本发明涉及一种免疫细胞冻存液及其应用，属于细胞培养领域。更具体地，涉及免疫细胞冻存液、用于冻存免疫细胞的试剂盒以及冻存免疫细胞的方法。
背景技术：
细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义，尤其是免疫细胞用于回顾性研究时更为重要。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态最好或战斗力最强时期的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。
正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复苏，导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。通常，免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。
目前现有的细胞冻存液不能有效保存大规模培养的免疫细胞，冻存后的细胞复苏后细胞数量以及细胞活力都无法满足临床应用的标准，导致免疫细胞体外大规模培养后，必须短时间内尽快应用，否则就只能废弃。
由此，适用于大量的免疫细胞的体外冻存液有待改进。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性的冻存液。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
DMSO是常用的细胞冷冻保存剂，单独使用保存免疫细胞存活率低。因而，发明人致力于寻找能够促进冷冻保存下免疫细胞存活率的成分，以便与DMSO联用，以便通过其与DMSO协同作用，达到能够长期保存免疫细胞的效果。例如，发明人利用DMSO(二甲基亚砜，Dimethyl sulfoxide)协同海藻糖对免疫细胞进行冷冻保存，发现细胞存活率明显下降，冷冻保存作用并不理想。然而，人血清白蛋白在冷冻复苏过程中能够调节渗透压，而血浆中又含有多种营养成分，因而，发明人尝试将血浆和HSA(人血清白蛋白，Human Serum Albumin)与DMSO结合，制备免疫细胞的冻存液，结果发现，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
白酒草系菊科白酒草属植物Conyza japonica(Thunb.)Less的全草，颜世伦等曾经报道从白酒草中分离得到化合物白酒草皂苷R，结构鉴定为3-O-β-D-glucopyranosyl medicagenic acid 28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[β-D-apiofuranosyl-(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl ester，其结构式为：
本发明人还惊讶地发现，微量白酒草皂苷R，血浆和HSA(人血清白蛋白，Human Serum Albumin)与DMSO结合制备免疫细胞的冻存液，可以降低DMSO的使用量，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫细胞冻存液。根据本发明的实施例，该冻存液包含2-10体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；20-88体积％的血浆；以及余量培养基。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存免疫细胞，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，并且细胞回收率高。
因而，根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种免疫细胞冻存液。根据本发明的实施例，该冻存液包含0.2-0.8体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；0.001g/ml的白酒草皂苷R，20-88体积％的血浆；以及余量培养基。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存免疫细胞，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，并且细胞回收率高。
根据本发明的实施例，所述DMSO的浓度为10体积％。由此，对免疫细胞的冻存效果好。
根据本发明的实施例，所述HSA的浓度为5体积％。由此，冷冻复苏过程中渗透压调节效果好，从而能够有效保护细胞，提高细胞存活率，并且保证冻存液成本。
根据本发明的实施例所述血浆的浓度为40体积％。由此，对细胞的保护作用突出，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力。
根据本发明的实施例，所述血浆为自体血浆。
根据本发明的实施例，所述培养基为1640培养基或Stemspan培养基。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞为自然杀伤细胞和树突状细胞。由此，冻存效果好。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于冻存免疫细胞的试剂盒，其包含前面所述的免疫细胞冻存液。发明人惊奇的发现，该试剂盒能够有效用于冻存免疫细胞，且细胞有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种冻存免疫细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的免疫细胞冻存液或者试剂盒，冻存所述免疫细胞。发明人惊奇的发现，采用该方法冻存免疫细胞，细胞有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
根据本发明的实施例，每106-109个免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。由此，能够有效实现免疫细胞的冻存，并且单位体积的冻存液保存的细胞量大，适宜大规模免疫细胞的冻存。根据本发明的具体示例，每107-108个免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。由此，细胞冻存效果好。
