一个诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法与流程

技术领域

本发明属于农业生物工程技术领域，涉及大蒜组织培养与快繁的方法，更具体的说是构建一种诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法。

背景技术：

大蒜(Allium sativum L.)是百合科葱属一年生草本植物，在我国种植历史悠久，栽培广泛。大蒜为二倍体植株，其染色体数为 2n=16，主要以肥大的肉质鳞茎和鲜嫩的花茎器官为产品。大蒜品种资源较为丰富，但由于长期进行无性繁殖，无法杂交育种，大蒜的遗传学和生物学多样性不能够得到充分利用，同时一些优良种质也因种性退化而濒临灭绝，因此大蒜的种质资源创新和新品种培育势在必行。自1937年开创倍性育种先河以来，全球掀起了多倍体育种热潮。多倍体育种是近代作物育种常用方法之一，对改良无性繁殖作物的营养器官具有明显的优越性。多倍体植株最明显的特征是相对的“巨大化”、植物生物量及次级代谢产物量高、适应性和抗逆性强等特点。因此，多倍体育种可以提高作物产量、改善作物产品品质、增强作物的抗逆性，是作物品种改良的重要途径。常规多倍体诱导技术由于诱变发生在单个细胞中，整体植株或器官为材料时常产生嵌合体现象，诱变率低，受环境干扰大，畸变率高，可能发生回复突变等。而以植物愈伤组织作为诱变材料，在离体条件下染色体加倍具有显著的优越性：试验条件容易控制，试验结果重复性强，工作效率高，嵌合体发生率低，因此，离体组织的染色体加倍日益受到重视。作为潜在的多倍体育种优势材料，大蒜多倍体育种研究也受到关注，但进展缓慢。目前大蒜的多倍体育种研究，已经实现了采用大蒜茎尖、根尖、花苞等为材料经秋水仙素处理后获得染色体加倍的效果，部分研究获得了染色体加倍的再生植株，但利用大蒜愈伤组织进行多倍体细胞诱导的研究鲜有报道。愈伤组织繁殖系数高，以愈伤组织为诱变材料，处理离体培养的细胞，为大蒜多倍体育种提供了新的途径。化学诱变是多倍体技术诱导普遍采用的方法之一，目前已报道的多倍体诱导剂多属于有丝分裂中期抑制剂，其中秋水仙素是诱导植物细胞染色体加倍最普遍的药剂。已报道的研究中，直接将大蒜再生植株试管苗种植于田间，需较大的人力物力，在生长过程中纤细脆弱，移栽成活率很低，致使大蒜品种改良技术仍受到限制，难以推广。而将试管苗先诱导形成试管鳞茎后无需驯化，可直接将小鳞茎移栽到大田中，易于管理，能明显提高试管苗的移栽成活率。

本发明以宝坻大蒜“六瓣红”的鳞茎片作为外植体诱导的愈伤组织，以不同浓度的秋水仙素作为诱导剂，诱导大蒜愈伤组织染色体加倍，获得四倍体愈伤组织细胞；对加倍后的愈伤组织诱导再分化，再分化的试管苗诱导成试管鳞茎。该的方法为大蒜多倍体育种提供依据，通过试管鳞茎途径再生提高了组培苗的成活率。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开了一种诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法，它是按如下的步骤进行:

（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代

选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30 min以上，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%的 HgCl2浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍备用。将大蒜鳞茎切成0.5-0.8 cm厚的片，接到诱导愈伤组织培养基上，当诱导出淡黄色颗粒状的愈伤组织并且愈伤组织足够多时进行继代培养。所述的继代培养指的是：MS + 1.5 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 KT + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8，其具体的方法如下：无菌条件下，取出淡黄色颗粒状的愈伤组织，分别接到继代培养基上，每瓶接愈伤组织6-8块，置于人工气候箱中培养，培养温度25 ± 2 ℃，光照强度为1500 Lux，光照时间为16 h · d^-1。

（2）秋水仙素诱导愈伤组织加倍体系构建

愈伤组织继代两次后，用0.025%、0.050%、0.100%、0.200%四种不同浓度（w/v）的秋水仙素分别浸泡处理4h、8h、12h、18h、24h，共20种不同的处理，设为实验组；另一个未经任何浓度秋水仙素处理的对照组（CK）。处理结束后分别用蒸馏水冲洗愈伤组织3-4次，在滤纸上吸干。用卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸（v/v）=3:1）过夜固定，用酸解压片方法进行愈伤组织的分裂指数、四倍体率及畸变率观察统计，确定最佳处理体系为秋水仙素浓度为0.2%，处理时间为18小时，四倍体诱导率达到最高为36.36%。

