，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的pH为5.8。

优选的，本发明的IDA成熟多肽植物衰老促进剂还可加入助剂，更优选的，助剂为吐温-20，加入量为衰老促进剂总量的1-2‰。

本发明另一方面提供了IDA成熟多肽植物衰老促进剂的制备方法，具体的，该方法包括如下步骤：

(1)称量IDA成熟多肽粉末溶解在水或二甲基亚砜溶剂中，配制成浓度为10-13mmol/L的IDA成熟多肽母液备用；

(2)配制MS液体培养基，称取定量的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，加入到上述MS液体培养基中，配制成2.8-3mmol/L的溶液，调节溶液pH值为5.8-5.9，充分混合溶解均匀得到2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；

(3)将步骤(1)得到的IDA成熟多肽母液加入到步骤(2)制得的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液中，IDA成熟多肽母液与2-(N-吗啉)乙磺酸溶液体积比为1:1000，玻璃棒搅拌均匀，得到IDA成熟多肽植物衰老促进剂。

优选的，步骤(1)中溶剂为二甲基亚砜；

优选的，步骤(3)中IDA成熟多肽植物衰老促进剂中加入1-2‰的吐温-20，用玻璃棒搅拌均匀。

优选的，步骤(1)中IDA成熟多肽母液现用现配，若超过40天不使用，母液-70℃储存；若40天之内使用，母液-20℃储存，一周之内使用4℃储存即可。

本发明的另一方面还提供了上述IDA成熟多肽植物衰老促进剂在促进植物衰老方面的应用，施用于植物的叶面，具体的，施用方法为：直接叶面喷洒或用IDA成熟多肽植物衰老促进剂浸泡棉球涂抹叶面，植物叶片完全伸展时期即可使用，优选的，烟草可在成熟前期叶面施用。

本发明的有益效果在于：(1)本发明的IDA成熟多肽植物衰老促进剂中的IDA成熟多肽人工合成方便，获取便利，可大批量合成；(2)本发明的植物衰老促进剂的配制和使用方法简单，田间可操作性强，对于施用人员不需要经过特殊培训，操作便利、实用；(3)本发明的植物衰老促进剂对叶片衰老影响适度，不会造成不良反应，效果有益。

附图说明

图1为拟南芥上IDA基因缺失延迟叶片衰老示意图；

图2为人工合成的IDA成熟多肽植物衰老促进剂处理拟南芥离体叶片结果示意图；

图3为人工合成的IDA成熟多肽植物衰老促进剂处理烟草离体叶片结果示意图；

图4为IDA成熟多肽植物衰老促进剂处理活体烟草叶片结果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种IDA成熟多肽植物衰老促进剂，包括IDA成熟多肽，IDA成熟多肽的氨基酸序列为Pro-Ile-Pro-Pro-Ser-Ala-Pro-Ser-Lys-Arg-His-Asn，该植物衰老促进剂包括：10-13μmol/L IDA成熟多肽，2.8-3mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液为2-(N-吗啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液体培养基，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的pH为5.8-5.9。

可以理解的是，IDA成熟多肽的浓度可以为10、11、12、13μmol/L，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的浓度可以为2.8、2.9、3mmol/L，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的pH可以为5.8、5.9。

具体的，在本发明的上述实施例中，IDA成熟多肽植物衰老促进剂还包括助剂，所述助剂可以为本领域用于叶面润湿和叶面延展的常规助剂，本发明加入的助剂为吐温-20，加入量为IDA成熟多肽植物衰老促进剂总量的1-2‰，但是可以理解的是，本领域任何常用的叶面用助剂均可加入从而促进本发明的IDA成熟多肽植物衰老促进剂的应用，例如本领域的表面活性剂、延展剂、润湿剂等，加入量为相应助剂的常规用量。

本发明的又一实施例提供了IDA成熟多肽植物衰老促进剂的制备方法，具体的，该方法包括如下步骤：

S1称量IDA成熟多肽粉末溶解在水或二甲基亚砜溶剂中，配制成浓度为10-13mmol/L的IDA成熟多肽母液备用。

在本步骤中，由于二甲基亚砜对多肽的溶解性能更好，可以更好的促进多肽的溶解，更好的促进多肽提供相应功能。由于IDA成熟多肽对储存温度有较高要求(不易在室温放置超过24小时)，因此IDA成熟多肽母液现用现配，若超过40天不使用，母液-70℃储存；若40天之内使用，母液-20℃储存，一周之内使用4℃储存即可。

