一种梅片树组织培养的培养基及培养方法与流程

本发明属于植物组织培养
技术领域：
，尤其涉及一种梅片树组织培养的培养基及培养方法。
背景技术：
：天然右旋龙脑在医药保健领域有着非常广泛的应用，而樟科植物中的梅片树是右旋龙脑的重要来源。传统的扦插生根方法，虽然也能实现繁殖目的，但具有植株易老化，开花结果年数少等缺点。植物组织培养是指用无菌技术培养植物的离体部分，如根尖、茎尖、叶片、胚、种子、果实以及各类组织与细胞、原生质体等。植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性，即植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在樟科植物中，香樟树、油樟、龙脑樟等植物的组织培养已有许多研究，分别得到了芽诱导、芽增殖、生根等各个阶段的最佳培养基，均以ms为基础培养基，例如在香樟树的组培快繁中，用改良的ms+6-ba1.2mg/l+naa0.2mg/l诱导出芽较为适宜，继代培养以改良ms+6-ba0.8mg/l+kt0.3mg/l+iba0.2mg/l较好，生根培养基1/3ms+iba0.35mg/l+naa0.2mg/l+ac0.2g/l，生根率可达96％以上；在龙脑樟的组培快繁中，以改良ms+ba2.0mg/l+naa0.1mg/l为芽诱导培养基，诱导率为93％，最佳增殖培养基为改良ms+6-ba2.0mg/l+naa0.05mg/l，增殖系数为5.57，生长周期为30天，适宜的增殖培养条件为温度25℃，光照强度3000lx，光照时间11小时，不定芽长势良好，最佳生根培养基为1/2改良ms+iba0.5mg/l+iaa0.4mg/l+蔗糖20g/l，生根率可达97.3％，生根条数为3-5条，生根时间为12天。对于梅片树的组织培养的研究极少，更是缺乏完整的组织快繁体系。目前仅有文献报道了梅片树组织培养的芽诱导培养基，其配方为：ms+6-ba2.0mg/l+naa0.05mg/l，芽诱导率达89.13％。尽管该培养基对梅片树的芽诱导率较高，但针对梅片树芽增殖培养和生根培养阶段的培养基还未见报道。因此，建立一套完整稳定、高效的梅片树组培快繁体系，以地推动梅片树的经济效益，具有重要的现实意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种梅片树组织培养的培养基及培养方法，使得该培养基配方能够显著提高梅片树的芽诱导率、增殖系数和生根率。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种梅片树植物组织培养的培养基，包括初代培养基、继代培养基和生根培养基；所述初代培养基为：dcr培养基+2～3mg/l6-ba+0.05～0.1mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.8～5.9；所述继代培养基为：dcr培养基+3～5mg/l6-ba+0.05～0.1mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.8～5.9；所述生根培养基为：dcr培养基+0～1mg/l6-ba+1.5mg/liba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖，ph值为5.8～5.9。对于植物组织培养，培养基是其生长状态的最关键因素之一，如果对初代诱导分化、继代增殖以及生根三个阶段的培养基选择以及组合搭配不当，则会导致各阶段的愈伤诱导率、不定芽分化率、增殖系数和生根率不理想。现有技术关于梅片树的组织培养仅公开了芽诱导培养基，经研究发现，该培养基并不适合梅片树的继代增殖以及生根两个阶段，导致无法有效地通过组织培养技术实现梅片树的快速扩繁。本发明选择特定的三个阶段的培养基组成了一个完整、高效的梅片树快繁体系，最终显著地提高了梅片树的芽诱导率、增殖系数和生根率，有效缩短了繁殖周期，为梅片树的产业化生产提供了更加有效的途径。在本发明提供的具体实施例中，初代培养基为:dcr培养基+2mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂和30g/l蔗糖，ph值为5.8；继代培养基为：dcr培养基+4mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.8；生根培养基为：dcr培养基+1.5mg/liba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖，ph值为5.8。在本发明提供的具体实施例中，所述初代培养基为：dcr培养基+2mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.9；所述继代培养基为：dcr培养基+3mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.9；所述生根培养基为：dcr培养基+1.5mg/liba+1mg/l6-ba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖，ph值为5.9。在本发明提供的另一具体实施例中，初代培养基为:dcr培养基+3mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂和30g/l蔗糖，ph值为5.8；继代培养基为：dcr培养基+5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.8；生根培养基为：dcr培养基+1.5mg/liba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖，ph值为5.8。