一种密旋链霉菌在防除寄生性杂草中的应用的制作方法

本发明涉及寄生性杂草防治技术领域，具体涉及一种密旋链霉菌在防除寄生性杂草中的应用。

背景技术：

列当属(orobanchespp.)植物包括200多个种，而其中的许多种为蔬菜和作物的根寄生杂草。由于缺少叶片和叶绿体，列当完全靠从寄主吸取水分和营养物质生存，因此对寄主植物造成严重危害。瓜列当(phelipancheaegyptiacapers.)属于列当属植物，广泛分布于欧洲南部、地中海地区、非洲北部、亚洲南部和中国等地区，可寄生于茄科、豆科、伞形科和菊科等作物上。

由于列当对农业生产造成的危害日益严重，且列当不断蔓延侵染新的地区，因此亟待寻找能够有效防除列当的措施。目前常用的防除措施包括农艺措施(如间作和轮作)、化学防除及培育抗性品种。然而，由于列当大部分生长阶段发生在地下，在其出土前对寄主的危害已经产生，因此上述措施均不能有效地防除列当。此外，1株列当通常可产生数万粒种子，土壤中的种子量极大，防除十分困难。因此，需要寻找新的有效防除列当的措施，而生物防治是一条有希望的途径。

微生物应用于植物病害防治研究很早，能产生抗菌活性物质的拮抗微生物应用于防治植物土传病害已有报道。由于植物土传病害和列当均首先通过侵染植物的根系进而在地下对植物造成危害，因此具有防除植物土传病害的微生物也可能具有防除列当的潜能。前期试验结果表明，密旋链霉菌具有防病促生多种功能，对土传根系病害病原菌有显著的抑制作用，但目前尚无密旋链霉菌具有防除瓜列当能力的报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种密旋链霉菌在防除寄生性杂草中的应用，为列当的防除提供新的有效途径。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

一种密旋链霉菌在防除寄生性杂草中的应用，所述密旋链霉菌为密旋链霉菌(streptomycespactum)sg712100，该菌于2009年4月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:m209066。

优选地，所述寄生性杂草为列当属杂草。

优选地，所述寄生性杂草为瓜列当。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的密旋链霉菌可显著抑制瓜列当种子萌发，同时改良了土壤中微生物区系，增加了土壤中细菌的总数以及细菌数量与真菌数量的比值，降低了土壤中真菌的总数，由此抑制了寄生性杂草瓜列当的萌发和生长，同时促进了农作物的生长，提高了农作物的产量。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为密旋链霉菌对瓜列当寄生的影响结果图；图中数据为3次重复值的平均值±sd。图中不同小写字母表示表示处理与对照之间数值经lsd检验并经bonferroni校正差异显著(p<0.05)；

图2为密旋链霉菌对列当总干重和单株列当干重的影响结果图；图中数据为3次重复值的平均值±sd。图中不同小写字母表示表示处理与对照之间数值经lsd检验并经bonferroni校正差异显著(p<0.05)；

图3为密旋链霉菌剂在大田试验中对瓜列当出土数量的影响结果图；图中，a为仅在育苗期施加密旋链霉菌剂，b为在育苗期和移栽时均施加密旋链霉菌剂；图中数据为3次重复值的平均值±sd。相同采样时期中不同小写字母表示表示处理间数值经lsd检验并经bonferroni校正差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

本发明提供一种密旋链霉菌在防除寄生性杂草中的应用，所述密旋链霉菌为密旋链霉菌(streptomycespactum)代号为sg712100，具有防病促生多种功能，于2009年4月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:m209066，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；其16srdna序列如下：

本实施例所用的试验材料及其对试验材料的处理如下：

(1)密旋链霉菌

本实施例所用密旋链霉菌(streptomycespactum)sg712100分离自中国西北特殊生境土壤中，由西北农林科技大学提供。

(2)瓜列当

瓜类当种子于2011年采集于中国新疆维吾尔自治区库尔勒市巴音郭楞蒙古自治州焉耆县受瓜列当侵染的西红柿田中。

(3)gr24，一种人工合成的寄生植物种子萌发刺激物，由澳大利亚悉尼大学提供。

(4)西红柿种子

盆栽试验中所用西红柿品种为“白果强丰”(产自天津蓟县蓟农种子站)。大田试验中所用西红柿品种为屯河737(由中粮屯河种业有限公司提供)。上述两个西红柿品种均为瓜列当的易感品种。