S2配制MS液体培养基，称取定量的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，加入到上述MS液体培养基中，配制成2.8-3mmol/L的溶液，调节溶液pH值为5.8-5.9，充分混合溶解均匀得到2-(N-吗啉)乙磺酸溶液。

本步骤中MS培养基不仅能够充分溶解2-(N-吗啉)乙磺酸，从而保证在植物表面形成一定的渗透式，为多肽的作用提供基础，同时，该液体培养基作为溶剂还能提供相应的大中量元素营养，保证作用效果。

S3将步骤(1)得到的IDA成熟多肽母液加入到步骤(2)制得的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液中，IDA成熟多肽母液与2-(N-吗啉)乙磺酸溶液体积比为1:1000，玻璃棒搅拌均匀，得到IDA成熟多肽植物衰老促进剂。

本步骤中可加入1-2‰的吐温-20，相应的助剂能够促进上述溶液尽快的在植物表面进行延展和渗透湿润，具体的，由于IDA成熟多肽的加入量较少，实际操作过程中优选的将步骤S1的溶液用步骤S2的溶液稀释1000倍，可将IDA成熟多肽的浓度稀释为10-13μmol/L。

本发明的又一实施例提供了该IDA成熟多肽植物衰老促进剂在促进植物衰老方面的应用，施用方法为：直接叶面喷洒或用IDA成熟多肽促进剂浸泡棉球涂抹叶面，植物叶片完全伸展时期即可使用，优选的，烟草可在成熟前期叶面施用。

喷洒或浸泡该IDA成熟多肽植物衰老促进剂的棉球涂抹植物叶片，可使植物生长状态不受影响的前提下，促进植物叶片衰老，特别有利于叶片不同步衰老作物的一致性采收，例如烟草。

上述实施例的IDA成熟多肽植物衰老促进剂中IDA成熟多肽人工合成方便，获取便利，可大批量合成；配制和使用方法简单，田间可操作性强，对于施用人员不需要经过特殊培训，操作便利、实用；该植物衰老抑制剂对叶片衰老影响适度，不会造成不良反应，尤其在烟草上具备显著的应用效果。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的IDA成熟多肽植物衰老促进剂，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

IDA成熟多肽植物衰老促进剂，包括：10μmol/L IDA成熟多肽，2.8mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液为2-(N-吗啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液体培养基，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的pH为5.8。

制备方法如下：

(1)称量IDA成熟多肽粉末溶解在二甲基亚砜溶剂中，配制成浓度为10mmol/L的IDA成熟多肽母液备用；

(2)配制MS液体培养基，称取定量的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，加入到上述MS液体培养基中，配制成2.8mmol/L的溶液，调节溶液pH值为5.8，充分混合溶解均匀得到2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；

(3)将步骤(1)得到的IDA成熟多肽母液取40μL加入到步骤(2)制得的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液40mL中，玻璃棒搅拌均匀，得到40mL的IDA成熟多肽植物衰老促进剂。

实施例2

IDA成熟多肽植物衰老促进剂，包括：12μmol/L IDA成熟多肽，2.9mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液为2-(N-吗啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液体培养基，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的pH为5.9。

制备方法如下：

(1)称量IDA成熟多肽粉末溶解在二甲基亚砜溶剂中，配制成浓度为12mmol/L的IDA成熟多肽母液备用；

(2)配制MS液体培养基，称取定量的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，加入到上述MS液体培养基中，配制成2.5mmol/L的溶液，调节溶液pH值为5.9，充分混合溶解均匀得到2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；

(3)将步骤(1)得到的IDA成熟多肽母液取100μL加入到步骤(2)制得的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液100mL中，玻璃棒搅拌均匀，得到100mL的IDA成熟多肽植物衰老促进剂。

实施例3

IDA成熟多肽植物衰老促进剂，包括：13μmol/L IDA成熟多肽，3.0mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液为2-(N-吗啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液体培养基，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的pH为5.8。

制备方法如下：

(1)称量IDA成熟多肽粉末溶解在水中，配制成浓度为13mmol/L的IDA成熟多肽母液备用；

(2)配制MS液体培养基，称取定量的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，加入到上述MS液体培养基中，配制成2.9mmol/L的溶液，调节溶液pH值为5.8，充分混合溶解均匀得到2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；