（3）秋水仙素处理愈伤组织再分化不定芽

用最适诱导体系的秋水仙素浸泡处理愈伤组织，无菌蒸馏水冲洗干净后接入继代培养基进行恢复培养，培养基为MS + 1.5 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 KT + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8。恢复培养一段时间后，转移至再分化培养基诱导不定芽。再分化培养基为MS + 3 mg · L^-1 6-BA + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8。

（4）试管鳞茎诱导与收获

将长至5 cm左右的试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS + 120 g · L^-1 绵白糖 + 6.8 g · L^-1琼脂， pH=7.5。试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4 ℃冰箱低温储存。

（5）愈伤组织染色体倍性检测：分别用蒸馏水冲洗用秋水仙素处理过的愈伤组织3-4次，在滤纸上吸干。用卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸（v/v）=3:1）固定，再用蒸馏水冲洗3-4次，于滤纸上吸干，用1M HCl 在60 ℃的水浴中酸解8 min，卡宝品红染色10 min后压片，显微镜下观察染色体形态，分别统计对照组及实验组愈伤组织细胞的分裂指数、四倍体率及畸变率，以确定最适诱导体系。

本发明所述的NAA是 a-萘乙酸（1-naphthlcetic acid），简称NAA ； KT是激动素（Kinetin）,简称KT；

所述的MS基本培养基配方：

每1L基本培养基中含有：KNO3 1900mg, NH4NO3 1650mg, MgSO4∙7H2O 370 mg, KH2PO4 170 mg, CaCl2∙2H2O 440 mg, MnSO4∙4H2O 22.3 mg, ZnSO4∙7H2O 8.6 mg, H3BO3 6.2 mg, KI 0.83 mg, Na2MO3∙2H2O 0.25 mg, CuSO4∙5H2O 0.025 mg, CoCl2∙6H2O 0.025 mg, Na2-EDTA 37.7 mg, FeSO4∙7H2O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 盐酸硫胺素0.4 mg, 盐酸吡哆素0.5 mg, 烟酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

本发明进一步公开了诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎方法在提高组培苗成活率方面的应用。实验结果证明当秋水仙素浓度为0.2%，处理时间为18h时四倍体率最高达36.36%；加倍处理后的愈伤组织经过恢复和继代培养4周后，接入再分化培养基培养6周，待不定芽长到5cm左右即可接入试管鳞茎诱导培养基，6周后可以收获试管鳞茎。通过组培途径诱导发育的试管鳞茎对环境适应性强，耐贮藏，易成活。本发明通过秋水仙素处理大蒜愈伤组织获得加倍后的愈伤组织细胞，诱导再生植株进而获得试管鳞茎，均具有储藏叶，即均具有发芽的潜力。本发明将愈伤组织的高诱导率与试管鳞茎高成活率相结合，为大蒜多倍体育种提出了新的研究思路。

本发明用秋水仙素为诱导剂，诱导大蒜愈伤组织染色体加倍，诱导处理后的愈伤组织经过继代恢复培养，诱导再生试管苗，试管苗直接诱导成具有萌发能力的试管鳞茎，避免了试管苗经过生根、炼苗、移栽等繁琐过程，提高了试管苗成活率。

下面本发明以典型的天津市宝坻大蒜快繁为代表，更加具体的说明实施方案：

（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代

选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30 min以上，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%的 HgCl2浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍备用。将大蒜鳞茎切成0.5-0.8 cm厚的片状，太薄或太厚均不利于愈伤组织的形成。然后将鳞茎片接到诱导愈伤组织培养基中，培养基为MS + 1.5 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 KT + 30 g · L^-1 蔗糖 + 7.5 g · L^-1 琼脂，pH=5.8，121 ℃ (1.03×10⁵ Pa)灭菌20 min。置于人工气候箱中培养，培养温度25 ± 2 ℃，光照强度为1500 Lux，光照时间为16 h · d^-1。当诱导出淡黄色颗粒状的愈伤组织并且愈伤组织足够多时进行继代培养，继代培养基为MS + 1.5 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 KT + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8。约4周后进行第二次继代。

