一种三叶青组培苗的生产方法与流程

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种三叶青组培苗的生产方法。

背景技术：

三叶青，别名金线吊葫芦、三叶扁藤、石老鼠、小扁藤、石猴子、三叶对，为葡萄科崖爬藤属植物。三叶青是一味民间的中草药，极为珍稀，在浙江民间，采用三叶青治疗肿瘤的历史较为久远。三叶青药用功效神奇，具有提高免疫力、抗病毒、增强肝功能等功效，被中医药界誉为极品中草药，尤其对癌症、肿瘤、乙肝、小儿高热惊厥、支气管炎、肺炎、病毒性脑膜炎等具有独特的疗效作用。

三叶青在药理和临床等方面具抗肿瘤、抗病毒、退高热等特有的显著疗效，现在备受国内外学者的高度关注。随着三叶青在民间的广泛应用，以及现代先进科研技术在其研究中的运用，其药用价值的开发和利用将有着广阔的前景。然而，现有的野生三叶青濒临灭绝，根本无法满足当今社会的需求。因此，三叶青的人工繁殖将是一个非常重要的研究领域。

组培采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，便于稳定地进行周年培养生产，且植物材料能按几何级数繁殖生产。因此，组培是一种快速、低成本、且能提供规格一致优质种苗的新技术。

三叶青新品种“中泽1号”是浙江大学和浙江省中药研究所合作选育的产量与药效兼顾的三叶青优良品种，块根卵圆形，毛根不明显，特定设施基质栽培条件下，节茎较短，植株矮生，块根结果较集中，块根木质纤维极少，淀粉积累较高，鲜食麻感轻微，口感好，产量高。

目前，已有关于三叶青的组培快速繁殖的相关报道，例如：

申请公布号为cn101103700a的发明专利申请公开了一种三叶青的组培快速繁殖方法，该方法包括外植体的选取与处理，诱导培养，增殖培养，生根培养，移栽等步骤。该发明以ms培养基为基础，加入了辅助剂：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、6-苄基腺嘌呤、激动素、玉米素、萘乙酸、吲哚丁酸等，用于三叶青丛生芽诱导、壮苗及生根三个关键阶段的组织培养。该本发明的优点为：(1)三叶青的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵染和农药残留的影响，严格控制三叶青药材的质量；(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产；(3)可以保存三叶青的种质资源，同时有利于保护野生资源，减少对自然资源的破坏。

杭州市农业科学研究院生物技术研究所的钱丽华也公开了药用植物“三叶青”的组培快繁技术研究报道，其以药用植物"三叶青"的腋芽为供试材料，通过开展腋芽外植体诱导技术、不定芽继代增殖技术及试管苗生根技术研究，形成一套完整的"三叶青"组培快繁技术。试验结果表明：1/2ms+ba0.03～0.5mg/l可作为"三叶青"腋芽外植体诱导配，25d腋芽平均萌发率最高达92％；在此诱导配方上，23μmol·m^-2·s^-1的光照强度有利于腋芽的萌发，较8μmol·m^-2·s^-1下最高萌发率高出15.38％；ms基本培养基+ba2mg/l+naa0.2mg/l或ba2mg/l为不定芽继代增殖配方，不定芽平均增殖系数达5.455和4.135，继代周期缩短到35～40d；1/2ms+20g/l蔗糖+naa0.2mg/l为三叶青不定芽生根培养基配方，10～15d不定芽生根率达到98％以上。

上述方法均能有效培植三叶青，但是，针对不同品种的三叶青，组培快繁技术仍存在较大差异；并且本领域研究人员对于组培苗的栽培技术的研究还有待进一步深入研究。因此，有必要针对特定三叶青品种“中泽1号”研究一套特有的组培和配套栽培技术，以确保其产量和品质。

技术实现要素：

本发明提供了一种三叶青组培苗的生产方法，该方法获得的三叶青组培苗木质化程度高，苗粗根壮，炼苗所需时间短，移栽成活率高。

一种三叶青组培苗的生产方法，包括以下步骤：

(1)选取外植体：取三叶青品种“中泽1号”的当年生嫩枝，消毒后，切成含腋芽的小段；

(2)诱导培养：将所述小段接种于诱导培养基中，进行诱导培养，得到愈伤组织；诱导培养基以ms培养基为基础培养基，添加0.3～0.4mg/l的苄氨基腺嘌呤和0.02～0.04mg/l的萘乙酸；

