本发明涉及一种细胞冻存液，尤其涉及一种直接静脉回输的免疫细胞冻存液及其应用方法。本发明属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：癌症是困扰人类健康的首要问题，细胞免疫治疗为肿瘤的预防和治疗提供了广阔的前景。但是在临床实际应用的过程中，存在部分肿瘤患者自身免疫细胞难以采集、细胞扩增能力差、免疫细胞与其它治疗方式的时间窗口难以配合等诸多问题；此外，从药物研发和生产的角度，新鲜免疫细胞的异地运输、保存条件和存活时间都受到一定限制。所以，免疫细胞的有效冻存为免疫细胞作为药物进行产业化应用提供必要的基础技术保障。但是，目前市面上的免疫细胞冻存液多以胎牛血清、高比例DMSO、患者自体血浆、非临床应用级试剂配制而成，这些冻存液存在以下问题：1.冻存效果差；2.冻存液成分不明确；3.冻存过程和后续应用程序相对繁琐；4.成本过高；5.临床应用存在风险性；6.不适于形成产业化。例如：公开号为CN104026118A的专利申请公开了一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该申请用二甲基亚砜、灭活的人自体血浆及免疫细胞培养基成分，通过程序降温的方法冻存免疫细胞。其存在的技术问题是该申请的冻存液所使用患者灭活的自体血浆，数量和来源有限，不适合细胞扩增培养后的大规模冻存，且冻存过程繁琐，批次控制较难。公开号为CN105248413A的专利申请公开了一种CIK细胞冻存液，该申请使用二甲基亚砜、葡萄籽提取物、棉籽糖、人血白蛋白、胎牛血清冻存CIK细胞。其存在的技术问题是该申请的冻存液含有动物源性血清，有动物源性抗原物质的引入的潜在风险，不能用于人体直接回输。公开号为CN105211051A的专利申请公开了一种培养后的NK细胞的冻存液及其制备方法，该申请用二甲基亚砜、灭活的人自体血浆，添加葡萄籽提取物、茶多酚和维生素C作为冻存液的成分。其存在的技术问题是该申请的冻存液所使用患者自体灭活血浆，数量和来源有限，不适合细胞扩增培养后的大规模冻存。公开号为CN105123671A的专利申请公开了一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法，该申请用二甲基亚砜、丙二醇、细胞培养基、人血白蛋白，添加非必需氨基酸、海藻糖、香菇多糖、维生素C作为冻存液的成分。其存在的技术问题是该申请该冻存液主要成分为细胞培养基，不具有稳定剂的作用，不可直接用于临床回输。公开号为CN104862275A的专利申请公开了一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂，该申请用二甲基亚砜、1640细胞基础培养基、胎牛血清、右旋糖酐，ddH2O作为冻存液的成分。其存在的技术问题是该申请的冻存液含有动物源性血清，有动物源性抗原物质的引入的潜在风险，不能用于人体直接回输。综上所述，现有冻存液有效成分多含有科研级别的细胞培养基和胎牛血清等成分，不能直接应用于人体输注，且价格不菲。因此有必要研究一种冻存效果更好、价格更低廉、使用更方便、应用更安全的免疫细胞冻存液。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的冻存效果差、冻存液成分不明确、冻存过程和后续应用程序相对繁琐、成本过高、临床应用存在风险性、不适合规模化生产等缺陷，提供一种直接静脉回输的免疫细胞冻存液及其应用方法。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：本发明的一种直接静脉回输的免疫细胞冻存液，其由A液和B液组成，其中，所述的A液含有以下各成分：二甲基亚砜4-16v/v％，羟乙基淀粉0.3-5.5w/v％，右旋糖酐0.3-5.5w/v％，葡萄糖0.5-5w/v％，肝素钠1-1000U/ml，其余为医用注射液；所述的B液为含有2-25w/v％人血白蛋白的医用注射液。在本发明中，优选的，A液中各成分的含量为：二甲基亚砜8.3v/v％，羟乙基淀粉2.75w/v％，右旋糖酐2.75w/v％，葡萄糖2.29w/v％，肝素钠625U/ml，其余为医用注射液；所述的B液为含有20w/v％人血白蛋白的医用注射液。在本发明中，优选的，所述的医用注射液包括但不限于：无菌注射用水、生理盐水、电解质注射液、右旋糖酐注射液或羟乙基淀粉氯化钠注射液中的一种或两种以上。用于制备本发明所述冻存液的原料可以是原料药或是经溶液配制而成的药品成品。例如羟乙基淀粉可以是羟乙基淀粉氯化钠注射液，右旋糖酐、葡萄糖可以是右旋糖酐40葡萄糖注射液，肝素钠可以为肝素钠注射液。只要其有效成分的终浓度满足上述要求即可。