本发明属于菊花生殖生物学及杂交育种研究领域，涉及一种高效选育无花粉污染菊花的方法及应用，具体地说涉及花粉量具有差异的父母本杂交后选育得到无花粉污染菊花的方法及应用。该方法通过以无花粉污染(花药不含花粉或花药壁不开裂)菊花品种‘kingfisher’、‘南农玉笏’、‘q1-62’、‘qx-107’、‘南农冰激凌’和‘qx-008’为母本，‘南农菲紫’、‘南农红橙’、‘南农银山’、‘南农红焰’和‘诺亚’为父本开展20组人工杂交实验；统计与分析授粉后24h花粉在柱头上的萌发数量、授粉后8、12和18天子房饱满率和结实率，综合评价各父母本的杂交育性；通过测定和分析杂交f1代散粉特性，包括单个花序管状花数、单花花药数、花药含粉量、花序含粉量和表观花粉量5个性状，确定每个组合得到无花粉污染菊花f1代株系的比例。
技术背景
菊花(chrysanthemummorifolium)为多年生宿根草本植物，我国十大传统名花和花中四君子之一，拥有悠久的文化历史和丰厚的文化底蕴，同时，因其观赏价值和经济价值非常高，在国内外的切花市场中需求量极大，是世界四大鲜切花之一。但菊花在开花过程中，花序中间的两性管状花由外轮向内轮发育，散粉量逐渐增加，大量的花粉团掉落在舌状花上，导致观赏价值降低，并且过多的花粉飘散到空气中，对人体的呼吸道尤其对花粉过敏患者会产生花粉症症状，危害人类身心健康。因此，培育无花粉污染的菊花新品种具有十分重要的市场应用前景，
对于菊花新品种的选育，目前应用最多最有效的育种方法是有性杂交。作为种子植物，在杂交过程中花粉与柱头的亲和性、胚胎发育以及最终结实率与杂交的有效性直接相关，在开展大量杂交育种实验时，应该对所选亲本的生殖生物学特性进行分析。另外，在杂交育种过程中利用无花粉污染菊花为母本可以不用进行人工去雄，大大简化了杂交育种程序，也避免了人工去雄对花序造成的伤害，有利于显著提高育种效率。因此，有必要对杂交的父母本育性以及f1代散粉特性进行研究，发明一种高效选育无花粉污染菊花的方法，为鲜切花市场提供优良的新品种，减轻花粉污染危害，同时也为家居装饰以及其他各种场合中鲜切花的合理配置和城镇化建设中绿化植物的配置提供更多选择。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高效选育无花粉污染菊花的方法及其应用，以期得到更多的无花粉污染菊花新品种应用于切花市场和园林绿化中，减轻花粉污染的危害。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种高效选育无花粉污染菊花的方法，包括以下步骤：
(1)以无花粉污染菊花品种为母本，以花粉量少、中、多的菊花品种为父本进行人工杂交；
(2)人工授粉后统计各杂交组合中花粉在柱头上的萌发数量；
(3)统计子房饱满率和结实率；
(4)测定杂交f1代散粉特性，包括单个花序管状花数、单花花药数、花药含粉量、花序含粉量和表观花粉量5个性状，分析花粉污染程度，获得无花粉污染菊花杂交后代。
步骤(1)中所述无花粉污染菊花品种为花药不含花粉或花药壁不开裂的菊花品种；优选为花药不含花粉的菊花品种；进一步优选的，所述花药不含花粉的菊花品种为‘kingfisher’、‘南农玉笏’、‘q1-62’；所述花药壁不开裂的菊花品种为‘qx-107’、‘南农冰激凌’、‘qx-008’。
步骤(1)中所述的父本优选为花粉量少的菊花品种。上述花粉量少的菊花品种为‘诺亚’；所述花粉量中的菊花品种为‘南农红焰’；所述花粉量多的菊花品种为‘南农菲紫’、‘南农红橙’、‘南农银山’。
