一种天然植物抗菌剂及制备方法与流程

本发明涉及一种天然植物提取物，特指一种tetrapleuratetraptera提取物及其在制备抗菌剂中的应用，利用天然植物tetrapleuratetraptera中的有效抗菌成分，制成安全无毒的天然植物抗菌剂,本发明是针对食品领域的食源性病原菌及mrsa等耐药性细菌的抗菌剂。

背景技术：

现有的食品抗菌剂品种很多，绝大多数使用的是具有一定毒性的有机抗菌剂，如香草醛或乙基香草醛类化合物。在这种背景下，食品安全领域急需一种安全的天然抗菌剂，并且具有广谱抗菌性。

tetrapleuratetraptera是一种西非豌豆家族开花植物，具有高度食用价值。花是黄色/粉红色，总状花序白色，果实有深褐色。通常发现在热带非洲的低地森林。果实由肉质果肉和小黑褐色种子组成。果实具有芳香，特征的芳香气味，归功于其驱虫性。它被用作香料和香气(异国热带气味)。它是尼日利亚的杀软体动物药用植物之一，也可用于管理抽搐，麻风病，炎症和类风湿性疼痛。这种植物可用来制作香料、药物，也可调味菜肴，但tetrapleuratetraptera的树皮和树根在食品抗菌领域的应用还未被提及。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种tetrapleuratetraptera提取物及其在食品抗菌领域中的应用，包括tetrapleuratetraptera树皮提取物和tetrapleuratetraptera树根提取物。

所述的tetrapleuratetraptera树皮提取物，采用如下的方法制备：tetrapleuratetraptera树皮充分清洗后，剪切、烘干，用无水乙醇在振荡培养器中浸泡提取，tetrapleuratetraptera树皮与无水乙醇的质量比为1：9，浸泡提取24h后，过滤得滤液，在旋转蒸发器中蒸干无水乙醇得tetrapleuratetraptera树皮提取物。

所述的tetrapleuratetraptera树根提取物，采用如下的方法制备：tetrapleuratetraptera树根充分清洗后，剪切、烘干，用无水乙醇在振荡培养器中浸泡提取，tetrapleuratetraptera树根与无水乙醇的质量比为1:9，浸泡提取24h后，过滤得滤液，在旋转蒸发器中蒸干无水乙醇得tetrapleuratetraptera树根提取物。

本发明的天然植物型抗菌剂的是tetrapleuratetraptera提取物，8h后，其杀菌率达到了99.9999％，显示了较好的杀菌效果，并且具有广谱抗菌性。tetrapleuratetraptera提取物不仅可以有效的杀死食源性病原菌，还对重要病原菌mrsa也有良好的抗菌效果。

附图说明

表1tetrapleuratetraptera树皮提取物对食源性病原菌及院内感染病原菌的抑菌效果与杀菌效果。

表2tetrapleuratetraptera树根对食源性病原菌及院内感染病原菌的抑菌效果与杀菌效果。

图1tetrapleuratetraptera提取物对大肠杆菌的抗菌效果。

图2tetrapleuratetraptera提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。

图3tetrapleuratetraptera提取物对大肠杆菌生物膜的抗菌效果。

图4tetrapleuratetraptera提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的抗菌效果。

图5tetrapleuratetraptera提取物对mrsa生物膜的抗菌效果。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此实施例1

tetrapleuratetraptera提取物对致病菌mic和mbc的测定：

1)实验菌(菌名为斜体)

食源性病源菌：

大肠杆菌(escherichiacoliifo3301)；

肠出血性大肠杆菌o157(escherichiacoli0157:h7)

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus30179)；

肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidisb11)；

枯草芽孢杆菌(bacilluscereusifo345)；

单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenesm24－1)；

院内感染病原菌：

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa(methicillin-resistantstaphylococcusaureust34)；

2)实验方法

将本实验所需的菌事先培养。在nb培养基中加入tetrapleuratetraptera树皮提取物，然后利用两倍梯度稀释使tetrapleuratetraptera树皮提取物的系列浓度分别为0.16％、0.08％、0.04％、0.02％、0.01％，加入适量上述供试菌，使初始菌浓度为10⁵cfu/ml，振荡培养。根据液体培养基的浑浊程度，判断tetrapleuratetraptera树皮提取物对各菌的mic(minimuminhibitoryconcentrations)，含最低tetrapleuratetraptera树皮提取物浓度且澄清者，即为tetrapleuratetraptera树皮提取物对供试菌的mic。并从mic浓度开始各浓度(mic、2mic、4mic)澄清样液进行平板划线，划好的平板恒温培养，无供试菌菌落生长的最小浓度，即为tetrapleuratetraptera树皮提取物对供试菌的mbc(minimumbactericidalconcentrations)。这里的浓度是指tetrapleuratetraptera树皮提取物的体积百分比，具体是指将tetrapleuratetraptera树皮提取物用pbs稀释至所需浓度。