本发明通过二甲基亚砜、人血白蛋白、右旋糖酐、羟乙基淀粉、肝素钠的优化配比，均采用临床药用级别的原料，用医用注射液配制而成。一方面避免了动物源性物质污染的风险，另一方面，免疫细胞冻存效果较常规冻存液更好。从而保证了临床使用的安全性和有效性。此外，本方法操作简单，适合大规模冻存的实施，细胞复苏后可直接输注，便于临床的实施。进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的冻存液在冻存免疫细胞中的应用。其中，优选的，所述的免疫细胞包括但不限于：T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞、γδT细胞、CAR-T细胞。更进一步的，本发明还提出了一种体外冻存免疫细胞的方法，包括以下步骤：1)将本发明所述的冻存液的A液和B液按体积比3:2混匀，置于4℃冰箱预冷；2)收集需要冻存的免疫细胞，洗涤两遍；3)用预冷的冻存液重悬免疫细胞，转移至冻存袋中，置于4℃冰箱平衡或若步骤3)的操作时间已长于30min可跳过平衡步骤直接进行步骤4)；4)将装有细胞的冻存袋置于-80℃冰箱过夜后转移至液氮罐长期保存。在本发明中，优选的，冻存的免疫细胞使用时，从液氮罐中迅速取出冻存袋，置于37℃水浴至完全融化，解冻后在1小时内完成静脉输注。在本发明中，优选的，4℃冰箱平衡的时间为1-30min,。在本发明中，优选的，所述的免疫细胞包括但不限于：T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞、γδT细胞、CAR-T细胞。在本发明中，优选的，所述的免疫细胞冻存密度为1×106/ml-1×108/ml。相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明克服了现有技术中存在的冻存效果差、冻存液成分不明确、冻存过程和后续应用程序相对繁琐、成本过高、临床应用存在风险性、不适合规模化生产等缺陷，提供了一种直接静脉回输的免疫细胞冻存液及应用方法。和常规冻存方法相比：1.该方法复苏后的免疫细胞与新鲜培养的免疫细胞相比，其免疫生物学特性(细胞活力、凋亡水平、免疫表型等)和生物学功能(对靶细胞的杀伤效果、细胞因子分泌水平等)无显著差异；2.本发明的冻存液原料明确，无动物源成分，且均为临床药用级，具备临床应用安全性；3.不使用患者自体血浆，原料数量和来源不受限且成本低，适合形成产业化；4.冻存液通过组份储存方式，存储稳定性好；5.DMSO含量相对较低，且通过冻存液的预冷降低冻存液中DMSO的细胞毒性；6.免疫细胞冻存过程无需长时间程序降温；7.复苏后无需常规离心清洗步骤，可直接进行静脉回输，极大的方便了临床应用。综上，本发明摒弃了常规冻存液中不适用于临床的成份，选用临床常用的药物经过科学的配比制成冻存液，且用科学的储存方式简化冻存液配制操作，再通过优化的冻存方法简化操作步骤、提升冻存效果，为免疫细胞治疗的实施提供了基本的保障。与现有的技术相比，本发明不仅安全性高，不含有潜在致病风险的动物源性血清，通过两种组份可以长期稳定保存。并且该冻存方法简便易行，能够适用于临床大规模操作的要求，且冻存效果优于常规冻存方法，细胞复苏后可以直接输注，减少了中间繁琐的处理环节和洗涤对细胞的损伤。且原料成本低，适合产业化生产，能够产生巨大的经济效益。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例1：直接静脉回输的免疫细胞冻存液的制备及应用1、所用原料及规格羟乙基淀粉氯化钠注射液：500ml:羟乙基淀粉(200/0.5)30g右旋糖酐40葡萄糖注射液：500ml:30g右旋糖酐40与25g葡萄糖肝素钠注射液：2ml:1.25万单位人血白蛋白注射液：50ml：10g总蛋白2、直接静脉回输的免疫细胞冻存液的制备及应用1)分别配制A液和B液A液(100ml)：8.3ml二甲基亚砜+45.8ml羟乙基淀粉氯化钠注射液+45.8ml右旋糖酐40葡萄糖注射液+0.1ml肝素钠注射液。A液中各成分的含量为：二甲基亚砜8.3v/v％，羟乙基淀粉2.75w/v％，右旋糖酐2.75w/v％，葡萄糖2.29w/v％，肝素钠625U/ml，其余为医用注射液。B液(100ml)：20w/v％人血白蛋白的注射液。2)将A液与B液按体积比3:2混匀，置于4℃冰箱待用。3)抽取健康志愿者外周血50ml，缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，500g离心20分钟，吸取白膜层细胞。用PBS洗涤两遍，计数。4)根据计数结果，用2)中配制好、预冷的冻存液重悬PBMC细胞，使得细胞密度在1×107/ml，将细胞转移至冻存袋。