步骤(2)中于授粉后24h分别统计各杂交组合中花粉在柱头上的萌发数量；步骤(3)中于授粉后8、12、18天统计子房的饱满数和不饱满数，计算子房饱满率，待种子成熟，统计结实率；结实率(％)＝平均每朵花序的种子数/平均每个花序的舌状花数×100％。
步骤(1)中所述人工杂交的方法为：在母本舌状花刚露色时剪去舌状花花瓣直至可以看见里面的柱头，但是不能碰及柱头，并用硫酸纸袋严格地套袋隔离；同时将即将散粉的父本花序进行套袋隔离，观察母本的柱头伸出并且呈“y”字型时，于晴天用毛笔收集父本的新鲜花粉，并将花粉轻轻地蘸在母本舌状花雌蕊柱头上，套袋隔离，1-2天后按上述方法再次授粉。
步骤(2)中于授粉后24h收集3个花序，分别随机挑选5个小花，立即用faa(70％乙醇:冰乙酸:甲醛的体积比为90:5:5)固定，保存在4℃冰箱备用；48h以后，用1mol·l-1naoh溶液软化8h，蒸馏水清洗3次，并小心地将花柱从小花中剥离出来，置于载玻片上，用胶头滴管滴加0.1％苯胺蓝溶液进行染色，随即于荧光显微镜下观察并拍照，记录下每个雌蕊柱头上的花粉萌发数，重复15次。
步骤(3)中在人工授粉后8、12、18d随机取5个花序，肉眼观察子房的饱满状况，并统计饱满与不饱满数，在体视显微镜下拍照；待种子成熟，剪下花序，将每个组合中60个花序随机分为3份，即为3个重复，每个重复20个花序，分别统计20个花序的舌状花数和饱满的种子数。
所述的步骤(4)包括以下步骤：
(ⅰ)每个f1代株系随机选取3个生长良好、大小适中的花序，进行管状花计数；
(ⅱ)从上述3个花序中分别随机选择5个还未散粉的管状花，用解剖针将花药剥离出来，记录每个小花的花药数；
(ⅲ)从外围未散粉的两三轮管状花中剥取60枚花药，放入干净的10ml离心管内，在烘箱中干燥，温度设为50℃，让花药开裂释放出花粉，3天后，用解剖针捣碎花药使花粉尽量完全散出，然后加入6ml20％的(napo3)6悬浮液，用wh-2微型涡旋混合涡旋使花粉分散均匀，用微量进样器吸取2μl悬浮液滴在载玻片上，在显微镜下观察并进行花粉量计数，重复10次，花药含粉量＝(每个载玻片上花粉粒数×3,000)/60；
(ⅳ)花序含粉量(粒/花序)＝单个花序管状花数×单花花药数×花药含粉量；
(ⅴ)在散粉盛期，根据柱头上花粉团的体积大小、花粉的采集难易程度，把表观花粉量分为多、中等、少、无4个等级，其中柱头上散落大量的花粉团、采集相对来说很容易并且采集量很大的划为表观花粉量多的品种；柱头上花粉团体积较小、花粉采集相对容易的划为表观花粉量中等的品种；而柱头上只能看见少许花粉的归为表观花粉量少的品种；有些品种柱头上完全见不到花粉，开放后的两性花中花药保持完整的为无表观花粉量品种。
上述的方法在选育无花粉污染菊花中的应用。
本发明所提供的高效选育无花粉污染菊花的方法具体包括以下步骤：
(1)以无花粉污染(花药不含花粉或花药壁不开裂)菊花品种‘kingfisher’、‘南农玉笏’、‘q1-62’、‘qx-107’、‘南农冰激凌’和‘qx-008’为母本，‘南农菲紫’、‘南农红橙’、‘南农银山’、‘南农红焰’和‘诺亚’为父本开展20组人工杂交实验，各品种花型、姿态都具有较高的观赏价值。杂交亲本花粉量性状如表1所示，20个杂交组合如表2所示。
表1.杂交亲本花粉量性状
表2.20个杂交组合
(2)于授粉后24h分别采集3个花序的小花，在荧光显微镜下观察并记录各个组合中花粉在柱头上的萌发数量，可以筛选出父本和母本亲和性较好的杂交组合。。