（2）秋水仙素诱导愈伤组织加倍体系构建

愈伤组织继代两次后，取继代培养2周后的生长旺盛的愈伤组织，用0.025%、0.050%、0.100%、0.200%四种不同浓度（w/v）的秋水仙素分别浸泡处理愈伤组织4h、8h、12h、18h、24h，共20种不同的处理，设为实验组；另设一个CK空白对照，即未经任何浓度秋水仙素处理的对照组。处理结束后（时间选在细胞分裂最为旺盛的早上10点到11点）分别用蒸馏水冲洗愈伤组织3-4次，在滤纸上吸干。用卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸（v/v）=3:1）过夜固定，固定时间不超过24h。再用蒸馏水冲洗愈伤组织3-4次，于滤纸上吸干。分别将经过不同处理的愈伤组织材料置于保存液（70%乙醇）中保存，待进行细胞学观察，统计CK对照组及实验组愈伤组织的分裂指数、四倍体率及畸变率。

取保存液中已保存的愈伤组织，蒸馏水冲洗3-4次，于滤纸上吸干，用1M HCl 在60 ℃的水浴中酸解8 min，蒸馏水冲洗3-4次后滤纸吸干，卡宝品红染色10 min后压片，显微镜下观察染色体形态。分别统计CK对照组及实验组愈伤组织细胞的分裂指数、四倍体率及畸变率。实验共重复三次，每次重复中，不同处理下的愈伤组织细胞分别观察并统计了1000个以上。四倍体率相对较高并且畸变率相对较低的实验组处理为最适诱导体系。

（3）秋水仙素处理愈伤组织及再分化不定芽

用最适诱导体系的秋水仙素浸泡处理愈伤组织，无菌蒸馏水冲洗干净后接入继代培养基进行恢复培养，培养基为MS + 1.5 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 KT + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8。

恢复培养一段时间后，将秋水仙素处理后的愈伤组织转移至再分化培养基诱导不定芽，CK对照组的愈伤组织继代两次后直接再分化不定芽。再分化培养基为MS + 3 mg · L^-1 6-BA + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8。

（4）试管鳞茎诱导与收获

将长至5 cm左右的试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，培养基为MS + 120 g · L^-1 绵白糖 + 6.8 g · L^-1琼脂， pH=7.5，观察并记录试管鳞茎的生长状况。试管鳞茎成熟后，从培养瓶中将其取出，并将表层培养基清洗干净后阴干，4 ℃低温储存3周左右待田间种植。

（5）愈伤组织染色体倍性检测：

分别用蒸馏水冲洗用秋水仙素处理过的愈伤组织3-4次，在滤纸上吸干。用卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸（v/v）=3:1）过夜固定，固定时间不超过24h。再用蒸馏水冲洗愈伤组织3-4次，于滤纸上吸干，用1M HCl 在60 ℃的水浴中酸解8 min，蒸馏水冲洗3-4次后滤纸吸干，卡宝品红染色10 min后压片，显微镜下观察染色体形态。分别统计对照组及实验组愈伤组织细胞的分裂指数、四倍体率及畸变率。实验共重复三次，每次重复中，不同处理下的愈伤组织细胞分别观察并统计了1000个以上。四倍体率相对较高并且畸变率相对较低的实验组处理为最适诱导体系。

（6）试管鳞茎萌发潜力检测：

将收获的试管鳞茎进行纵向解剖，观察其是否存在储藏叶，可清晰观察到储藏叶的试管鳞茎即具有萌发潜力，可于田间种植形成再生植株。

本发明公开的诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）该的方法的核心是用秋水仙素高频诱导四倍体愈伤组织，诱导后的愈伤组织经过恢复继代培养，再分化出试管苗，试管苗诱导成试管鳞茎。

（2）所确定的最佳处理体系为秋水仙素浓度为0.2%，处理时间为18小时，四倍体诱导率达到最高为36.36%。该体系既保证了较高的四倍体诱导率，又兼顾了较高的不定芽再分化率。