5)将装有细胞的冻存袋放置4℃冰箱平衡15min。6)将装有细胞的冻存袋放置-80℃冰箱过夜。6)将装有细胞的冻存袋放置液氮保存。7)1、6、12个月后从液氮罐取出细胞，置于37℃水浴锅解冻，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞活率。同时采用对照冻存液(50％FBS+40％RPMI1640+10％DMSO)处理的PBMC细胞作为对照，除冻存液外，其他步骤同上。3、结果采用不同冻存液的PBMC复苏活率比较如表1所示：表1采用不同冻存液的PBMC复苏活率比较本发明的冻存液对照冻存液1个月活率98.5％87.1％6个月活率96.2％85.4％12个月活率93.7％80.7％实施例2:直接静脉回输的免疫细胞冻存液的制备及应用1、所用原料及规格羟乙基淀粉氯化钠注射液：500ml:羟乙基淀粉(200/0.5)30g右旋糖酐40葡萄糖注射液：500ml:30g右旋糖酐40与25g葡萄糖肝素钠注射液：2ml:1.25万单位人血白蛋白注射液：50ml：5g总蛋白2、直接静脉回输的免疫细胞冻存液的制备及应用1)分别配制A液和B液A液(100ml)：10ml二甲基亚砜+70ml羟乙基淀粉氯化钠注射液+19.9ml右旋糖酐40葡萄糖注射液+0.1ml肝素钠注射液A液中各成分的含量为：二甲基亚砜10v/v％，羟乙基淀粉4.2w/v％，右旋糖酐1.19w/v％，葡萄糖1.0w/v％，肝素钠625U/ml，其余为医用注射液；B液(100ml)：10w/v％的人血白蛋白注射液2)将A液与B液按照体积比3:2混匀，置于4℃冰箱待用。3)取培养扩增后的NK细胞至离心管中，300g离心10min。用PBS洗涤两遍，计数。4)根据计数结果，用2)中配制好、预冷的冻存液重悬NK细胞，使得细胞密度在1×108/ml，将细胞转移至冻存袋。5)将装有细胞的冻存袋放置4度冰箱平衡15min。6)将装有细胞的冻存袋放置-80℃冰箱过夜。6)将装有细胞的冻存袋放置液氮保存。7)1、6、12个月后从液氮罐取出细胞，置于37℃水浴锅解冻，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞活率。同时采用对照冻存液(50％FBS+40％RPMI1640+10％DMSO)处理NK细胞作为对照，除冻存液外，其他步骤同上。3、结果采用不同冻存液的NK复苏活率比较如表2所示：表2采用不同冻存液的NK细胞复苏活率比较实施例2实施例2对照1个月活率96.4％82.6％6个月活率92.8％75.3％12个月活率90.5％60.2％实施例3:直接静脉回输的免疫细胞冻存液的制备及应用1、所用原料及规格羟乙基淀粉氯化钠注射液：500ml:羟乙基淀粉(200/0.5)30g右旋糖酐40葡萄糖注射液：500ml:30g右旋糖酐40与25g葡萄糖肝素钠注射液：2ml:1.25万单位。人血白蛋白注射液：50ml：5g总蛋白2、直接静脉回输的免疫细胞冻存液的制备及应用1)分别配制A液和B液A液(100ml)：9ml二甲基亚砜+33ml羟乙基淀粉氯化钠注射液+57.9ml右旋糖酐葡萄糖注射液+0.1ml肝素钠注射液。A液中各成分的含量为：二甲基亚砜9v/v％，羟乙基淀粉1.98w/v％，右旋糖酐3.47w/v％，葡萄糖2.9w/v％，肝素钠625U/ml，其余为医用注射液；B液(100ml)：10w/v％的人血白蛋白注射液。2)将A液与B液按3:2混匀，置于4℃冰箱待用。3)取培养扩增后的CAR-T细胞至离心管中，300g离心10min。用PBS洗涤两遍，计数。4)根据计数结果，用2)中配制好、预冷的冻存液重悬CAR-T细胞，使得细胞密度在5×107/ml，将细胞转移至冻存袋。5)将装有细胞的冻存袋放置4℃冰箱平衡15min。6)将装有细胞的冻存袋放置-80℃冰箱过夜。6)将装有细胞的冻存袋放置液氮保存。7)1、6、12个月后从液氮罐取出细胞，置于37℃水浴锅解冻，取少量细胞用台盼蓝染色法检测细胞活率。同时采用对照冻存液(50％FBS+40％RPMI1640+10％DMSO)处理的CAR-T细胞作为对照，除冻存液外，其他步骤同上。3、结果采用不同冻存液的CAR-T复苏活率比较如表3所示：表3采用不同冻存液的CAR-T细胞复苏活率比较实施例3实施例3对照1个月活率98.1％85.5％6个月活率96.7％80.5％12个月活率93.3％72.4％以上实施例只为说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。当前第1页1 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