本发明属于干细胞领域，涉及肿瘤干细胞的冻存，具体涉及一种乳腺癌干细胞冻存保护剂及制成的冻存保护试剂盒。
背景技术：
申请人同日申请了“一种从乳腺癌细胞株中富集乳腺癌干细胞的试剂、试剂盒”，该申请提供的试剂能有效从人乳腺癌MCF-7细胞系中便捷、高效地富集得到乳腺癌干细胞，细胞球形成周期短(由现有技术的7天缩短至3天且形成效率显著提高)、微球体细胞中CD44+CD24-/low分子标记的肿瘤细胞和SP细胞含量高(均由现有技术的10％以下提高到50％以上)，可以开发成试剂盒提高科研工作者富集乳腺癌干细胞的效率。
本申请是为了解决另一个问题：富集到的乳腺癌干细胞如何冻存以最大限度的保留其乳腺癌干细胞特性？研究者不可能每次需要用乳腺癌干细胞时都重新进行乳腺癌细胞的培养、富集，通常都需要根据实验进度对乳腺癌干细胞进行冻存、复苏后继续传代使用。乳腺癌干细胞的冻存方法关乎到复苏后的乳腺癌干细胞所能传代的次数以及特性保持。
申请人对现有技术进行了检索，未发现专用于乳腺癌干细胞的冻存保护剂。考虑到乳腺癌干细胞也是一种干细胞，而现有技术对干细胞的冻存保护剂研究较多。
冷冻保存的目的是在液氮的低温环境下减缓细胞的代谢活动并维持生命。在细胞悬液的冷冻过程中，冰晶的形成是导致细胞死亡的主要原因之一。避免冰晶的形成就要保持冷却速率缓慢，以使冻存保护剂逐渐进入细胞内部形成浓度梯度。当冷却持续进行时，细胞内的水分在冻存剂的渗透压力下逐步流出细胞，当细胞内的冻存剂浓度达到最大时细胞就会完全脱水皱缩达到最佳冻存状态。如果冻存速率太快就不能让细胞内的水分完全出胞，从而导致细胞内的冰晶形成而对细胞造成损伤。但冻存液对细胞有一定毒性作用，冻存速率过低会导致细胞在冻存液中暴露的时间过长而导致细胞受毒。由冻存保护剂造成的细胞毒性和细胞内冰晶造成细胞损伤这两种冻存伤害已被广泛认同。
除了冷冻速率，冷冻保护剂也是减小冻存损伤需要考虑的重要因素之一。冷冻保护剂根据穿过细胞膜的能力被分为渗透性保护剂和非渗透保护剂。渗透性冷冻保护剂有二甲基亚砜、丙三醇、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、甲酰胺等，主要作用是防止细胞内冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水。渗透性保护剂的保护能力是由许多小分子构成的高溶解度的水溶性复合物，在高浓度下能够降低水的冰点，因此在冷冻过程中降低了大量冰晶的形成。非渗透性冷冻保护剂有海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、聚合物羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮，它们能够在较低的浓度下保护细胞，但要求更高的冷冻速率。如聚合物羟乙基淀粉不能渗入导致细胞外的浓度增大，在低温下形成反渗透而脱水起到保护作用。换言之，非渗透性冷冻保护剂集中在细胞外导致细胞脱水主要是在冷冻的初始阶段。海藻糖的保护作用是和脂膜之间的相互作用，在冻存和复苏的过程中保持了蛋白质的稳定性，而且能够形成玻璃化基质抑制细胞内冰晶产生。但即便是非渗透性的保护剂，也是能引起细胞损伤的。
以间充质干细胞的冻存研究为例。为比较冻存率、冷冻保护剂和冻存时间对MSCs的影响，研究者们做了大量的研究。早在1997年，有研究将人骨髓MSCs用10％的DMSO在1℃/min到-80℃后冻存在液氮中，24h复苏后传代到15代依然保持成骨分化的能力[Growth kinetics,self-renewal,and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation.J Cell Biochem.1997Feb；64(2):278-94.]。随后，有研究用10％的DMSO将从人骨髓中分离得到MSCs在1℃/min降至-70℃后在液氮中保存7d，和未冻存的MSCs相比在增殖速率和成骨分化能力上没有显著的差异[Characterisation of cryopreserved cells freshly isolated from human bone marrow.Cryo Letters.2006Jan-Feb；27(1):17-28.]。有研究将人脐带血MSCs用10％DMSO和10％FBS的冻存液冻存在-70℃后在液氮中保存，用台盼蓝染色的方法得到保存了5a的存活率为80％±10％，冻存2a的为89％±5％，并且复苏后仍有成纤维的形态，并能鉴测到CD73、CD90和CD105表面抗原，用茜素红染色钙沉积和阿尔新蓝染色蛋白聚糖的方法表明复苏后的MSCs仍保持成骨和成软骨的的分化能力[C-2012:Post-thaw characterization of cord blood-derived mesenchymal stromal cells cryopreserved for up to five years.Cryobiology,2014,69(3):519]。这些研究的重点都是在MSCs冻存后的最高细胞存活率和功能，最大化保证冻存后的MSCs和最新分离出来的MSCs表现相同特性。