在nb培养基中加入tetrapleuratetraptera树根提取物，然后利用两倍梯度稀释使tetrapleuratetraptera根提取物的系列浓度分别为0.16％、0.08％、0.04％、0.02％、0.01％，加入适量上述供试菌，使初始菌浓度为10⁵cfu/ml，振荡培养。根据液体培养基的浑浊程度，判断tetrapleuratetraptera树根提取物对各菌的mic，含最低tetrapleuratetraptera根提取物浓度且澄清者，即为tetrapleuratetraptera根提取物对供试菌的mic。并从mic浓度开始各浓度(mic、2mic、4mic)澄清样液进行平板划线，划好的平板恒温培养，无供试菌菌落生长的最小浓度，即为tetrapleuratetraptera树根提取物对供试菌的mbc。这里的浓度是指tetrapleuratetraptera树根提取物的体积百分比，具体是指将tetrapleuratetraptera树根提取物用pbs稀释至所需浓度。

3)实验结果

本发明样品植物型抗菌剂，对于以上病原菌均有很强的抗菌效果。由表1可知tetrapleuratetraptera树皮提取物对6种食源性病原菌和院内感染菌mrsa最小抑菌浓度范围为0.01％-0.1％，最小杀菌浓度范围为0.01％-0.1％。由表2可知tetrapleuratetraptera树根对6种食源性病原菌和院内感染菌mrsa最小抑菌浓度范围为0.01％-0.025％，最小杀菌浓度范围为0.0125％-0.05％。tetrapleuratetraptera树皮提取物和tetrapleuratetraptera树根提取物均具有广谱抗菌性，且在低剂量时就有较好地杀菌效果。

实施例2

tetrapleuratetraptera提取物对致病菌杀菌活性的测定：

1)实验菌(菌名为斜体)

大肠杆菌(escherichiacoliifo3301)；

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus30179)；

2)实验方法

在磷酸盐缓冲液中[phosphate-bufferedsaline,pbs,0.03mol/l,ph(7.2-7.4)]中加入一定浓度(1个mic)tetrapleuratetraptera提取物，并接入供试菌(10⁵-10⁶cfu/ml)，振荡均匀后，在37℃全温空气摇床中振荡(150r/min)培养，用平板菌落计数法测定残存菌数。

3)实验结果

如图1、图2所示，在tetrapleuratetraptera树皮提取物和tetrapleuratetraptera树根提取物作用8h后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌数从10⁶-10⁷cfu/ml下降至10cfu/ml以下，杀菌率达到99.999％，显示了较强的杀菌效果。

实施例3

tetrapleuratetraptera提取物对细菌生物膜的抗菌效果

1)实验菌

食源性病原菌：

大肠杆菌(escherichiacoliifo3301)；

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus30179)；

院内感染病原菌：

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa(methicillin-resistantstaphylococcusaureust34)；

2)实验方法

将不锈钢铁片(10mm×10mm)在无水乙醇中超声浸泡24h，用蒸馏水清洗干净后，121℃灭菌15min，将无菌不锈钢片加入含有一定浓度(1个mbc)的tetrapleuratetraptera树皮提取物的无菌tsb中作为实验组，将无菌不锈钢片加入未加抗菌剂的tsb中作为空白对照。在tsb中接入供试菌(10⁴cfu/ml),37℃静置培养一段时间(大肠杆菌培养24h，金黄色葡萄球菌和mrsa培养48h)。

将不锈钢片取出，用无菌pbs清洗3次，放入含有1mlpbs的试管中，超声10min,使不锈钢片上的生物膜脱落形成菌悬液。将得到的1ml菌悬液十倍梯度稀释，利用na对菌悬液中活菌数进行测定。

将不锈钢铁片(10mm×10mm)在无水乙醇中超声浸泡24h，用蒸馏水清洗干净后，121℃灭菌15min，将无菌不锈钢片加入含有一定浓度(1个mbc)的tetrapleuratetraptera树根提取物的无菌tsb中作为实验组，将无菌不锈钢片加入未加抗菌剂的tsb中作为空白对照。在tsb中接入供试菌(10⁴cfu/ml),37℃静置培养一段时间(大肠杆菌培养24h，金黄色葡萄球菌和mrsa培养48h)。将不锈钢片取出，用无菌pbs清洗3次，放入含有1mlpbs的试管中，超声10min,使不锈钢片上的生物膜脱落形成菌悬液。将得到的1ml菌悬液十倍梯度稀释，利用na对菌悬液中活菌数进行测定。

4)实验结果

本实验利用测定形成的生物膜中残存活菌数来评价tetrapleuratetraptera提取物对生物膜的清除性能。根据图3、4、5可以看出，未被tetrapleuratetraptera提取物作用的不锈钢片上的48h生物膜活菌数为10⁶-10⁷cfu/cm²，经过tetrapleuratetraptera提取物作用后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌不锈钢上残存活菌数为10³-10⁴cfu/cm²，mrsa不锈钢上残存活菌数为10⁴-10⁵cfu/cm²，说明tetrapleuratetraptera提取物对这三种致病菌的生物膜均有较好的清除效果。

表1

表2