(3)将步骤(1)得到的IDA成熟多肽母液取60μL加入到步骤(2)制得的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液60mL中，加入2‰的吐温-20，玻璃棒搅拌均匀，得到60mL的IDA成熟多肽植物衰老促进剂。

实施例4

IDA成熟多肽植物衰老促进剂，包括：13μmol/L IDA成熟多肽，3.0mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液为2-(N-吗啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液体培养基，2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的pH为5.8。

制备方法如下：

(1)称量IDA成熟多肽粉末溶解在水中，配制成浓度为13mmol/L的IDA成熟多肽母液备用；

(2)配制MS液体培养基，称取定量的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，加入到上述MS液体培养基中，配制成2.9mmol/L的溶液，调节溶液pH值为5.8，充分混合溶解均匀得到2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；

(3)将步骤(1)得到的IDA成熟多肽母液取50μL加入到步骤(2)制得的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液50mL中，加入1‰的吐温-20，玻璃棒搅拌均匀，得到50mL的IDA成熟多肽植物衰老促进剂。

试验测试

通过进行拟南芥上IDA基因缺失处理，参见图1。模式双子叶植物拟南芥中IDA基因缺失突变体IDA，与野生型对照在相同条件下表型分析：持续光照生长25天，植物材料生长状态整体表型观察，结果表明，图1的A图可以看出IDA基因缺失突变体延迟叶片衰老，同时，利用乙醇法测定不同材料相同叶位(第6叶位)叶绿素含量，进一步分析各材料衰老表征参数，结果如图1的C图，野生型较IDA突变体叶绿素含量偏低；另外，对持续光照生长25天的野生型及突变体材料进行了光合速率测定，图1的D图表明野生型较IDA突变体叶片光合速率偏低，综上说明，当IDA基因缺失后，植物表现出了晚衰的症状，暗示了IDA多肽在促进叶片衰老方面的作用。

取实施例1制备的IDA成熟多肽植物衰老促进剂，按照施用方法分别处理拟南芥、烟草的离体叶片和烟草的活体叶片。

处理1：处理拟南芥叶片：持续光照生长拟南芥30天左右，获取同叶位离体叶片(第六叶位)，将其平放在滤纸上，多肽试剂均匀、充分喷洒，同时，对照为2.8mM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)处理，MS水溶液处理，观察表型。

处理2：烟草旺长期，处理离体叶片，处理方式为喷洒，对照与处理1对照相同处理

处理3：烟草旺长期，处理烟草活体叶片，处理方式为用棉球涂抹烟草叶片，对照与处理1对照相同处理，表型观察。

参见图2，用镊子选取长势一致的相同叶位(第六莲座叶)拟南芥叶片，较规则的放在培养皿中，IDA成熟多肽植物衰老促进剂以喷洒的方式处理，同时加对照相同方式处理，持续光照下放置5-6天，结果可以看出，图A-B表明IDA成熟多肽植物衰老促进剂促进拟南芥叶片衰老，图C表明IDA成熟多肽可以互补ida突变体的晚衰表型；拟南芥离体叶片3天后喷洒有IDA成熟多肽植物衰老促进剂的叶片有明显早衰表型，同时利用乙醇法测定叶绿色含量，图D发现对照较IDA成熟多肽植物衰老促进剂处理的叶片叶绿素含量明显多；

参见图3，IDA成熟多肽衰老促进剂促进烟草叶片衰老，选取旺长期烟草长势一致的叶片，利用IDA衰老促进剂及对照喷洒，图3A、C表明烟草离体叶片7天后有可见早衰性状，图3B表明，用10μmol/L IDA成熟多肽处理叶绿素含量明显降低。综上表明，IDA成熟多肽植物衰老促进剂对植物离体叶片有促进衰老的作用。

参见图4，27℃持续光照条件下生长约25天的本氏烟草为材料，棉球浸泡分别在IDA成熟多肽植物衰老促进剂工作液及对照中5分钟，使其完全浸透，处理过的棉球处理活体烟草叶片13天后有可见早衰性状(图A)：同时，利用乙醇法测定涂抹IDA成熟多肽植物衰老促进剂及对照后13、21天烟草叶片叶绿素含量，结果表明与对照相比，IDA成熟多肽植物衰老促进剂处理后的烟草叶片叶绿素含量都降低(图B)。综上表明，IDA成熟多肽植物衰老促进剂对活体植物叶片有明显促进衰老的作用。