(5)瓜列当种子的表面消毒

瓜列当钟子先后浸没于1.0％(w/v)的次氯酸钠溶液和75％的乙醇中分别超声处理3min，之后用无菌水冲洗干净后自然晾干。首先将直径为8mm的玻璃纤维滤纸摆放于事先放有2层湿润滤纸的直径为9cm的培养皿中，随后将已经风干的列当种子均匀撒于玻璃纤维滤纸片上，每个滤纸片上30-60粒种子。将上述培养皿封口后置于25℃的黑暗环境下培养4天待用。

实施例1

密旋链霉菌发酵液对瓜列当种子萌发的抑制

1、试验方法：

(1)密旋链霉菌发酵液的制备

密旋链霉菌的发酵液采用公知的液态摇床培养的方式进行，原液(每毫升发酵液3.5mg干菌丝)分别稀释10、10²、10³、10⁴倍后备用。以不接种密旋链霉菌的高氏1号液态培养基和pda液态培养基分别作为对照，重复3次。

(2)种子萌发试验

首先将直径为8mm的玻璃纤维滤纸片摆放于新的培养皿中，之后将20μl发酵液，一片已经预培养好的瓜列当种子片和20μlgr24(0.1mgl^-1)依次加于玻璃纤维滤纸片上。添加无菌水和gr24(0.1mgl^-1)代替发酵液的处理用于检测瓜列当种子仅在萌发刺激物的诱导下才能够萌发。随后将培养皿置于25℃黑暗环境下培养10天后，用解剖显微镜统计每片玻璃纤维滤纸上萌发的列当种子数和总的列当种子数目。列当种子的发芽管伸出种皮即视为萌发。瓜列当种子萌发率(gr)按照公式(1)计算，瓜列当种子萌发率较对照降低的百分率(pr)按照公式(2)计算：

gr＝gn/tn×100％(1)

gr：萌发率；gn：萌发瓜列当种子数；tn：瓜列当种子总数

pr＝(gf–gc)/gc×100％(2)

pr：瓜列当种子萌发率较对照的降低率；gf：发酵液处理的瓜列当种子萌发率；gc：对照中瓜列当种子萌发率。

2、试验结果：

密旋链霉菌发酵液抑制瓜列当种子萌发的试验结果见表1。无菌水和gr24分别可以诱导0.0％和86.6％的瓜列当种子萌发。密旋链霉菌发酵液原液对瓜列当萌发的抑制率为91.7％，与对照相比，密旋链霉菌发酵液原液对瓜列当种子的萌发率有明显的抑制作用，而稀释10倍后，效果降低，随着稀释倍数的增大，密旋链霉菌对瓜列当种子的萌发率的抑制作用逐渐减小，直至稀释至10⁴倍，其对瓜列当种子的萌发已没有抑制作用。

表1密旋链霉菌发酵液对瓜列当种子萌发的抑制结果

注：gl^a,不加琼脂的高氏1号培养基。表中数据为3次重复值的平均值±sd。同行数据后不同小写字母表示处理与对照间数值经lsd检验并经bonferroni校正差异显著(p<0.05)。

实施例2

密旋链霉菌体甲醇浸提液对瓜列当种子萌发的抑制

1、试验方法

(1)密旋链霉菌体甲醇浸提液的制备

称取0.050g密旋链霉菌体置于1.5ml离心管中，随后加入1ml甲醇，超声处理30min后6000rmin^-1离心2min。上清液视为原液，稀释10和100倍后备用，3次重复。

(2)种子萌发试验

按照上述发酵液抑制瓜列当种子萌发的试验方法进行，将发酵液替换为菌体甲醇浸提液即可，试验重复3次。

2、试验结果

密旋链霉菌体甲醇浸提液抑制瓜列当种子萌发试验结果见表2。密旋链霉菌的50.0mg/ml的菌体甲醇浸提液能够完全抑制瓜列当的萌发，稀释至5.0mg/ml后，抑制率降至21.1％，但仍具有抑制效果。