(3)于授粉后8、12、18d各取5个花序，用肉眼和体视显微镜观察并记录子房的饱满数和不饱满数。待种子成熟，统计结实率。子房饱满率与结实率存在着相关性，结实率与授粉后8天子房饱满率的比值能直观地表明胚胎发育与结实率的关系。
(4)测定杂交f1代散粉特性，包括单个花序管状花数、单花花药数、花药含粉量、花序含粉量和表观花粉量5个性状，分析花粉污染程度。其中花药含粉量、花序含粉量和表观花粉量可以用来判断花粉污染的程度，在此基础上，分析得到无花粉污染f1代株系较多的组合中亲本的性状，总结规律。
本发明的有益效果：
本发明针对花粉量性状，提供了一种高效选育无花粉污染菊花的方法，具有简单、快速、高效的特点，有利于科学地选择杂交亲本，简化杂交育种程序，为鲜切花市场提供优良的新品种，同时减轻花粉污染对人体的危害。
附图说明
图1为组合2和组合11授粉后8、12、18天子房形态。
其中，a、b、c分别为组合2授粉后8、12和18天饱满的子房；d、e、f分别为组合11授粉后8、12和18天不饱满的子房。标尺：200μm。
具体实施方式
1、人工杂交
在母本舌状花刚露色时剪去舌状花花瓣直至可以看见里面的柱头，但不能伤及柱头，并用硫酸纸袋严格地套袋隔离，用别针固定，挂上标牌注明日期。同时，将即将散粉的父本花序进行套袋隔离。约2-3天后，观察母本的柱头伸出并且呈“y”字型时，于晴天用毛笔收集父本的新鲜花粉，并将花粉轻轻地蘸在母本舌状花雌蕊柱头上，套袋隔离，在之前的标牌上写上父本母本名称和授粉时间，约1-2天后按前面的方法再次授粉。
2、花粉在柱头上的萌发
于授粉后24h收集3个花序，分别随机挑选5个小花，立即用faa(70％乙醇:冰乙酸:甲醛的体积比为90:5:5)固定，保存在4℃冰箱备用。48h以后，用1mol·l-1naoh溶液软化8h，蒸馏水清洗3次，并小心地将花柱从小花中剥离出来，置于载玻片上，用胶头滴管滴加0.1％(m/v)苯胺蓝溶液(即100ml去离子水中加入0.1g苯胺蓝)进行染色，随即于荧光显微镜(zeissaxioskop40)下观察并拍照，并记录下每个雌蕊柱头上的花粉萌发数，重复15次。
3、子房形态和结实率
在人工授粉后8、12、18天随机取5个花序，肉眼观察子房的饱满状况，并统计饱满与不饱满数，在体视显微镜下拍照。待种子成熟，剪下花序，将每个组合中60个花序随机分为3份，即为3个重复，每个重复20个花序，带回实验室，分别统计20个花序的舌状花数和饱满的种子数。
4、杂交后代散粉特性测定
单个花序管状花数：每个f1代株系随机选取3个生长良好、大小适中的花序，进行管状花计数。
单花花药数：从上述3个花序中分别随机选择5个还未散粉的管状花，用解剖针将花药剥离出来，记录每个小花的花药数。
花药含粉量：从外围未散粉的两三轮管状花中剥取60枚花药，放入干净的10ml离心管内，在烘箱中干燥，温度设为50℃，让花药开裂释放出花粉，约3d后，用解剖针捣碎花药使花粉尽量完全散出，然后加入6ml20％(m/v)的(napo3)6悬浮液(即100ml水中加入20g(napo3)6)，用wh-2微型涡旋混合涡旋使花粉分散均匀，用微量进样器吸取2μl悬浮液滴在载玻片上，在olympusbx41显微镜下观察并进行花粉量计数，重复10次，花药含粉量＝(每个载玻片上花粉粒数×3,000)/60。
花序含粉量：花序含粉量(粒/花序)＝单个花序管状花数×单花花药数×花药含粉量。
