本发明涉及根肿病防治领域，具体地，涉及一种抑制芸薹根肿菌生长的方法，防治十字花科作物根肿病的方法以及阿扎霉素在防治十字花科作物根肿病中的用途。
背景技术：
：十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)侵染引起的。此病1852年首次在美国报道，19世纪在前苏联大面积流行并造成毁灭性灾害。近年来，此病在世界范围内危害日趋严重。我国早在1936年在台湾就有报道，目前主要分布在黑龙江、辽宁、山东、新疆、甘肃、陕西、江苏、浙江、福建、江西、湖北、湖南等地区。植株受到芸薹根肿菌侵染后，根系和地下茎部分或全部组织形成膨大的肿瘤。受害轻者，地上部组织外观没有明显的症状；受害严重者，营养吸收和水分运输受到中断，上部表现营养不良和萎蔫，植株表现不同程度的萎黄；对于幼嫩苗则上部叶片萎垂，导致未成熟而死亡，生长发育受到严重障碍，根肿病菌能侵染十字花科多种作物，一般损失20％左右，严重的损失70-80％，甚至绝产无收，严重威胁着十字花科作物的生产。对于十字花科作物根肿病的防治，目前主要的措施有检疫、抗病品种、轮作、调节土壤的pH值和化学防治等方法，但还没有理想的措施。因此，符合环保、健康和持续发展理念的生物农药在十字花科作物根肿病的治理中越来越引起人们的关注，尤其是微生物及其活性次生代谢产物的应用，因其具有广谱性以及对环境安全的优点已成为根肿病防治的新手段，表现出广阔的应用前景，因此，探寻更多的用于防治十字花科作物根肿病的生药药剂具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抑制芸薹根肿菌生长的方法和防治十字花科作物根肿病的方法以及阿扎霉素在防治十字花科作物根肿病中的用途。为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量实验，结果发现阿扎霉素对抑制芸薹根肿菌的侵染具有优异的效果。因此，第一方面，本发明提供了一种抑制芸薹根肿菌生长的方法，该方法包括将阿扎霉素与芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)进行接触。第二方面，本发明提供了一种防治十字花科作物根肿病的方法，该方法包括将阿扎霉素施用至十字花科作物。第三方面，本发明提供了阿扎霉素在防治十字花科作物根肿病中的用途。通过上述技术方案，能够有效地防治十字花科作物根肿病，并且，由于阿扎霉素可以通过微生物手段获得，具有环境安全的优点，因此，具有广阔的应用前景。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抑制芸薹根肿菌生长”指的是芸薹根肿菌的生长和繁殖被抑制，具体表现是一段时间后孢子死亡。本发明中使用的术语“防治”意指预防和/或治疗。本发明使用的“芸薹根肿菌”是粘菌门，根肿菌纲的代表生物，该菌营寄生生活，常寄生于十字花科作物的根部，使寄主患根肿病。第一方面，本发明提供了一种抑制芸薹根肿菌生长的方法，该方法包括将阿扎霉素与芸薹根肿菌进行接触。本发明使用的“阿扎霉素”主要是从链霉菌属产生的次级代谢产物中发现的大环内酯类抗生素，其主要包括阿扎霉素F(AzalomycinF)类化合物。优选地，所述阿扎霉素为阿扎霉素F3(AzalomycinF3)和/或阿扎霉素F4(AzalomycinF4)，其中，所述阿扎霉素F3的分子式为C56H95N3O17；和/或，所述阿扎霉素F4的分子式为C57H97N3O17；更优选地，所述阿扎霉素F3的结构如式(I)所示，R为H；和/或，所述阿扎霉素F4的结构如式(I)所示，R为CH3。在本发明中，对所述阿扎霉素F3和阿扎霉素F4的来源没有特别的限定，可以为本
技术领域：