表2密旋链霉菌体甲醇浸提液对瓜列当种子萌发的抑制结果

注：表中数据为3次重复值的平均值±sd。同行数据后不同小写字母表示处理与对照间数值经lsd检验并经bonferroni校正差异显著(p<0.05)。

实施例3

盆栽试验

1、试验方法：

盆栽试验于2014年5月至9月在中国宁夏回族自治区西北农林科技大学水土保持研究所固原生态试验站进行。

根据室内试验结果，密旋链霉菌被用于盆栽试验，以菌剂的形式接种于土壤中。密旋链霉菌的菌剂按照xue等的2013年外文文献《isolationandevaluationofrhizosphereactinomyceteswithpotentialapplicationforbiocontrolofverticilliumwiltofcotton》的方法制备，菌剂中活孢子数目为10¹¹g^-1。盆栽所用土壤为黑垆土，首先将土壤与细沙按体积比1:1混匀，之后加入尿素(20mgkg^-1)、过磷酸钙(50mgkg^-1)、瓜列当种子(3.4mgkg^-1)和密旋链霉菌菌剂(1gkg^-1)后充分混匀。分别称取8kg上述混合物加入高25cm、直径为20cm的塑料盆中。不加密旋链霉菌菌剂的处理视为对照，每个处理6盆重复。

将西红柿种子播种于装有蛭石的穴盘后于25℃培养间内培养(光照：黑暗为12h:12h)并按需浇水。待西红柿出苗后，拔掉多余幼苗，使每个穴盘孔内保留一株西红柿幼苗。至10cm高时，将西红柿幼苗拔出移栽到装有上述混合物的塑料盆中(每盆1株)并按需浇水和除草。

在快速生长期(移苗后70天)将各处理中的3盆打开采样，其余3盆于收获期打开(移苗后130天)。在两次采样时分别统计列当的出土数、总数，称量寄生列当的干重；测量西红柿的株高，称量西红柿地上部干重及产量。此外，根据公式(3)和(4)分别计算列当出土率(er)及单株列当干重。

ea＝en/an×100％(3)

ea：列当出土率；en：出土列当数；an：寄生列当总数

dws＝dwa/an(4)

dws：单株列当干重；dwa列当总重；an：寄生列当总数

两次采样时，采用梯度稀释培养法分离计数西红柿根系土壤中的细菌、真菌及放线菌，统计密旋链霉菌的总数，并计算放线菌与真菌(a/f)、细菌与真菌(b/f)之间总数之比以及密旋链霉菌在根区土壤中的定殖率。此外，还对各采样时期瓜列当各指标与西红柿根区土壤中微生物各指标之间的相关性进行计算。各指标与对照相比的增加率按照公式(5)计算：

ir＝(t-c)/c×100％(5)

ir：处理数值与对照相比的增率；t：处理中的数值；c：对照中的数值。

2、试验结果

密旋链霉菌对瓜列当寄生的影响结果如图1所示。由图可知，施加密旋链霉菌菌剂在收获期显著降低了瓜列当的出土数量，较对照组减少了85.7％；然而，密旋链霉菌菌剂在两次采样时期均未显著降低瓜列当的寄生总数；此外，密旋链霉菌还使瓜列当的出土率较对照组降低了75.7％。

密旋链霉菌对列当总干重和单株列当干重的影响结果如图2所示，由图可知，施加密旋链霉菌菌剂在收获期使瓜列当的总干重较对照组降低了55.4％，使单株瓜列当的干重较对照组降低了44.9％。

密旋链霉菌对西红柿在收获期的生长及产量的影响见表3，由表3可知，施加密旋链霉菌后，西红柿的株高较对照组增加了27.1％，且显著增加了西红柿地上部干重，较对照组增加了25.8％。另外，施加密旋链霉菌后，西红柿在收获期的产量为每盆423.1g，较对照组提高了84.9％。

表3密旋链霉菌对西红柿在收获期的生长及产量的影响

注：表中数据为3次重复值的平均值±sd。同行数据后不同小写字母表示处理与对照间数值经lsd检验并经bonferroni校正差异显著(p<0.05)。

根区指作物根系密集分布区。根区是植物和微生物相互作用十分强烈的区域。根区土壤中微生物的数量和种类能够反映植物的健康状态。密旋链霉菌对西红柿根区土壤中微生物区系的影响见表4。

由表4可知，在西红柿快速生长期，密旋链霉菌使土壤中放线菌和细菌的数量较对照组分别增加了172.0％和295.0％，同时，密旋链霉菌还显著增加了放线菌与真菌数量的比例(a/f)及细菌与真菌的比例(b/f)，增率分别为206.3％和348.7％；在收获期，密旋链霉菌显著增加了细菌的数量及b/f，与对照组相比，增率分别为84.9％和123.6％，此外，密旋链霉菌在快速生长期和收获期在西红柿根区土壤中的定殖率分别为28.4％和25.2％。

表4密旋链霉菌对西红柿根区土壤中微生物区系的影响

注：a/f^a，放线菌数量与真菌数量的比值；b/f^b，细菌与真菌数量的比值。表中数据为3次重复值的平均值±sd。同一时期同行数据后不同小写字母表示处理与对照间数值经lsd检验并经bonferroni校正差异显著(p<0.05)。