（3）再分化的不定芽继而诱导成试管鳞茎，避免了传统愈伤组织途径需要经过诱导试管苗生根、炼苗、移栽等繁琐过程，提高了试管苗成活率，节省培育时间，降低生产成本。

（4）本发明优化了各个环节，构建了从愈伤组织诱导、愈伤组织染色体加倍、再分化、试管鳞茎诱导以及试管鳞茎萌发潜力检测的完整方法，该方法在国内外尚未见相关报道。

附图说明

图1为大蒜愈伤组织诱导与继代；a: 刚接入愈伤组织诱导培养基；b-d: 分别为诱导2周、6周及8周的愈伤组织；e: 愈伤组织第一次继代培养4周的状态；f: 愈伤组织第二次继代培养；

图2为二倍体与四倍体大蒜愈伤组织分裂期染色体；a-e: 二倍体愈伤组织的染色体，a: 前期染色体b-c: 中期染色体d: 后期染色体e: 末期染色体，f-l: 四倍体愈伤组织的染色体图，f: 前期染色体g-j: 中期染色体k: 后期染色体l: 末期染色体；

图3为染色体畸变类型；a-d: 多倍体愈伤组织染色体，a: 前期染色体b: 中期染色体c: 后期染色体d: 末期染色体；e-l: 畸变染色体，e: 染色体单桥f: 染色体多桥g: 染色体多桥及染色体不均等分裂h: 微核i: 染色体滞后j-k: 染色体多极化l: 染色体散乱；

图4为 四倍体率及畸变率随秋水仙素浓度及处理时间的变化曲线；a: 四倍体率随秋水仙素处理时间变化曲线；b: 畸变率随秋水仙素处理时间变化曲线；c: 四倍体率随秋水仙素浓度变化曲线；d: 畸变率随秋水仙素浓度变化曲线；

图5为二倍体与四倍体大蒜愈伤组织染色体；a: 二倍体对照组；b: 四倍体愈伤组织染色体；

图6为 秋水仙素诱导愈伤组织加倍及恢复培养：a:秋水仙素浸泡；b:接入恢复培养基；c:恢复培养1周；d:恢复培养4周；e-f:褐化现象；

图7 秋水仙素处理后大蒜愈伤组织再分化及再生试管苗；a: 接入分化培养基；b-f: 分化培养1周、2周、3周、4周、6周的试管苗再生过程

图8 诱导再生苗试管鳞茎；a: 接入诱导试管鳞茎培养基；b-f: 分别为诱导1周、2周、3周、4周、6周的试管鳞茎；

图9试管鳞茎形态及生长点；a: 试管鳞茎；b: 试管鳞茎生长点（图中箭头所示位置）。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中本发明所用到的NAA，KT， 蔗糖，10%安替福民、琼脂均有市售。

实施例1

（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代：

选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30 min以上，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%的 HgCl2浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2:次，75%的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3遍备用。将大蒜鳞茎切成0.5cm厚的片，接到诱导愈伤组织培养基上，当诱导出淡黄色颗粒状的愈伤组织并且愈伤组织足够多时进行继代培养。所述的继代培养指的是：MS + 1.5 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 KT + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8，其具体的方法如下：无菌条件下，取出淡黄色颗粒状的愈伤组织，分别接到继代培养基上，每瓶接愈伤组织6-8块，置于人工气候箱中培养，培养温度25 ± 2 ℃，光照强度为1500 Lux，光照时间为16 h · d^-1。

（2）秋水仙素诱导愈伤组织加倍体系构建

愈伤组织继代两次后，用0.025%、0.050%、0.100%、0.200%四种不同浓度（w/v）的秋水仙素分别浸泡处理4h、8h、12h、18h、24h，共20种不同的处理，设为实验组；另一个未经任何浓度秋水仙素处理的对照组（CK）。处理结束后分别用蒸馏水冲洗愈伤组织3-4次，在滤纸上吸干。用卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸（v/v）=3:1）过夜固定，用酸解压片方法进行愈伤组织的分裂指数、四倍体率及畸变率观察统计，确定最佳处理体系为秋水仙素浓度为0.2%，处理时间为18小时，四倍体诱导率达到最高为36.36%。

（3）秋水仙素处理愈伤组织再分化不定芽

用最适诱导体系的秋水仙素浸泡处理愈伤组织，无菌蒸馏水冲洗干净后接入继代培养基进行恢复培养，培养基为MS + 1.5 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 KT + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8。恢复培养一段时间后，转移至再分化培养基诱导不定芽。再分化培养基为MS + 3 mg · L^-1 6-BA + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8。