的常规选择，例如，可以通过商购获得，或者可以通过微生物手段获得。在本发明的一种优选的实施方式中，阿扎霉素F3和阿扎霉素F4通过CN101720772B中的实施例1公开的方法制备获得。在本发明中，对阿扎霉素与芸薹根肿菌进行接触的条件没有特别的限定，可以为本领域常规使用的条件，例如，所述接触的温度可以为25-30℃，优选为25-28℃。根据本发明，所述阿扎霉素的用量使得接触体系中所述阿扎霉素的浓度为0.5-6ppm，优选为0.5-3ppm。在本发明中，当所述接触体系为液体或气体(即意在抑制液体或气体中的芸薹根肿菌生长)时，“1ppm”表示的是“1μg/mL”；当所述接触体系为固体(即意在抑制固体中的芸薹根肿菌生长)时，“1ppm”表示的是“1μg/g”。第二方面，本发明提供了一种防治十字花科作物根肿病的方法，该方法包括将阿扎霉素施用至十字花科作物。根据本发明，所述阿扎霉素可以按照常规的施用方式对十字花科作物进行施用，优选地，所述阿扎霉素以溶液的形式施用且阿扎霉素溶液的浓度为50-500μg/mL，更优选为100-200μg/mL，进一步优选为200μg/mL。根据本发明，对所述阿扎霉素的施用量没有特别的限定，可以为5-30mg/株/次，优选地，所述阿扎霉素的施用量为5-20mg/株/次，更优选为10mg/株/次(以8-9叶期十字花科作物为基准)。通常地，根据需要，施用频率为每隔7-10天施用一次。根据本发明，所述阿扎霉素为阿扎霉素F类化合物；优选地，所述阿扎霉素为阿扎霉素F3和/或阿扎霉素F4，其中，所述阿扎霉素F3的分子式为C56H95N3O17；和/或，所述阿扎霉素F4的分子式为C57H97N3O17；更优选地，所述阿扎霉素F3的结构如式(I)所示，R为H；和/或，所述阿扎霉素F4的结构如式(I)所示，R为CH3。根据本发明，为了更好地防止十字花科作物根肿病，施用的方式可以为灌根、撒施、喷雾和种子处理中的至少一种，优选为灌根和/或撒施，更优选为灌根。根据本发明，对十字花科作物的种类没有特别的限定，只要是能够发生根肿病的十字花科作物均在本申请的保护范围内。在优选的情况下，所述十字花科作物为甘蓝、白菜、花椰菜、芥菜、萝卜、芜菁和油菜中的至少一种。第三方面，本发明还提供了阿扎霉素在防治十字花科作物根肿病中的用途。所述阿扎霉素为阿扎霉素F类化合物；优选为阿扎霉素F类化合物中的任意一种；更优选为式(I)所示的阿扎霉素F3(R为H)和/或阿扎霉素F4(R为CH3)。阿扎霉素的使用方式(如用量和频率)如前所述，在此不再赘述。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，未特别说明的实验操作均在常规条件下进行。实验使用的甘蓝、白菜、花椰菜和油菜均种植在云南省腾冲县界头镇(由杨佩文采集)；使用的阿扎霉素F3和阿扎霉素F4通过CN101720772B中的实施例1公开的方法制备获得。实施例1本实施例用来说明采用阿扎霉素F3抑制芸薹根肿菌生长的效果。1、芸薹根肿菌的收集分别采集种植于云南省腾冲县界头镇的已产生根肿病的甘蓝、白菜、花椰菜和油菜的病根，将病根组织切片于显微镜下观察，结果在显微镜下观察到休眠孢子囊和游动的休眠孢子，确定为芸薹根肿菌。将采集到的新鲜病根洗净、晾干表面水分后备用。将1g病根压扁，尽量避免破坏根组织，释放出孢子与50mL的无菌蒸馏水混匀，经15层纱布过滤，滤液再次通过中速滤纸过滤，分装到50mL的离心管中，于4500rpm下离心10min，弃去上清溶液，沉淀继续用50mL无菌蒸馏水溶解，重复上述离心过程两次。将第三次离心获得的沉淀中加入5mL25重量％浓度的蔗糖，于3100rpm下离心5min，弃掉上清液，沉淀重悬于5mL无菌蒸馏水中，混匀，即获得分别来自于甘蓝、白菜、花椰菜和油菜的芸薹根肿菌的孢子悬液。2、阿扎霉素F3对芸薹根肿菌孢子的作用使用无菌蒸馏水分别调节上述芸薹根肿菌的孢子悬液至适当的密度(1×105个/mL)。