根据本发明的实施例，进一步包括：将含有所述免疫细胞的所述免疫细胞冻存液或者所述的试剂盒进行程序降温处理，所述程序降温处理的条件为：0-2分钟，所述免疫细胞的温度从4摄氏度下降到-1摄氏度；2-3分钟，所述免疫细胞的温度从-1摄氏度上升到0摄氏度；3-6分钟，所述免疫细胞的温度保持0摄氏度；6-11分钟，所述免疫细胞的温度从0摄氏度下降到-10摄氏度；11-16分钟，所述免疫细胞的温度保持-10摄氏度；16-50分钟，所述免疫细胞的温度从-10摄氏度下降到-45摄氏度；50-85分钟，所述免疫细胞的温度保持-45摄氏度；85-95分钟，所述免疫细胞的温度从-45摄氏度下降到-90摄氏度；95-100分钟，所述免疫细胞的温度保持-90摄氏度。由此，通过程序降温避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的有益之处在于：
本发明提出一种用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性的冻存液。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫细胞冻存液。根据本发明实施例，该细胞冻存液冻存的细胞种类不受特别的限制，只要冻存液能用于长期保存细胞即可。根据本发明的实施例，该冻存液包含2-10体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；20-88体积％的血浆；以及余量培养基。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于保存免疫细胞，并且冻存时间长(冻存时间可达几年甚至更长)，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，活性好，细胞回收率高，尤其适用于大规模免疫细胞的冷冻保存。
其中，需要说明的是，当所述DMSO、HSA和血浆的体积百分数之和小于1时，免疫细胞冻存液进一步包含剩余体积的培养基。例如，在免疫细胞冻存液中，当DMSO的浓度为10体积％、HSA的浓度为2％体积，血浆的浓度为88％体积时，该免疫细胞冻存液不包含培养基；当DMSO的浓度为5体积％、HSA的浓度为2％体积，血浆的浓度为88％体积时，该免疫细胞冻存液包含5％体积的培养基；当DMSO的浓度为10体积％、HSA的浓度为5％体积，血浆的浓度为40％体积时，该免疫细胞冻存液包含45％体积的培养基。
根据本发明的实施例，DMSO的浓度为10体积％。由此，对细胞冻存效果突出。
根据本发明的一些具体示例，HSA的浓度为5体积％。由此，冷冻复苏过程中渗透压调节效果好，从而能够有效保护细胞，提高细胞存活率，并且合理控制冻存液的成本。
根据本发明的实施例，血浆的浓度为40体积％。由此，对细胞的保护作用突出，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力。
根据本发明的实施例，所述血浆为自体血浆。
其中，需要说明的是，在本文中所使用的术语“自体血浆”是指与待冻存的免疫细胞具有同一来源的血浆。换言之，即该血浆与要利用冻存液冻存的免疫细胞取自同一个体。由此，对自体的免疫细胞排异作用小，有利于冻存细胞的保护。
根据本发明的实施例，培养基为1640培养基或Stemspan培养基。由此，细胞的冻存效果好。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于冻存免疫细胞的试剂盒，其包含前面所述的免疫细胞冻存液。发明人惊奇的发现，该试剂盒能够有效用于冻存免疫细胞，且细胞有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，活性好，细胞回收率高，尤其适用于大规模免疫细胞的冷冻保存。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种冻存免疫细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的免疫细胞冻存液或者试剂盒，冻存所述免疫细胞。发明人惊奇的发现，采用该方法冻存免疫细胞，细胞有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
根据本发明的实施例，每106-109个免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。由此，能够有效实现免疫细胞的冻存，并且冻存的细胞浓度高，适于大规模免疫细胞的冻存，冻存成本低，效果好。根据本发明的具体示例，每107-108个免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。由此，冻存的细胞浓度高，适于大规模免疫细胞的冻存，冻存成本低，并且细胞冻存效果好。
根据本发明的一些实施例，该方法进一步包括：将含有免疫细胞的免疫细胞冻存液或者试剂盒进行程序降温处理，该程序降温处理的条件为：0-2分钟，免疫细胞的温度从4摄氏度下降到-1摄氏度；2-3分钟，免疫细胞的温度从-1摄氏度上升到0摄氏度；3-6分钟，免疫细胞的温度保持0摄氏度；6-11分钟，免疫细胞的温度从0摄氏度下降到-10摄氏度；11-16分钟，免疫细胞的温度保持-10摄氏度；16-50分钟，免疫细胞的温度从-10摄氏度下降到-45摄氏度；50-85分钟，免疫细胞的温度保持-45摄氏度；85-95分钟，免疫细胞的温度从-45摄氏度下降到-90摄氏度；95-100分钟，免疫细胞的温度保持-90摄氏度。由此，通过程序降温避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。
根据本发明的实施例，免疫细胞冻存于液氮中。由此，有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。
根据本发明的一些具体示例，可以按照以下步骤冻存免疫细胞：将本发明的免疫细胞冻存液与待冻存的免疫细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，进行程序降温，-70℃过夜，次日转入液氮内保存。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
本实施例中，分别采用不含血浆的6种冻存液和含有血浆的6种冻存液，对体外诱导扩增的免疫细胞进行冻存，比较冻存效果，以便观察血浆对免疫细胞冻存保存的影响，以及降低DMSO浓度以减少细胞毒性的可能性。具体如下：
1、采用不含血浆的冻存液冻存免疫细胞
