一种用于烟草黑胫病的杀菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于植物病害防治领域，尤其涉及一种用于烟草黑胫病的杀菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

烟草黑胫病phytophthoraparasiticavar.nicotianae(vannbredadehaan)是烟草生产上最具毁灭性的主要病害之一，在中国烟草平均发病率为5％-12％，严重田块发病率高达75％，黑胫病一旦发生就会迅速蔓延，危害烟株健康，甚至造成烟田绝收，严重影响烟叶生产，给烟草生产造成了巨大的经济损失。

目前，烟草黑胫病多采用化学药剂防治，化学农药的使用，不仅会对烟株本身的健康造成严重影响，而且会导致各种有害病菌产生耐药性，增加后续发生病害的防治难度，更严重的是，化学药剂的大量使用会使烟叶内含有化学药剂残留物，进一步危害人们健康，污染环境，破坏生态平衡。植物源农药作为生物农药的重要组成部分，具有高效、易降解、不污染环境、低残留、选择性高的优点，因此，利用植物提取物研制成高效、低毒、广谱、不易产生抗性的新型杀菌剂防治烟草黑胫病是本领域技术人员研究的新方向。然而，目前用于烟草黑胫病的植物源杀菌农药仍具有以下不足：1)纯粹的植物源提取物药剂，其成分受大田环境的影响而容易降解，尤其是在自然大田环境中，遇光更易降解，即失效快，药效不稳定；2)若有雨水冲刷或者露水稀释，效果更差。

因此，急需研究一种药效稳定，同时药剂的附着力增加，受雨水冲刷或者露水稀释影响相对较少，且防治效果倍增的用于烟草黑胫病的杀菌剂。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种药效稳定，同时药剂的附着力增加，受雨水冲刷或者露水稀释影响相对较少，且防治效果倍增的用于烟草黑胫病的杀菌剂及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种用于烟草黑胫病的杀菌剂，按质量分数包括黄柏提取物90％-96％、甲基硅油3％-9％以及不超过1％的环氧氯丙烷。

上述的杀菌剂，优选的，按质量分数由黄柏提取物96％、甲基硅油3％以及环氧氯丙烷1％组成，所述黄柏提取物由黄柏经乙醇回流提取法制得。

优选的，所述黄柏提取物包括小檗碱、黄柏碱和黄柏酮中的至少一种。

本发明的主要成分药用植物黄柏(phellodendronchinenseschneid.)的植物形态特征优选为：芸香科黄檗属阔叶乔木，树高10-25米，树皮淡黄褐色或淡灰色，具厚栓皮，有弹性，内层鲜黄色；浆果状核果圆球形，熟时紫黑色，有特殊香气，果期9-10月。黄柏属暖温带植物，具有较强的抗寒能力，生长速度快，有一定的耐寒性，也比较抗干旱；分布广，产于我国湖南、湖北、陕西、河南、广东、广西、四川及东北地区等地，也可通过种子繁殖或分株或扦插繁殖进行人工栽培生产，可见其来源广泛，取材方便。现代医学研究证明，黄柏具有抗菌、抗滴虫、消炎、抗溃疡、抗氧化、抗病毒等多种药理活性，已被广泛应用于医药领域，黄柏抗菌有效成分主要为小檗碱、黄柏碱等生物碱类和黄柏酮等黄酮类物质，黄柏煎剂或浸剂对常见的致病性真菌有不同程度的抑菌作用，基于此，本发明人利用黄柏的抗菌、消炎等药理作用，以黄柏乙醇提取物为主成分，添加增效剂甲基硅油和稳定剂环氧氯丙烷，以研制本发明的用于烟草黑胫病的杀菌剂。

甲基硅油具有绝缘、防尘、防霉的作用，作为一种添加剂，能延长本发明药剂的保存期，同时，可提高药物对病菌的渗透能力，提高药效，也是一种增效剂。

环氧氯丙烷是一种有机化合物，也是一种含氧物质的稳定剂，具有粘结性强、化学稳定性好特性，本发明药剂中作为一种添加剂，能增加药剂的附着力，增强药剂稳定性，也是一种稳定剂，因为其具有一定的毒性，故浓度控制在1％以内。

基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种用于烟草黑胫病的杀菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)把黄柏阴干，粉碎，得到黄柏粉，倒入乙醇溶液，加热进行第一次回流提取，得到一次提取液；

