一种丛枝菌根真菌的扩繁方法与流程

本发明涉及菌根真菌扩繁
技术领域：
，尤其涉及一种丛枝菌根真菌的扩繁方法。
背景技术：
：丛枝菌根真菌是一种广泛分布的土壤微生物，丛枝菌根真菌能够改善宿主根系营养吸收情况而增强作物综合抗性。目前对于真菌的扩繁方法很多，对于丛枝菌根真菌多采用普通土壤或细沙栽培三叶草等植物，利用根系与菌根真菌的共生来培养扩繁，具体培养方法有以下几类：1、沙土盆栽培养法：大多数常规培养均是采用沙土盆钵培养，即将丛枝菌根真菌的孢子接种于活动三叶草等植物生长的盆钵基质中，最终获得丛枝菌根真菌的混合菌剂，该方法的主要优点是操作简便、简单可靠，是丛枝菌根真菌的主要扩繁方法，但由于沙土营养条件差，透气不保水，因而影响了菌剂的扩繁，导致培养周期长、繁殖体产量少。2、玻璃珠分室培养法：玻璃珠分室培养法是利用不同孔径的尼龙网将有机玻璃盒隔成5室或3室，将孢子和种子置于植物生长室内，植物根系可以透过筛网到达菌根室，只有菌丝可以穿过孔径更小的尼龙网到达真菌室，植物室填充的介质是土壤，菌根室填充的是河沙，真菌室填充的是直径1-3mm的玻璃珠。该方法的优点是能培养基质与丛枝菌根真菌分开，获得纯净的丛枝菌根真菌菌体，但是其技术难度较大，仅供科学研究和小规模接种剂的生产使用，无法大规模培养生产。3、静止营养液培养法：利用白三叶草在灭菌的营养液中培养，将三叶草种子和丛枝菌根真菌孢子与沙基质混合放在有筛网的穴盘中，穴盘放在营养液中进行培养，菌丝体和根系穿过网筛在营养液中生长，获得的菌根和营养液都可以做为接种菌剂，但这种方法需要特殊的装置，成本较高，也无法在实际生产中大规模应用。4、雾化培养法利用气雾培养箱将预接种丛枝菌根真菌的宿主植物架在空中，然后对其根系采用喷雾即每隔数秒向宿主植物根系喷射超声雾化的营养液，满足根系对水分和营养的需求，可在无土条件下大量生产含有丛枝菌根真菌的须根，本方法的优点是菌剂纯度高，质量轻，但是由于雾化成本高，且雾化培养系统对营养液要的参数较多，尤其是对磷和pH的控制要求高，因此技术难度大也影响了技术应用。虽然丛枝菌根真菌作为生物肥料具有很好的功效，但目前仍缺少一种适用于规模产业化生产的丛枝菌根真菌的扩繁方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种丛枝菌根真菌的扩繁方法。本发明提供的丛枝菌根真菌的扩繁方法操作简便、成本低、扩繁效率高，能够实现菌剂的大规模生产和应用。本发明提供了一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，包括以下步骤：1)将丛枝菌根真菌接种于基质进行培养，所述基质包括沸石、浮石、蛭石和泥炭；2)在所述步骤1)的基质中先后播种玉米、万寿菊和三叶草；所述每种植物的播种密度独立地为(8～12)个/m2；3)以玉米的播种时间为基准，植物生长4～6个月后，将地下部分的菌根进行干燥、粉碎，与培养该丛枝菌根真菌的基质混合。优选的是，所述沸石、浮石、蛭石和泥炭的体积比为(10～15)：(2～4)：(2～4)：1。优选的是，所述沸石、浮石、蛭石和泥炭的体积比为12:3:3:1。优选的是，所述基质的粒径小于2.5mm。优选的是，所述丛枝菌根真菌的接种量为基质质量的5～10％。优选的是，所述步骤1)中的培养在通风条件中进行。优选的是，所述丛枝菌根真菌包括Glomusintraradices或Glomusmosseae。优选的是，所述接种前对基质进行灭菌。优选的是，所述步骤3)植株生长的过程中，施加水和肥料，所述肥料包括N、K和Mg元素。本发明提供了丛枝菌根真菌的扩繁方法。通过各培养条件的设置，本发明提供的丛枝菌根真菌的扩繁方法操作简便、成本低、菌根侵染率高，真菌产量高，扩繁效率高，能够实现菌剂的大规模生产和应用。试验结果表明，本申请菌根侵染率高达99％。附图说明图1为本发明实施例3提供的外源多胺对AMF及宿主植株根系活力的影响结果图；图2为本发明实施例3提供的外源多胺对AMF根系侵染率的影响结果图。具体实施方式本发明提供了一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，包括以下步骤：1)将丛枝菌根真菌接种于基质进行培养，所述基质包括沸石、浮石、蛭石和泥炭；2)在所述步骤1)的基质中先后播种玉米、万寿菊和三叶草；所述每种植物的播种密度独立地为(8～12)个/m2；3)以玉米的播种时间为基准，植物生长4～6个月后，将地下部分的菌根进行干燥、粉碎，与培养该丛枝菌根真菌的基质混合。