1.1、分离获得脐带血单个核细胞，将单个核细胞细胞接种到加有20ml培养基的培养瓶中，培养基配比为：18ml OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培养基+2ml自体血浆(Autologous plasma)+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2+终浓度0.01KE/ml沙培林(OK432)，37℃，5％CO2无菌培养，记为第0天。每日观察细胞，并进行适当传代扩增，培养基配比为培养基配比为：OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培养基+10％自体血浆(Autologous plasma)+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2，诱导扩增得到免疫细胞。
1.2、免疫细胞的冻存和复苏方法：
将上述体外诱导扩增第10天获得的免疫细胞分别采用含HSA的六种冻存液进行冻存，其中四种冻存液的成份如下：
冻存液1：5体积％DMSO+10体积％HSA；
冻存液2：5体积％DMSO+15体积％HSA；
冻存液3：10体积％DMSO+10％体积HSA；
冻存液4：10体积％DMSO+15体积％HSA，
冻存液5：0.2体积％的DMSO+15体积％的HSA，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为0.001g/ml；
冻存液6：0.4体积％的DMSO+10体积％的HSA，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为0.001g/ml；
其中，冻存液1-6中剩余体积的均为1640或Stemspan培养基。
按照以下步骤冻存免疫细胞：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃程序降温过夜，次日转入液氮内。其中，每107个免疫细胞采用1ml冻存液。
冷冻保存免疫细胞30d，然后进行复苏。
检测冻存前后细胞的存活率，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】×100％。复苏后细胞回收率的计算方法为：(复苏后活细胞数/冻存时活细胞数)×100％。
1.3、复苏免疫细胞检查结果：
结果表明，复苏后细胞存活率均低于冻存前。具体地，冻存液3和4保存的细胞存活率明显优于冻存液1和2，且冻存液3和4之间未见差别，表明10体积％的DMSO对免疫细胞具有较好的保护作用，且不同浓度的HSA对于免疫细胞的保护作用无显著差别；冻存液3和4的细胞回收率也优于冻存液1和2。冻存液5和6的细胞回收率也优于冻存液1和2，尤其是冻存液5，细胞回收率高达99.6％。
各组冻存液的细胞回收率为：
冻存液1：63.1％；
冻存液2：62.8％；
冻存液3：76.9％；
冻存液4：76.3％，
冻存液5：99.6％；
冻存液6：78.2％；
2、采用含血浆的冻存液冻存免疫细胞
2.1、分离获得脐带血单个核细胞，将单个核细胞细胞接种到加有20ml培养基的培养瓶中，培养基配比为：18ml OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培养基+2ml自体血浆(Autologous plasma)+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2+终浓度0.01KE/ml沙培林(OK432)，37℃，5％CO2无菌培养，记为第0天。每日观察细胞，并进行适当传代扩增，培养基配比为培养基配比为：OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培养基+10％自体血浆(Autologous plasma)+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2，诱导扩增得到免疫细胞。
2.2、免疫细胞的冻存和复苏方法：
分别采用含血浆的六种冷冻保存液，将上述体外诱导扩增10天获得的免疫细胞进行冷冻保存，其中含血浆的六种冻存液的成份如下：
冻存液9：5体积％DMSO+40体积％血浆；
冻存液10：10体积％DMSO+40体积％血浆；
冻存液11：5体积％DMSO+5体积％HSA+40体积％血浆；
冻存液12：10体积％DMSO+5体积％HSA+40体积％血浆，
冻存液13：0.2体积％的DMSO+15体积％的HSA+40体积％血浆，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为0.001g/ml；
冻存液14：0.4体积％的DMSO+10体积％的HSA+40体积％血浆，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为0.001g/ml；
其中，在冻存液9-14中，血浆为自体血浆，剩余体积的均为1640或Stemspan培养基。
其中，按照以下步骤冻存免疫细胞：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃程序降温过夜，次日转入液氮内。其中，每107个免疫细胞采用1ml冻存液。
冷冻保存免疫细胞30d，然后进行复苏。
检测冻存前后细胞的存活率、细胞活性、细胞表面标志表达情况，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】×100％。复苏后细胞回收率的计算方法为：(复苏后活细胞数/冻存时活细胞数)×100％。利用流式细胞仪检测免疫细胞细胞表面标志CD3-CD56+和CD3+CD4+的表达情况。
2.3、复苏免疫细胞检查结果：
结果表明，六种保存液保存的免疫细胞存活率和细胞表面标志表达情况与冻存前相比无显著差别，细胞回收率高于“步骤1”中不含血浆的冻存液。并且，冷冻保存液5和6，9和10冻存的细胞复苏后均具有一定的增殖能力，13和14冻存液冻存的细胞具有旺盛的繁殖能力。由此，表明血浆以及白酒草皂苷R对细胞有很好的保护作用。
各组冻存液的细胞回收率为：
冻存液7：69.1％；
冻存液8：71.8％；
冻存液9：82.6％；
冻存液10：83.9％，
冻存液11：99.8％；
冻存液12：92.3％；
综上，发明人采用DMSO、HAS、白酒草皂苷R和血浆不同浓度配比，保存脐血单个核细胞诱导的免疫细胞，观察冻存液效果，结果表明，10体积％DMSO具有较好的细胞保护作用；而不同浓度的HSA对免疫细胞的保护作用无显著差别。而采用本发明实施例的自体血浆与HSA和DMSO联用或者进一步联用白酒草皂苷R的冻存液保存体外诱导的免疫细胞，复苏后细胞回收率高，细胞活性好，具有一定的增殖能力，而其余各组冷冻液保存的细胞回收率偏低。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。