遗憾的是，现有技术中这些针对干细胞的冻存保护剂并不能很好地适用于乳腺癌干细胞的冻存，难以有效保持乳腺癌干细胞冻存前的生物学特性。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种乳腺癌干细胞冻存保护剂及由此制成的冻存保护试剂盒，以有效减少冻存对乳腺癌干细胞的损伤。
技术方案公布如下：
一种乳腺癌干细胞冻存保护剂，用于冻存保护MCF-7乳腺癌干细胞，由无血清培养基冻干粉和胎牛血清FBS组成；所述无血清培养基冻干粉由如下方法制备：在DMEM/F12培养液中添加常规生长因子、加兰他敏和石蒜碱，常规生长因子包括重组人表皮生长因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰岛素和B27，配制成EGF浓度为15-25g/L、BSA浓度为3-5g/L、胰岛素浓度为4-6mg/L、浓度为1.5-2.5％、加兰他敏浓度为50-100nmol/L、石蒜碱浓度为50-100nmol/L的培养液，于37℃、5％CO2条件下摇床保存20-28h，冷冻干燥。
优选地，所述无血清冻干粉浓度为60-90g/L。
优选地，所述的乳腺癌干细胞冻存保护剂由无血清培养基冻干粉和胎牛血清FBS组成，无血清冻干粉浓度为75g/L；所述无血清培养基冻干粉由如下方法制备：在DMEM/F12培养液中添加常规生长因子、加兰他敏和石蒜碱配制成EGF浓度为20g/L、BSA浓度为4g/L、胰岛素浓度为5mg/L、浓度为2％、加兰他敏浓度为75nmol/L、石蒜碱浓度为75nmol/L的培养液，于37℃、5％CO2条件下摇床保存24h，冷冻干燥。
一种乳腺癌干细胞冻存保护试剂盒，与胎牛血清FBS配合用于冻存保护MCF-7乳腺癌干细胞，包括分装的无血清培养基冻干粉，无血清培养基冻干粉由如下方法制备：在DMEM/F12培养液中添加常规生长因子、加兰他敏和石蒜碱配制成EGF浓度为20g/L、BSA浓度为4g/L、胰岛素浓度为5mg/L、浓度为2％、加兰他敏浓度为75nmol/L、石蒜碱浓度为75nmol/L的培养液，于37℃、5％CO2条件下摇床保存24h，冷冻干燥。
优选地，所述的乳腺癌干细胞冻存保护试剂盒还包括干燥剂或防腐剂或抗氧化剂。
发明效果：
本发明提供的冻存保护剂是在MCF-7乳腺癌干细胞富集培养基的基础上设计而成，能有效减少冻存对乳腺癌干细胞的损伤，复苏后的细胞存活率高，致瘤能力强，与冻存前无显著差异，显著优于现有技术。基于此制备的试剂盒有助于促进该冻存保护剂的商品化和标准化，为科研工作者提供便利。
具体实施方式
下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。
实施例1：不同冻存保护剂对乳腺癌干细胞冻存复苏后存活率和致瘤性的影响
1、实验材料
MCF-7乳腺癌干细胞富集用含血清培养基：DMEM/F12培养液中加入10％的胎牛血清FBS和双抗、加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比为1:1。1L培养基加入10ml青霉素-链霉素溶液(100×双抗，北京雷根生物技术有限公司)。
MCF-7乳腺癌干细胞富集用无血清培养基：DMEM/F12培养液中加入双抗(浓度同上)、重组人表皮生长因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰岛素5mg/L、B272％(1L培养基加20ml 50X B27)、加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比为1:1。
MCF-7乳腺癌干细胞传代用无血清培养基：DMEM/F12培养液中加入双抗(浓度同上)、重组人表皮生长因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰岛素5mg/L、B272％(1L培养基加20ml 50X B27)，无需添加加兰他敏和石蒜碱。
本发明冻存保护剂：由无血清培养基冻干粉和胎牛血清FBS组成，无血清冻干粉浓度为75g/L；所述无血清培养基冻干粉由如下方法制备：在DMEM/F12培养液中添加常规生长因子、加兰他敏和石蒜碱配制成EGF浓度为20g/L、BSA浓度为4g/L、胰岛素浓度为5mg/L、浓度为2％、加兰他敏浓度为75nmol/L、石蒜碱浓度为75nmol/L的培养液，于37℃、5％CO2条件下摇床保存24h，冷冻干燥。
对比冻存保护剂：基于DMSO的标准冻存液，由10％DMSO和90％胎牛血清FBS组成。
2、实验方法
(1)贴壁培养MCF-7细胞系
MCF-7细胞系在上述MCF-7乳腺癌干细胞富集用含血清培养基中于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养，贴壁后当细胞增殖至85％左右时，处于对数生长期，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化、离心、重悬后传代。