本发明还提供了梅片树的组织培养方法，包括如下步骤：步骤1：将梅片树外植体接种到权利要求1～3任一项所述培养基中的初代培养基中进行初代芽诱导培养，诱导外植体长出腋芽；步骤2：将带有腋芽的外植体转接到权利要求1～3任一项所述培养基中的继代培养基进行芽增殖培养，得到丛生芽；步骤3：将丛生芽转接到权利要求1～3任一项所述培养基中的生根培养基进行生根培养，得到组培苗。优选地，步骤1中所述梅片树外植体接种前还包括：选择4～5月份采集梅片树的带芽一年生的健康枝条，去掉叶片保留叶柄，然后切成有一对芽或一个顶芽的长1～3cm小段，进行消毒处理。在本发明提供的实施例中，所述消毒处理具体为：将去掉叶片的梅片树枝条一次进行酒精消毒、水清洗、氯化汞溶液消毒和水清洗。作为优选，酒精的体积百分数为75％，酒精消毒的时间为1～2min；所述氯化汞溶液的质量百分浓度为0.1％，消毒时间为8-12min。作为优选，梅片树组织培养的光照周期为16h/d，光照强度为3500lx，培养温度为24～26℃，相对湿度为30～40％。在本发明提供的实施例中，梅片树组织培养的光照周期为16h/d，光照强度为3500lx，培养温度为25℃，相对湿度为34％。作为优选，本发明提供的组织培养方法中，获得组培苗后还包括炼苗的步骤。在本发明提供的具体实施例中，炼苗为：闭瓶室外弱光放置5天，适当遮阴；强光下放置5天，然后将组培苗打开瓶盖通风5-7天，期间用薄膜覆盖保湿，适当喷水；移栽后淋足定根水，薄膜覆盖保湿，根据湿度适当补水，逐渐减少喷水量并逐渐去掉覆膜，30-40d后转入正常养护。本发明以梅片树枝条为外植体，选择特定的初代培养基、继代培养基和生根培养基，利用植物组织培养技术，通过一种新途径实现了梅片树组织培养的快速繁殖，显著提高了梅片树的芽诱导率、繁殖系数和生根率，缩短了繁殖周期，建立了稳定、高效的组培快繁体系，为梅片树的产业化生产提供了更加有效的途径。附图说明图1示本发明实施例1接种用的梅片树外植体图；图2示本发明实施例1梅片树外植体腋芽诱导图；图3示本发明实施例1用于继代培养的梅片树外植体图；图4示本发明实施例1梅片树丛生芽增殖图；图5示本发明实施例1梅片树小苗生根图；图6示本发明实施例1移栽前的梅片树组培苗图。具体实施方式本发明公开了一种梅片树组织培养的培养基及培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1梅片树的组织培养(1)采集4～5月份靠近基部一年生带芽的梅片树健康枝条作为外植体，避开阴雨天采集，去除叶片保留叶柄，然后用洗涤剂浸泡除去表面杂物。(2)在超净工作台内将外植体剪成带有1-2个腋芽的2～3cm左右的茎段，先用75％酒精浸泡1min，然后用无菌水冲洗6次，每次浸泡1min；再用0.1％升汞溶液浸泡灭菌10min，最后再用无菌水冲洗6次，每次浸泡1min。(3)将处理好的外植体接种到分装好的初代培养基中，其中，初代培养基为：dcr培养基+2mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂和30g/l蔗糖，ph值为5.8。置于光照16h/d的培养房，保持温度25±1℃，光照强度3000lx，相对湿度为34％。培养30天后，外植体长出腋芽(如图2所示)记录出芽情况，统计芽诱导率。(4)选择初代芽诱导中带有优质腋芽且腋芽长至1.5-2cm的外植体(如图3所示)，在超净工作台内轻轻将腋芽从原外植体上取下，转接到继代培养基中。继代培养基为：dcr培养基+4mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.8。置于步骤(3)相同的培养环境下培养30天，记录芽增殖情况(如图4所示)，并计算丛生芽的增殖系数。(5)选取丛生芽中长至1.5cm以上的色绿健康粗壮的带有侧芽的小苗，在超净工作台内用镊子将芽轻轻从原培养基中取出，剪去下端愈伤组织，接种于生根培养基中，生根培养基为：dcr培养基+1.5mg/liba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖，ph值为5.8。培养20天左右，小苗开始生根，培养三周，观察生根情况(如图5所示)，并计算生根率。(6)选取生长健壮，根系发达的组培苗(如图6所示)，闭瓶室外弱光放置5天，适当遮阴；强光下放置5天，然后将组培苗打开瓶盖通风5-7天，期间用薄膜覆盖保湿，适当喷水；移栽后淋足定根水，薄膜覆盖保湿，根据湿度适当补水，逐渐减少喷水量并逐渐去掉覆膜，30-40d后转入正常养护。实施例2梅片树的组织培养(1)采集4～5月份靠近基部一年生带芽的梅片树健康枝条作为外植体，避开阴雨天采集，去除叶片保留叶柄，然后用洗涤剂浸泡除去表面杂物。(2)在超净工作台内将外植体剪成带有1-2个腋芽的2～3cm左右的茎段(如图1所示)，先用75％酒精浸泡2min，然后用无菌水冲洗6次，每次浸泡1min；再用0.1％升汞溶液浸泡灭菌12min，最后再用无菌水冲洗6次，每次浸泡1min。(3)将处理好的外植体接种到分装好的初代培养基中，其中，初代培养基为：dcr培养基+2mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.9。置于光照16h/d的培养房，保持温度25±1℃，光照强度3000lx，相对湿度为34％。培养30天后，外植体长出腋芽，记录出芽情况，统计芽诱导率。(4)选择初代芽诱导中带有优质腋芽且腋芽长至1.5-2cm的外植体，在超净工作台内轻轻将腋芽从原外植体上取下，转接到继代培养基中。