表观花粉量：在散粉盛期，根据柱头上花粉团的体积大小、花粉的采集难易程度，把表观花粉量分为多、中等、少、无4个等级。其中柱头上散落大量的花粉团、采集相对来说很容易并且采集量很大的划为表观花粉量多的品种；柱头上花粉团体积较小、花粉采集相对容易的划为表观花粉量中等的品种；而柱头上只能看见少许花粉的归为表观花粉量少的品种；有些品种柱头上完全见不到花粉，开放后的两性花中花药保持完整的为无表观花粉量品种。
结果分析
1、花粉在柱头上的萌发
在20个杂交组合中，花粉在柱头上的萌发数量存在着较大差异。从表3可以看出，组合2、组合3和组合19的花粉在柱头上萌发数量最多，分别为19.93粒、17.53粒和15.63粒，粘附在柱头上的花粉粒大多数都已经萌发，并且伸入到花柱中的花粉管清晰可见，说明这三个组合的亲本之间的亲和性良好，可用于以后的杂交。组合8、组合5和组合1的花粉在柱头上萌发数量中等，分别为6.87粒、9.87粒和10.87粒，图片中观察到粘附在柱头上的花粉数量并不多，但是萌发的花粉粒并不少。而组合10、组合18和组合11的花粉在柱头上萌发数量极低，分别为0.96粒、0.45粒和0粒，在柱头上只有少数花粉管伸入柱头，说明这三个组合亲本之间的亲和性不高，存在着杂交障碍。
表320个杂交组合花粉在柱头上的萌发数量
2、子房饱满率和结实率
受精后障碍是导致杂交结实率低的主要因素之一。由表4和附图1可知，组合2，组合3和组合4比值较大，分别为97.43％、94.40％和104.04％，说明这三个组合胚胎发育正常，很少发生胚胎败育，而组合11、组合15和组合16比值较小，分别为0、7.23％和2.00％，说明在胚胎发育过程中大多数胚胎发生了败育。
进一步研究分析发现，以无花粉菊花品种作为母本进行杂交，其柱头可授性和结实率较低；而以不散粉但花药内有花粉粒的品种作为母本，其柱头可授性和结实率普遍较高。
表420个杂交组合子房饱满率和结实率
3、杂交f1代花粉污染程度分析
统计9个杂交组合f1代花器性状(表5)。9个杂交组合共得到319个株系，有57个是无花粉污染的后代，其中23个株系中花药内没有花粉，34个株系是花药内有花粉但花药不开裂导致不能释放花粉。另外，统计了每个组合f1代中无花粉污染株系所占的比例，组合17(‘南农玉笏’ב诺亚’)得到无花粉污染株系的比例最高，占41.94％，组合9(‘qx-008’ב南农银山’)、组合19(‘q1-62’ב南农红焰’)和组合12(‘kingfisher’ב南农菲紫’)后代中无花粉污染株系的比例也较高，分别为25.00％、23.26％和22.22％。
进一步分析发现，以无花粉品种作为母本(组合12、组合17和组合19)，杂交后代中无花粉污染株系所占比例高，平均高达26.63％；而以不散粉但花药内有花粉的品种为母本，杂交后代中无花粉污染株系所占比例低，平均只有8.70％。因此，以无花粉品种为母本更容易获得无花粉污染杂交后代。另外，以无花粉品种为母本，相对于以花粉量多(组合12)和花粉量中等的品种(组合19)作为父本，花粉量少的品种作为父本，杂交后代中无花粉污染株系所占比例较高，高达41.94％。
表5f1表观花粉量等级分布
注：括号中下划线表示花药中无花粉的后代株数，右边代表有花粉但花药不开裂的后代株数。
总结
通过对20个杂交组合花粉在柱头上的萌发、子房饱满率与结实率和对9个组合杂交f1代花粉污染程度的分析，得到一种高效选育无花粉污染菊花的方法，即以无花粉菊花品种作为母本，以花粉量少的品种作为父本进行杂交，花粉在柱头上的萌发率和结实率较低，但是更容易获得无花粉污染杂交后代。这为培育无花粉污染菊花新品种提供理论指导，减轻花粉污染的危害，同时也为家居装饰以及其他各种场合中鲜切花的合理配置和城镇化建设中绿化植物的配置提供更多选择。