（4）试管鳞茎诱导与收获

将长至5 cm左右的试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS + 120 g · L^-1 绵白糖 + 6.8 g · L^-1琼脂， pH=7.5。试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4 ℃冰箱低温储存。

（5）愈伤组织染色体倍性检测：分别用蒸馏水冲洗用秋水仙素处理过的愈伤组织3-4次，在滤纸上吸干。用卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸（v/v）=3:1）固定，再用蒸馏水冲洗3-4次，于滤纸上吸干，用1M HCl 在60 ℃的水浴中酸解8 min，卡宝品红染色10 min后压片，显微镜下观察染色体形态，分别统计对照组及实验组愈伤组织细胞的分裂指数、四倍体率及畸变率，以确定最适诱导体系。所述的NAA是 a-萘乙酸（1-naphthlcetic acid），简称NAA ； KT是激动素（Kinetin）,简称KT；

所述的MS基本培养基配方：

每1L基本培养基中含有：KNO3 1900mg, NH4NO3 1650mg, MgSO4∙7H2O 370 mg, KH2PO4 170 mg, CaCl2∙2H2O 440 mg, MnSO4∙4H2O 22.3 mg, ZnSO4∙7H2O 8.6 mg, H3BO3 6.2 mg, KI 0.83 mg, Na2MO3∙2H2O 0.25 mg, CuSO4∙5H2O 0.025 mg, CoCl2∙6H2O 0.025 mg, Na2-EDTA 37.7 mg, FeSO4∙7H2O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 盐酸硫胺素0.4 mg, 盐酸吡哆素0.5 mg, 烟酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

实施例2

（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代：

将大蒜鳞茎片作为外植体接种到诱导愈伤组织培养基中（图1a），1周左右可以观察到外植体表面增厚膨大并变得蓬松，随后可观察到鳞茎片表面持续膨大形成透明的突起状结构（图1b），约6周后开始出现颗粒状的愈伤组织（图1c），8周左右可观察到大量愈伤组织生成（图1d）。为保证组织活力，防止有毒代谢物积累及培养基枯竭，精选健康的愈伤组织作为新的外植体继代两次，将颗粒状愈伤组织切下转移到继代培养基中进行继代培养，继代4周后，愈伤组织增殖明显（图1e）进行第二次继代培养，继代后的愈伤组织生长良好（图1f）。

（2）秋水仙素诱导愈伤组织加倍体系构建：

取继代两次且生长状况良好的愈伤组织，分别用0.025%、0.050%、0.100%、0.200%四种不同浓度（w/v）的秋水仙素浸泡处理愈伤组织4h、8h、12h、18h、24h，之后用无菌蒸馏水清洗，在固定液中固定并保存于70%乙醇中，CK对照组愈伤组织直接固定并保存，用于倍性鉴定。

取保存液中经过不同处理的愈伤组织，染色观察染色体形态，并统计各个处理下愈伤组织的分裂指数、四倍体率及畸变率。

对照组二倍体大蒜愈伤组织压片镜检可以清晰观察到16条染色体，染色体分裂期形态如图所示（图2a-e）。经秋水仙素诱导后，大蒜愈伤组织染色体出现加倍现象，可以观察到四倍体染色体，染色体分裂期形态如图所示（图2f）。诱导后大蒜愈伤组织有丝分裂中期细胞染色体清晰，染色体的着丝点排列在赤道板上（图2g-j），有丝分裂后期及末期加倍后的染色体分别进入细胞两极（图2k，l）。

当秋水仙素浓度高于0.1%诱导时间12h以上，大蒜愈伤组织染色体畸变现象明显增强，出现嵌合体（图3a-d）并观察到部分愈伤组织染色体分裂异常，出现染色体单桥（图3e）、多桥（图3f）、染色体多桥及染色体不均等分裂（图3g）、微核（图3h）、染色体滞后（图3i）、染色体多极化（图3j，k）及染色体散乱（图3l）等现象。

影响中期分裂指数的主要因素，其中处理18h中期分裂指数较高，继续延长处理时间反而不利于细胞分裂。相同秋水仙素浓度下随处理时间的延长，四倍体率呈先上升后下降趋势。相同处理时间下秋水仙素浓度越高，四倍体率越高。当秋水仙素浓度为0.2%，处理时间为18h时四倍体率最高达36.36%，且差异达极显著水平（p<0.01）。过高的秋水仙素浓度及处理时间不能持续提高细胞四倍体率，反而会导致细胞畸变率上升：