将阿扎霉素F3配制成不同浓度(0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL和6μg/mL)的水溶液，以无菌蒸馏水作为对照组，然后与上述分别来自于甘蓝、白菜、花椰菜和油菜的芸薹根肿菌孢子悬液等体积混合，取一滴滴加在凹玻片上，每个处理3重复，在28℃下保湿培养18h后检查对照孢子的萌发情况。当对照孢子的萌发率达到85％后，检查所有处理的孢子萌发率，以孢子芽管长度大于孢子长度一半者为萌发，找出孢子萌发抑制率为100％时的阿扎霉素F3浓度，即为最低抑制浓度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)，MIC值越低，说明抑菌活性越强。结果如表1所示，阿扎霉素F3对芸薹根肿菌的MIC值均小于等于2μg/mL，说明阿扎霉素F3对芸薹根肿菌的抑制效果较强。表1孢子的来源作用物质MIC值(μg/mL)甘蓝阿扎霉素F30.5甘蓝无菌蒸馏水—白菜阿扎霉素F32白菜无菌蒸馏水—花椰菜阿扎霉素F31花椰菜无菌蒸馏水—油菜阿扎霉素F31.5油菜无菌蒸馏水—注：“—”表示未检测到对芸薹根肿菌的孢子有抑制作用。实施例2本实施例用来说明采用阿扎霉素F4抑制芸薹根肿菌生长的效果。1、芸薹根肿菌的收集同实施例1。2、阿扎霉素F4对芸薹根肿菌孢子的作用按照实施例1的步骤进行，其中，所不同的是使用阿扎霉素F4代替阿扎霉素F3。结果如表2所示，阿扎霉素F4对芸薹根肿菌的MIC值均小于等于2.5μg/mL，说明阿扎霉素F4对芸薹根肿菌的抑制效果较强。表2孢子的来源作用物质MIC值(μg/mL)甘蓝阿扎霉素F41.0甘蓝无菌蒸馏水—白菜阿扎霉素F42.5白菜无菌蒸馏水—花椰菜阿扎霉素F41.5花椰菜无菌蒸馏水—油菜阿扎霉素F42.0油菜无菌蒸馏水—注：“—”表示未检测到对芸薹根肿菌的孢子有抑制作用。实施例3本实施例用来说明采用阿扎霉素F3对白菜根肿病防治效果的测定。选择8-9叶期长势一致的健康白菜进行预防作用和治疗作用的测定。1、预防作用灌根阿扎霉素F3(以200μg/mL的浓度灌根)，24小时后灌根接种浓度为1×105个/mL的由实施例1制备得到的来自于白菜的芸薹根肿菌的孢子悬液，设无菌蒸馏水为空白对照，三者的灌根量均为50mL/株。接种后置于28℃培养箱中保湿培养。每隔7天施用一次。2、治疗作用灌根接种浓度为1×105个/mL的由实施例1制备得到的来自于白菜的芸薹根肿菌的孢子悬液，设无菌蒸馏水为空白对照，然后置于28℃培养箱中保湿培养72h。之后灌根阿扎霉素F3(以200μg/mL的浓度灌根)，三者的喷施量均为50mL/株。随后置于28℃培养箱中保湿培养。每隔7天施用一次。30d后调查发病情况，统计病情指数，计算防治效果。病情调查分级标准：病情指数＝[〔∑(病级株数×代表级数)〕/(调查总株数×最高代表级值)]×100防治效果＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100％阿扎霉素F3对白菜根肿病的防治测试结果如下：对白菜根肿病的预防作用：4次重复平均防治效果为91.6％；对白菜根肿病的治疗作用：4次重复平均防治效果为86.4％；由以上结果可以看出，阿扎霉素F3对白菜根肿病具有很好的防治效果。实施例4本实施例用来说明采用阿扎霉素F4对白菜根肿病防治效果的测定。按照实施例3的方法进行，其中，所不同的是，采用阿扎霉素F4代替阿扎霉素F3。阿扎霉素F4对白菜根肿病的防治测试结果如下：对白菜根肿病的预防作用：4次重复平均防治效果为90.4％；对白菜根肿病的治疗作用：4次重复平均防治效果为84.2％；由以上结果可以看出，阿扎霉素F4对白菜根肿病具有很好的防治效果。实施例5本实施例用来说明采用阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用对白菜根肿病防治效果的测定。按照实施例3的方法进行，其中，所不同的是，采用以1：1重量比混合的阿扎霉素F3和阿扎霉素F4(以200μg/mL的总浓度灌根)代替阿扎霉素F3。阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用对白菜根肿病的防治测试结果如下：对白菜根肿病的预防作用：4次重复平均防治效果为98.8％；对白菜根肿病的治疗作用：4次重复平均防治效果为95.3％；由以上结果可以看出，阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用对白菜根肿病具有很好的防治效果。对比例1按照实施例3的方法进行，其中，所不同的是，采用百菌清代替阿扎霉素F3。百菌清对白菜根肿病的防治测试结果如下：对白菜根肿病的预防作用：4次重复平均防治效果为82.3％；对白菜根肿病的治疗作用：4次重复平均防治效果为71.6％。实施例6本实施例用来说明采用阿扎霉素F3对油菜根肿病防治效果的测定。选择8-9叶期长势一致的健康油菜进行预防作用和治疗作用的测定。1、预防作用撒施阿扎霉素F3(以200μg/mL的浓度撒施)，24小时后撒施接种浓度为3×105个/mL的由实施例1制备得到的来自于油菜的芸薹根肿菌的孢子悬液，设无菌蒸馏水为空白对照，三者的灌根量均为50mL/株。接种后置于28℃培养箱中保湿培养。每隔7天施用一次。2、治疗作用撒施接种浓度为3×105个/mL的由实施例1制备得到的来自于油菜的芸薹根肿菌的孢子悬液，设无菌蒸馏水为空白对照，然后置于28℃培养箱中保湿培养72h。撒施阿扎霉素F3(以200μg/mL的浓度撒施)，三者的喷施量均为50mL/株。随后置于28℃培养箱中保湿培养。每隔7天施用一次。30d后调查发病情况，统计病情指数，计算防治效果，具体同实施例3所示。阿扎霉素F3对油菜根肿病的防治测试结果如下：对油菜根肿病的预防作用：4次重复平均防治效果为91.4％；对油菜根肿病的治疗作用：4次重复平均防治效果为85.1％；由以上结果可以看出，阿扎霉素F3对油菜根肿病具有很好的防治效果。实施例7本实施例用来说明采用阿扎霉素F4对油菜根肿病防治效果的测定。按照实施例5的方法进行，其中，所不同的是，采用阿扎霉素F4代替阿扎霉素F3。阿扎霉素F4对油菜根肿病的防治测试结果如下：对油菜根肿病的预防作用：4次重复平均防治效果为90.6％；对油菜根肿病的治疗作用：4次重复平均防治效果为84.2％；由以上结果可以看出，阿扎霉素F4对油菜根肿病具有很好的防治效果。实施例8本实施例用来说明采用阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用对油菜根肿病防治效果的测定。按照实施例5的方法进行，其中，所不同的是，采用以1：1重量比混合的阿扎霉素F3和阿扎霉素F4(以200μg/mL的总浓度灌根)代替阿扎霉素F3。阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用对油菜根肿病的防治测试结果如下：对油菜根肿病的预防作用：4次重复平均防治效果为97.4；对油菜根肿病的治疗作用：4次重复平均防治效果为91.2％；由以上结果可以看出，阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用对油菜根肿病具有很好的防治效果。对比例2按照实施例5的方法进行，其中，所不同的是，采用百菌清代替阿扎霉素F3。百菌清对油菜根肿病的防治测试结果如下：对油菜根肿病的预防作用：4次重复平均防治效果为81.8％；对油菜根肿病的治疗作用：4次重复平均防治效果为71.1％。通过以上实施例1-8与对比例1-2的结果相对比可以看出，本发明提供的方法能够有效地防治十字花科作物根肿病，并且，由于阿扎霉素可以通过微生物手段获得，具有环境安全的优点，因此，具有广阔的应用前景。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 2 3