(3)增殖培养：将所述愈伤组织转接到增殖培养基中，进行增殖培养；增殖培养基以ms培养基为基础培养基，添加2.0～3.0mg/l的苄氨基腺嘌呤和0.1～0.2mg/l的萘乙酸；

(4)生根培养：将所述增殖培养的外植体转接到生根培养培养基中，进行生根培养；生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，添加1.0～2.0mg/l吲哚丁酸；

(5)炼苗和移植栽培：生根培养后进行炼苗，再移栽至土壤基质中进行栽培；

(6)出圃；

所述ms培养基中采用水稻淀粉作为凝固剂，以ms培养基为基准，水稻淀粉的含量为50g/l，蔗糖含量为20g/l。

实验发现，在采用水稻淀粉作为凝固剂的ms培养基中水稻淀粉的含量为50g/l，蔗糖含量为20g/l时，能够

作为优选，步骤(1)中，所述消毒的过程为：将所述嫩枝先放入体积分数70％的乙醇溶液中浸泡10s后，用无菌水洗净，再放入体积分数为2％的次氯酸钠溶液中消毒10～15min，再无菌水冲洗3～4次。

作为优选，步骤(1)中，所述小段的长度为0.8～1.0cm。

作为优选，步骤(2)中，所述诱导培养的条件为：在光照强度3000～4000lx、温度25℃±2℃的条件下，光照培养10～12h/d。

作为优选，所述水稻淀粉来源于水稻品种“浙大脂稻1号”，其特性如下：淀粉的胶稠度＞65mm，热浆粘度＞2500cp，冷胶粘度＞3000cp，直链淀粉含量介于28～30％之间。

作为优选，步骤(3)中，所述增殖培养的条件为：在光照强度3000～4000lx、温度25℃±2℃的条件下，光照培养10～12h/d。

作为优选，步骤(4)中，所述生根培养的条件为：在光照强度3000～4000lx、温度25℃±2℃的条件下，光照培养10～12h/d。

作为优选，步骤(5)中，以质量分数计，所述土壤基质为60％的泥炭土和40％的珍珠岩，ph值为5.0～6.0。

作为优选，步骤(5)中，移栽4周内，控制光照强度为2000～4000lx；移栽4周后，控制光照强度为4000～6000lx；培养温度均为20～25℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明在诱导培养过程中采用水稻淀粉作为ms培养基中的凝固剂，并配合适宜的蔗糖含量，既显著降低了三叶青组培苗规模繁育的培养成本，又提高了三叶青组培苗的木质化程度，使组培苗的苗粗根壮，缩短炼苗所需时间，提高移栽成活率。

(2)本发明在诱导培养过程中采用水稻淀粉作为ms培养基中的凝固剂，在支撑组培体的同时，可以有效提供碳源促进愈伤组织的增殖，使幼苗更好地生长。

(3)与传统的琼脂相比，本发明采用的水稻淀粉成本低，主要体现在两方面：一方面，淀粉作为凝固剂替代琼脂，在保证培养基对组培体起支撑作用的前提下，成本远远低于琼脂，这使得大规模生产的成本显著降低；另一方面，淀粉属于糖类，可作为碳源为植物提供营养物质，表现出组培促生长效益，进一步降低生产成本。

附图说明

图1为实施例1中三叶青愈伤组织接种到增殖培养基2周后的培养基质的重量。

图2为实施例1中三叶青组织增殖培养后的幼苗接种到生根培养基中3周后的苗高、根长和根数。

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明做进一步阐释。

实施例1

本实施例采用的“中泽1号”是由浙江大学和浙江省中药研究所合作选育的产量与药效兼顾的三叶青优良品种，该品种可购买于杭州中泽生物科技有限公司或浙江大学。

采用的淀粉凝固剂来源于特用的水稻品种“浙大脂稻1号”，系浙江大学选育，其特性如下：淀粉的胶稠度＞65mm，热浆粘度＞2500cp，冷胶粘度＞3000cp，直链淀粉含量介于28～30％之间。

针对上述品种，本发明提供一种具体地三叶青组培苗的生产方法，具体步骤如下：

(1)外植体的选择：2014年冬季(12月上旬)，选择无病虫害、无病菌侵染的生长健壮的10株“中泽1号”三叶青上的当年生嫩枝。

(2)外植体的处理与接种：用洗涤剂水刷洗，经自来水冲洗干净，在超净工作台(sw-cj系列)上将外植体嫩枝先放入70％乙醇溶液中，浸泡10s后，用无菌水洗净，再放入2％次氯酸钠溶液中消毒15min后，无菌水冲洗3次；用无菌的解剖刀、镊子将嫩枝切成0.8cm的小段，每段保证含1个腋芽。