继代培养基为：dcr培养基+3mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.9。置于步骤(3)相同的培养环境下培养30天，记录芽增殖情况，并计算丛生芽的增殖系数。(5)选取丛生芽中长至1.5cm以上的色绿健康粗壮的带有侧芽的小苗，在超净工作台内用镊子将芽轻轻从原培养基中取出，剪去下端愈伤组织，接种于生根培养基中，生根培养基为：dcr培养基+1.5mg/liba+1mg/l6-ba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖，ph值为5.9。培养20天左右，小苗开始生根，培养三周，观察生根情况，并计算生根率。(6)选取生长健壮，根系发达的组培苗，闭瓶室外弱光放置5天，适当遮阴；强光下放置5天，然后将组培苗打开瓶盖通风5-7天，期间用薄膜覆盖保湿，适当喷水；移栽后淋足定根水，薄膜覆盖保湿，根据湿度适当补水，逐渐减少喷水量并逐渐去掉覆膜，30-40d后转入正常养护。实施例3梅片树的组织培养初代培养基为:dcr培养基+3mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂和30g/l蔗糖，ph值为5.8；继代培养基为：dcr培养基+5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph值为5.8；生根培养基为：dcr培养基+1.5mg/liba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖，ph值为5.8。其他操作同实施例1。试验例1采用实施例1-2的试验方法进行梅片树的组织培养，统计芽诱导率、丛生芽增殖系数以及生根率。试验设置4个对照组1～3，具体分组为：对照组1：初代培养基为ms培养基+2mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，继代培养基为：ms培养基+4mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，生根培养基为：ms培养基+1.5mg/liba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖对照组2：以改良ms培养基(硝酸铵含量减半，即硝酸铵浓度为825mg/l)为基础培养基，其中，初代培养基为：改良ms培养基+2mg/l6-ba+0.0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，继代培养基为：改良ms培养基+4mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，生根培养基为：改良ms培养基+1.5mg/liba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖。对照组3：以改良dcr培养基(硝酸铵和硝酸钾含量均减半，即硝酸铵浓度为200mg/l、硝酸钾浓度为170mg/l)为基础培养基，其中，初代培养基为：改良dcr培养基+2mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，继代培养基为：改良dcr培养基+4mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+10g/l琼脂+30g/l蔗糖，生根培养基为：改良dcr培养基+1.5mg/liba+10g/l琼脂+10g/l蔗糖。对照组1～3除培养基与实施例1不同外，其他操作同实施例1。试验结果如表1～3所示：表1芽诱导情况方法接种外植体数(个)出芽数(个)出芽率(％)生长状态实施例111810689.83++++实施例21078882.24++++对照组114010373.57+++对照组216012980.62+++对照组314010977.86++注：++表示芽长度处于0.5-1cm之间，生长状态正常，+++表示芽长度处于1cm～1.5cm以上，生长状态较好，++++表示芽长度处于1.5cm以上，叶片色绿且舒展，生长状态好表2芽增殖情况方法接种芽数(个)出芽数(个)增殖系数生长状态实施例11242832.28++++实施例21402872.05++++对照组11201951.63++++对照组21302421.86+++对照组31201831.53++表3生根情况由表1～3的数据可知，相比对照组1～3的培养基，本发明选择特定的初代培养基、继代培养基和生根培养基，实现了梅片树组织培养的快速繁殖，显著提高了梅片树的芽诱导率、繁殖系数和生根率。采用本发明实施例3的培养基对梅片树进行组织培养，其芽诱导率、繁殖系数和生根率的结果与实施例1～2相同或相近，无显著差异(p＞0.05)。试验例2本发明以dcr培养基为基础培养基，研究了本申请激素组合以外的其他培养基对梅片树芽诱导、芽增殖以及生根情况的影响，结果如表4～6所示：表4不同激素组合对梅片树芽诱导的影响表5不同激素组合对梅片树芽增殖的影响表6不同激素组合对梅片树生根的影响由表4～6的数据可知，采用本申请激素组合以外的其他培养基对梅片树外植体进行培养，芽诱导率、繁殖系数和生根率均明显不如本申请。表明，本发明选择特定的初代培养基、继代培养基和生根培养基，实现了梅片树组织培养的快速繁殖，显著提高了梅片树的芽诱导率、繁殖系数和生根率。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12