表5瓜列当各指标与土壤中微生物各指标之间相关系数r值分布表

注：a/f^a，放线菌数量与真菌数量的比值；b/f^b，细菌数量与真菌数量的比值。*、**和***分别表示p<0.05,p<0.01和p<0.001。

瓜列当各指标与土壤中微生物各指标之间的相关系数r值分布见表5。由表5可知，在收获期，瓜列当出土数和出土率与西红柿根区土壤中真菌总数呈显著正相关关系，r值分别为0.75(p<0.01)和0.59(p<0.05)；而与a/f(p<0.05)和b/f(p<0.001)呈显著负相关关系。瓜列当的总干重和单株干重与西红柿根系土壤中细菌的数量呈显著负相关关系，r值分别为-0.70(p<0.01)和-0.67(p<0.05)。此外，单株瓜列当干重还与西红柿根区土壤中b/f呈负相关关系(r＝-0.77,p<0.01)。然而，瓜列当各指标与西红柿根区土壤中微生物指标在快速生长期均无显著相关关系。

实施例4

大田试验

1、试验方法：

大田试验于2016年在中国新疆维吾尔自治区库尔勒市巴音郭楞蒙古自治州博湖县进行。本试验中所用密旋链霉菌剂由陕西博秦生物工程有限公司生产。菌剂中的有效成分为密旋链霉菌(streptomycespactum)活菌，其中活孢子数为2×10⁹g^-1。

西红柿于温室育苗后移栽于田间。大田试验共三个处理：对照ck，不施加密旋链霉菌剂；a，仅在育苗期施加密旋链霉菌剂；b，在育苗期和移栽时均施加密旋链霉菌剂。各处理田间处理3次，9小区(14m×10m)随机排列。

首先，将密旋链霉菌剂与草炭基质按质量比1:1混匀后分别称取0.7kg放入穴盘中。之后，于2016年3月3日播种西红柿种子后将穴盘置于温室(25±5℃，自然光)中培养并按需浇水。待幼苗出土后，将多余幼苗拔除，穴盘中每个小孔穴内保留1株西红柿。于2016年4月17日将穴盘中的西红柿幼苗移栽到田间土壤(盐碱土)中。田间土壤中事先铺有宽度为0.7m的塑料地膜。两地膜间距离为0.7m。西红柿幼苗移栽到地膜上，每块地膜种植两行，行距为0.6m，株距为0.3m。移栽前先将50g稀释后的密旋链霉菌剂(事先将密旋链霉菌剂与草炭按质量比1:100混匀)加入到每个穴孔中，再放入西红柿幼苗。移栽后，各小区按需浇水、除草和管理。每个小区选择3个含有25株西红柿的采样区域并标记。于西红柿的快速生长期(移栽后60天)和收获期(移栽后110天)分别统计各采样区内出土瓜列当株数，并于收获期收获各小区内西红柿，称量鲜重。各指标较对照间的增率按公式(5)计算。

上述试验结果的数据采用dpsv9.50软件进行。采用单因素方差分析方法对各处理的相应变量进行分析，采用最小显著差数法(lsd)进行多重比较并进行bonferroni校正(p<0.05)。

2、试验结果

密旋链霉菌在大田试验中对瓜列当出土数量的影响见图3。由图可知，在快速生长期及收获期，b处理中瓜列当出土当数分别为每株西红柿0.2株和1.7株，较对照分别降低了68.7％和32.3％。然而，在a处理中，瓜列当出土数在快速生长期较对照反而增加了67.2％，但在收获期无增加作用。此外，b处理中西红柿的产量为每小区971.6kg，较对照增加57.1％，而a处理对西红柿产量无显著影响。

上述实施例的试验结果表明，密旋链霉菌在实验室条件下可显著抑制瓜列当的萌发；在盆栽试验中，可显著降低瓜列当的出土数同时促进西红柿的生长；在大田试验中，可显著降低瓜列当的出土数并增加西红柿的产量。

盆栽试验结果表明，收获期西红柿根区土壤中细菌的总数及b/f的比值与瓜列当出土数量、出土率及生物量均成负相关关系；相反，收获期真菌的总数与瓜列当的出土数及出土率呈正相关关系。上述结果表明，增加土壤中细菌的总数及b/f的比例，降低土壤中真菌的总数有助于防除瓜列当，这就表明改良土壤中微生物区系是密旋链霉菌防除瓜列当的机制之一。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。