由表1可知，不同秋水仙素浓度及不同处理时间对大蒜愈伤组织细胞中期分裂指数影响不同。相同秋水仙素浓度下随处理时间的延长，中期分裂指数呈先上升后下降趋势。不同秋水仙素浓度下相同处理时间对中期分裂指数影响不明显。可见秋水仙素处理时间是影响中期分裂指数的主要因素，其中处理18h中期分裂指数较高，继续延长处理时间反而不利于细胞分裂。相同秋水仙素浓度下随处理时间的延长，四倍体率呈先上升后下降趋势。相同处理时间下秋水仙素浓度越高，四倍体率越高。当秋水仙素浓度为0.2%，处理时间为18h时四倍体率最高达36.36%，且差异达极显著水平（p<0.01）。过高的秋水仙素浓度及处理时间不能持续提高细胞四倍体率，反而会导致细胞畸变率上升。

表1 不同秋水仙素处理对大蒜愈伤组织的分裂指数、四倍体率及畸变率的影响

注：小写字母在0.05水平上差异显著，大写字母在0.01水平上差异显著；

从图4可以看出，四倍体率随秋水仙素处理时间递增呈现先升高后降低的趋势，18h达到最高值（图4a）；畸变率随秋水仙素处理时间的递增而递增（图4b），同一处理浓度下，处理时间越长，畸变率越高；四倍体率随秋水仙素处理浓度递增而升高（图4c），同一处理时间下，处理浓度越高，四倍体率越高，反之，四倍体率越低；畸变率也随秋水仙素浓度递增而升高（图4d），同一处理时间下，处理浓度越高，畸变率越高，反之，畸变率越低。综上，0.200%的秋水仙素处理愈伤组织18h为最适诱导体系。

图5是以二倍体大蒜“宝坻六瓣红”为对照，用优化后的体系处理愈伤组织的染色体倍性对比，结果表明二倍体大蒜染色体数为2n=2X=16（图5a），四倍体大蒜染色体数为2n=4X=32（图5b）。

3、秋水仙素处理愈伤组织及再分化不定芽

利用上述实验中建立的诱导愈伤组织加倍的的方法（0.200%的秋水仙素处理愈伤18h）处理继代培养2周且生长旺盛的愈伤组织（图6a），处理结束后，在无菌条件下取出愈伤组织，用无菌蒸馏水冲洗3-5次，滤纸吸干，置于继代培养基（MS + 1.5 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 KT + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8）上恢复培养（图6b）。1周后，愈伤组织表面出现新生的组织（图6c）。4周后，愈伤组织生长旺盛（图6d），可用于再生分化。部分经过秋水仙素处理的愈伤组织在恢复培养中出现褐化现象（图6e，f），可能是由于秋水仙素毒性造成细胞生理活性降低甚至死亡。

将恢复培养后生长旺盛的愈伤组织置于再分化培养基上（图7a），再分化培养基为MS + 3 mg · L^-1 6-BA + 30 g · L^-1蔗糖 + 7.5 g · L^-1琼脂，pH=5.8，1周左右时愈伤组织没有明显再分化现象（图7b），约2周左右可以观察到愈伤组织表面开始出现绿点（图7c），绿点不断生长，逐渐形成不定芽（图7d），4周左右不定芽长至约2cm（图7e），6周后不定芽生长旺盛，约5 cm左右，可用于诱导试管鳞茎（图7f）。

4、试管鳞茎诱导与收获

将生长至5 cm左右的试管苗移入诱导试管鳞茎培养基（图8a），培养基为MS + 120 g · L^-1绵白糖 + 6.8 g · L^-1琼脂，pH=7.5。移植1周左右试管苗基部开始膨大，逐渐形成试管鳞茎（图8b），试管鳞茎不断膨大（图8c，d），4周左右试管鳞茎表皮开始呈现紫色，趋于成熟（图8e），6周后试管苗枯萎，试管鳞茎完全成熟（图8f），可以收获。

将收获的试管鳞茎进行解剖观察（图9），可清晰观察到生长点（图9b），表明收获的试管鳞茎可于田间再生出植株，这为后期再生植株田间性状观察及细胞学倍性鉴定奠定了基础。