(2)微球体培养(MCF-7乳腺癌干细胞富集)
取第2代处于对数生长期的MCF-7细胞用上述MCF-7乳腺癌干细胞富集用无血清培养基重悬细胞以2×104/mL接种至塑料培养瓶中于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养每2-3天更换1次培养液，第3、5、7天计数其中的微球体数目、大小，并计算微球体形成效率。其中，微球体形成效率＝微球体数目/接种细胞数×100％。定义≥60μm的球体为微球体。把25cm2的培养瓶底面分割成25个等面积的小格，随机选取15个小格，计数≥60μm的微球体的数量。
(3)MCF-7乳腺癌干细胞冻存
实验组：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干细胞消化液；消化第3天微球体并吹打；镜下见大多数单细胞形成时终止消化，1500r/min离心6min，吸弃上清；加入本发明冻存保护剂，吸吹均匀，细胞浓度调整至1×106个/mL，分装于冻存管中，标记冻存日期。按照非程序化冻存法冻存(-4℃，1h；置厚壁泡沫中于-80℃保存)。
对照组：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干细胞消化液；消化第3天微球体并吹打；镜下见大多数单细胞形成时终止消化，1500r/min离心6min，吸弃上清；加入对比冻存保护剂，吸吹均匀，细胞浓度调整至1×106个/mL，分装于冻存管中，标记冻存日期。按照非程序化冻存法冻存(-4℃，1h；置厚壁泡沫中于-80℃保存)。
(4)复苏方法
将冻存1周的细胞置于60℃恒温水浴箱中，0.5min内快速复苏。融化后迅速移入离心管中，加入DMEM/F12培养基，吹吸均匀，以1000r/min离心5min，弃去上清。重复1次。
(5)复苏后的细胞存活率测定
将复苏细胞用台盼蓝染色后，利用血细胞计数板计数细胞，测定台盼蓝拒染率，并与冷冻前相比较，计算细胞存活率：细胞存活率＝(1-台盼蓝染色细胞数/总细胞数)×100％。
(6)致瘤性测定
A、冻存前致瘤性测定用细胞悬液的制备：
第3天微球体单细胞悬液的制备：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干细胞消化液；消化微球体并吹打；镜下见大多数单细胞形成时终止消化，1500r/min离心6min，吸弃上清；加入DMEM/F12培养液重悬制成浓度2×102/ml、2×104/ml、2×106/ml单细胞悬液。
B、实验组冻存后致瘤性测定用细胞悬液的制备：
将复苏细胞以1×105/mL接种至上述MCF-7乳腺癌干细胞传代用无血清培养基于37℃、5％CO2的培养箱内培养48小时后将其消化加入DMEM/F12培养液重悬制成浓度2×102/ml、2×104/ml、2×106/ml单细胞悬液。
C、对照组冻存后致瘤性测定用细胞悬液的制备：
将复苏细胞以1×105/mL接种至上述MCF-7乳腺癌干细胞传代用无血清培养基于37℃、5％CO2的培养箱内培养48小时后将其消化加入DMEM/F12培养液重悬制成浓度2×102/ml、2×104/ml、2×106/ml单细胞悬液。
将上述单细胞悬液分别接种于小鼠左、右背部皮下，每部位接种0.2ml。观察接种后8周的肿瘤生长情况。
3、实验结果
(1)细胞存活率
实验组细胞存活率为(96.4±4.9)％；对照组细胞存活率为(77.8±4.2)％。
由此可见，与现有技术中基于DMSO的标准冻存液相比，本发明提供的冻存保护剂具有更为优异的保护效果，能最大限度避免乳腺癌干细胞在冻存过程中的死亡。
(2)致瘤性
8周后各组成瘤情况如下表(√代表成瘤；×代表未成瘤)：
由此可见，与现有技术中基于DMSO的标准冻存液相比，本发明提供的冻存保护剂具有更为优异的保护效果，能最大限度保护乳腺癌干细胞的致瘤性。
实施例2：冻存保护试剂盒
一种乳腺癌干细胞冻存保护试剂盒，与胎牛血清FBS配合用于冻存保护MCF-7乳腺癌干细胞，包括分装的无血清培养基冻干粉，无血清培养基冻干粉由如下方法制备：在DMEM/F12培养液中添加常规生长因子、加兰他敏和石蒜碱配制成EGF浓度为20g/L、BSA浓度为4g/L、胰岛素浓度为5mg/L、浓度为2％、加兰他敏浓度为75nmol/L、石蒜碱浓度为75nmol/L的培养液，于37℃、5％CO2条件下摇床保存24h，冷冻干燥。
试剂盒中还可以设有分包装的硅胶干燥剂或防腐剂或抗氧化剂等。
本发明提供的冻存保护剂是在MCF-7乳腺癌干细胞富集培养基的基础上设计而成，能有效减少冻存对乳腺癌干细胞的损伤，复苏后的细胞存活率高，致瘤能力强，与冻存前无显著差异，显著优于现有技术。基于此制备的试剂盒有助于促进该冻存保护剂的商品化和标准化，为科研工作者提供便利。
上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。