(3)诱导培养：将步骤(2)获得的小段接种于诱导培养基(培养皿直径75mm)中，每瓶10段小段，芽朝上插入培养基中，进行诱导培养，得到愈伤组织；

诱导培养基为ms培养基添加0.35mg/l苄氨基腺嘌呤和0.03mg/l萘乙酸；其中，ms培养基中采用水稻淀粉作为凝固剂，以培养基的体积计，淀粉的添加量为50g/l，蔗糖含量为20g/l；

前期进行暗培养，待芽萌发后再进行光培养；其中，光照强度为3000lx，光照时间为10h/d，培养温度为25℃±2℃；待小苗长至5cm以上时，切段进行增殖培养。

(4)增殖培养：将步骤(3)获得的小段接种于增殖培养基中，进行增殖培养；

增殖培养基为ms培养基添加2.5mg/l苄氨基腺嘌呤和0.2mg/l萘乙酸；其中，ms培养基中采用水稻淀粉作为凝固剂，以培养基的体积计，淀粉的添加量为50g/l，蔗糖含量为20g/l；

培养温度为25℃±2℃，光照强度为3000lx，光照时间为10h/d；待小苗长至2cm以上时，切断进行生根培养。

(5)生根培养：将步骤(4)获得的小段接种于生根培养基中，进行生根培养；

生根培养基为1/2ms培养基添加1.5mg/l吲哚丁酸；其中，ms培养基中采用水稻淀粉作为凝固剂，以培养基的体积计，淀粉的添加量为50g/l，蔗糖含量为20g/l；

培养温度为25℃±2℃，光照强度为4000lx，光照时间为12h/d；待小苗长至5cm以上时，移至温室炼苗。

(6)组培苗的炼苗和移植：将培养瓶置于25±3℃的温室中，自然散射光下，封口炼苗3d，再开口炼苗3d，然后开口炼苗时可在培养基表面洒一层薄薄的水；炼苗结束后，打开培养瓶盖，加水将培养基打散倒出，清水洗净小苗后，移植于穴盘中；其中，穴盘中的移植基质为质量分数60％的泥炭土+质量分数40％的珍珠岩。

(7)组培苗移植后的栽培管理：移栽时浇足水分，以后每3d淋水1次；定植后3周，相对湿度80％，当第一片新生叶完全展开后，相对湿度降至70％；移栽4周内，光照强度3000lx，4周后增加光照强度至5000lx，并可喷淋浇水；整个育苗期，温度为25℃；移栽第4～8周，每周喷施液肥1次，液肥中n：p：k＝20：10：20，稀释1500倍液使用；及时防治苗期病虫害。

(8)出圃：组培苗移栽2个月左右，新根长至5条以上，平均根长超过3cm，新叶4～5片以上，植株生长健壮、无病虫害、叶色翠绿即可出圃。

以上述采用水稻淀粉作为凝固剂的ms培养基(简称水稻淀粉组)为处理；原始ms培养基(凝固剂为琼脂的ms培养基，简称琼脂组)作为对照，进行组培苗的生产，其他步骤相同。

将三叶青愈伤组织接种到增殖培养基中2周后，对培养基质进行称重。

如图1所示，琼脂组鲜重增长平均仅为0.13g；水稻淀粉组的鲜重增长平均高达0.24g，增加近1倍，水稻淀粉的加入明显促进了增殖效应。

将三叶青组织增殖培养后的幼苗接种到生根培养基中3周后，调查苗高、根长与根数。

如图2所示，琼脂组的苗高平均为23.5厘米，根长7.3厘米，根数9.5；水稻淀粉组的苗高平均为27.8厘米，根长13.7厘米，根数17.2，表现出明显的促进效应，显示淀粉基质在支撑组培体的同时，可以有效提供碳源、促进三叶青组培苗的生产效应。

对比琼脂组和水稻淀粉组移栽苗的折干率，琼脂组为9.8％，水稻淀粉组为12.3％；对比炼苗时间琼脂组平均为45天，水稻淀粉组平均时间为15天；对比炼苗20天移栽成活率琼脂组86.4％，水稻淀粉组97.1％。