本发明将丛枝菌根真菌接种于基质进行培养，所述基质包括沸石、浮石、蛭石和泥炭。在本发明中，所述丛枝菌根真菌的接种量为基质质量的5～10％，更优选为8％。在本发明中，所述丛枝菌根真菌包括Glomusintraradices或Glomusmosseae。本发明对所述丛枝菌根真菌的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的Glomusintraradices和Glomusmosseae的市售产品即可。在本发明中，所述沸石、浮石、蛭石和泥炭的体积比优选为(10～15)：(2～4)：(2～4)：1，更优选为12:3:3:1。在本发明中，所述基质的粒径小于2.5mm。在本发明中，所述接种前优选对基质进行灭菌。本发明对所述基质的灭菌方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的基质灭菌方法即可，如高温热水灭菌，将基质与高温热水混合，具体地，所述高温热水的温度为90～100℃，更优选为95℃，待基质升温至55～60℃，进行保温2～4h，更优选为3h；所述消毒过程每平方米栽培面积的基质使用热水120～160升。在本发明中，所述步骤1)中的培养在通风条件中进行。所述通风条件优选采用通风装置实现，所述通风装置优选为外壁有孔的栽培用槽或盆，本发明对所述槽或盆的规格没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的规格即可，如选择高为80cm，直径为50cm的有孔栽培盆。本发明对丛枝菌根真菌接种到基质中进行培养的条件没有特殊的限定。采用常规栽培玉米、万寿菊和三叶草的大棚或温室栽培环境即可，栽培时间优选为春季或秋冬季。接种菌剂后进行植物播种，本发明在所述步骤1)的基质中先后播种玉米、万寿菊和三叶草。本发明优选待前一种植物出苗后播种下一种植物，具体地，首先播种玉米，待玉米出苗后，播种万寿菊，待万寿菊出苗后，播种三叶草。在本发明中，所述植物的播种密度为(8～12)个/m2。在本发明中，所述播种的密度优选为10个/m2。所述播种后优选覆盖透明地膜，所述透明地膜的作用为保温保湿。在本发明中，植株生长4～6个月后，将地下部分的菌根进行干燥、粉碎，再与培养该丛枝菌根真菌的基质混合。在本发明中，所述步骤3)植株生长的过程中，施加肥料，所述肥料包括N、K和Mg元素。本发明优选向根区施加多胺类生物活性物质，以提高根系活力和AMF的根系侵染力，在本发明中，所述多胺类生物活性物质优选为亚精胺；施加亚精胺的量优选为0.25mg/m3。所述多胺类生物活性物质优选在出苗后一周施加。本发明在植物生长过程中，施加水或营养液。在本发明中，所述培养过程中，每周进行浇水或施肥。本发明对所述施肥和浇水的操作条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的施肥施水方法即可。如前三个月优选每周进行施肥和施水分别1～2次，施加的肥料优选为半磷的Hoagland营养液；前三个月每个月施加一次外源0.25mg/m3的亚精胺灌根；第四个月以后不再施肥，每周进行施水，减少施水量。下面结合具体实施例对本发明提供的一种丛枝菌根真菌的扩繁方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1将粒径小于2.5mm的沸石、浮石、蛭石和泥炭按体积比为12:3:3:1进行混合，混合后经高温热水(100℃)消毒，60℃保温3h；在地面铺上洁净的薄膜并搭建防虫网，在地面上放置高80cm直径50cm的有孔盆，然后将灭菌基质置于盆中。在所述基质中接种Glomusintraradices并混匀，接种量为基质质量的5％；在早春季节，将基质浇透水，在接种后的基质中先后播种玉米、万寿菊和三叶草；所述播种的密度为12个/m3；在盆上方盖一层白色薄膜，待出苗后揭去薄膜。1周后除去弱株，在槽中留10个植株，然后向根区外源0.25mg/m3的亚精胺。扩繁5个月后，除掉地上部分植株，将植株根系拔出植物置于菌土表面晾晒后打碎与菌土混合；取一部分根系进行根系侵染率检测；取部分菌土进行孢子含量的检测，待孢子含量达80个/克就可以做菌剂使用了。所述扩繁过程中施肥施水情况如下：第一个月：1周：基质浇透水栽植玉米、三叶草、万寿菊；2周：施肥，所述肥料为半磷的Hoagland营养液，用量为，下述施肥同上、施用外源0.25mg/m3的亚精胺灌根；3周：施肥；4周：施肥；第二个月：5周：施肥；6周：施肥、施用外源0.25mg/m3的亚精胺灌根；7周：施肥；8周：施肥、查看侵染率；第三个月：9周：施肥，用量减半；10周：施肥，用量减半、减少浇水使植物遭受干旱胁迫，植物轻微萎焉再浇水；11周：施肥，四分之一用量，减少浇水使植物遭受干旱胁迫，植物轻微萎焉再浇水；12周：施肥，四分之一用量、施用外源0.25mg/m3的亚精胺灌根、查看侵染率。减少浇水使植物遭受干旱胁迫，植物轻微萎焉再浇水、湿筛送样检测孢子形成情况。第四个月：13周：不施肥、减少浇水，当植物中度萎焉时再浇水；14周：施肥，四分之一用量、让植物慢慢干燥、减少浇水到最低限度、检测菌根侵染情况；15周：不再施肥、减少浇水，植物轻微萎焉再浇水、检测孢子形成情况；16周：不再施肥、减少浇水，中度萎焉再浇水。第五个月：17周：不再施肥、减少浇水，中度萎焉再浇水；18周：减少浇水，中度萎焉再浇水、检测孢子形成情况；19周：让植物和基质干燥(植物的根能够拔出(芽、下胚轴))，并把根放在基质表面；20周：收获接种物，根切碎搀回栽培基质，在透气的塑料袋中低温储存。实施例2将G.i菌根菌剂接种于不同基质的扩繁效果比较，结果如表1所示。试验采用的是两种栽培基质：基质1为沸石，浮石，蛭石和泥炭(粒径小于2.5)按体积比12:3:3:1混合，基质2为沸石，蛭石和泥炭(粒径小于2.5)按体积比12:3:1混合为利用扩繁利用不同栽培基质中接种丛枝菌根真菌，比较其侵染率，获得了具有良好侵染率的丛枝菌根真菌接种菌剂。表1丛枝菌根真菌扩繁的根系侵染率由表1可以看出，采用基质1扩繁的菌剂其菌根率明显高于基质2，因此沸石，浮石，蛭石和泥炭(粒径小于2.5)按体积比(12:3:3:1)混合菌剂可以直接用于生产试验。实验例3多胺对菌根侵染率和根系活力的提高作用图1为外源多胺对AMF及宿主植株根系活力的影响结果图，图2为外源多胺对AMF根系侵染率的影响结果图。如图所示，混配基质中添加AMF和Spd，宿主植株的根系活力均显著提高；在混配基质中同时添加Spd和AMF，与Gv相比较，宿主植株的根系活力和侵染率显著提高。上述结果表明，Spd和AMF可提高宿主植株的根系活力，并且Spd可显著提高AMF的菌根侵染率，从而促进了菌种的扩繁。实验例4不同丛枝菌根真菌菌种对宿主植物的菌根依赖性比较比较结果如表2所示。不同AMF对宿主植物根系的菌根侵染率及菌根依赖性亦有显著差异，G.m，G.v处理的地上部与根的干重虽然相差不大，但与其他处理差异极显著，表明其促进宿主植物生长的作用最强。可见不同菌种的作用不同，以本发明所用的Glomusmossea-2(G.m)和Glomusversiforme(G.v)处理可对宿主植物的生长促进作用效果最好。表2不同丛枝菌根真菌菌种对宿主植物幼苗干物重和菌根侵染率、菌根依赖性的影响处理菌根侵染率(％)地上干物重(g)根干重(g)总干重(g)菌根依赖性AMF(％)CK0g2e0.24d2.24fG.m48b3.2a0.51a3.71b65.6bG.d37d2.7bc0.4bc3.1c38.4dB16715.6f2.3d0.27d2.57e14.7fB14145.2c2.8b0.45b3.25c45.1cG.v52.7a3.4a0.52a3.92a75aB16823.3e2.5cd0.35c2.85d27.2e供试菌种分别为Glomusdiuphauam(G.d),Glomusmossea(BEG167),Glomusintraradices(BEG141)，Glomusetuni-catum1(BEG168),Glomusversiforme(G.v)和Glomusmosseae-2(G.m)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3