(2)将步骤(1)后得到的提取液抽滤后，倒入乙醇溶液，加热进行第二次回流提取，得到二次提取液；

(3)将步骤(2)后得到的二次提取液进行减压旋转蒸发，得到膏状黄柏提取物；

(4)将步骤(3)后得到的膏状黄柏提取物用低浓度乙醇溶液溶解，制成饱和黄柏溶液，加入甲基硅油和环氧氯丙烷后震荡混匀，即得到所述的杀菌剂。

上述的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，每克黄柏加入10ml乙醇溶液，乙醇溶液的体积浓度为75％，加热温度为60-95℃，提取时间为30-60min；所述步骤(2)中，每克黄柏加入5ml乙醇溶液，乙醇溶液的体积浓度为75％，加热温度为60-95℃，提取时间为30-60min。

优选的，在电热套加热回流提取装置中进行提取。

优选的，所述步骤(3)中，旋转的转速为60-75转/min，蒸发的加热温度为60-75℃。

优选的，所述步骤(3)中，在旋转蒸发仪中进行减压旋转蒸发，真空泵的制冷温度为-2.0-10℃。

优选的，所述步骤(4)中，低浓度乙醇溶液的体积浓度为5％。

基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述杀菌剂在大田烟草黑胫病防治领域的应用，所述杀菌剂的施用方法为按100倍稀释后每株烟灌根500ml，施用时间分别为烟株移栽后7天和团棵期，共施用两次。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明用于烟草黑胫病的杀菌剂，是一种以黄柏提取物为主的杀菌剂，黄柏植物分布广，容易大面积栽培生产，材料来源广，成分简单，成本低，同时添加了增效剂甲基硅油和稳定剂环氧氯丙烷，药效稳定，同时药剂的附着力增加，受雨水冲刷或者露水稀释影响相对较少，防治效果倍增，相对于化学药剂更容易降解，没有残留，同时还减少了其他金属类化学药剂的施入，降低了土壤农药残留，可直接用于烟草大田黑胫病的防治；经田间试验，对烟草黑胫病的防治效果在80％以上，效果明显，在防治烟草大田黑胫病中高效、低毒且不会污染环境，对于提高烟叶品质、保障其安全性以及保持生态平衡具有十分重要的实践意义。

2、本发明的制备方法，对黄柏进行两道提取工艺，把黄柏粉倒入电热套加热回流提取装置，进行回流提取，保证了黄柏中的主成分不至于挥发流失，得到黄柏较完整的提取液，然后将经过二次提取的黄柏提取液倒入旋转蒸发仪中，进行减压旋转，蒸发至膏状，得到膏状黄柏提取物，便于保存以及配制浓度的精准定量，总之，两道提取工艺作用独特，具有不可替代性，且工艺简单，省时省力，容易生产，具备了大批量生产的可能性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中电热套加热回流提取装置的试验实物图。

图2是实施例1中旋转蒸发仪的试验实物图。

图3是实施例1中本杀菌剂与对照室内平板实验效果对比图(左为对照，右为本杀菌剂)。

图4是实施例1中本杀菌剂的大田烟草黑胫病防治试验现场图(左行为对照，即喷施清水；右行喷施本发明的杀菌剂)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种本发明的用于烟草黑胫病的杀菌剂，包括以下质量分数的各组分：黄柏提取物96％、h201甲基硅油3％和环氧氯丙烷1％，所述黄柏提取物包括小檗碱、黄柏碱和黄柏酮中的至少一种。其制备方法包括以下步骤：

(1)把黄柏阴干，粉碎，得到黄柏粉100g，倒入电热套加热回流提取装置(如图1所示)，再倒入体积浓度为75％的乙醇溶液1000ml，温度设置为95℃，进行提取30min，得到一次提取液；

(2)将步骤(1)后得到的一次提取液抽滤后，加入体积浓度为75％的乙醇溶液500ml，温度设置为95℃，进行第二次提取30min，得到二次提取液；

(3)将步骤(2)后得到的二次提取液倒入旋转蒸发仪中(如图2所示)，温度控制为60-75℃，真空泵的制冷温度为4℃左右，形成负压真空，进行减压旋转，旋转的转速为75转/min，蒸发至膏状，得到黄柏提取物(膏状黄柏提取物便于保存，也便于后期用5％的乙醇溶解制成饱和黄柏溶液时控制用量)；

(4)将步骤(3)后得到的膏状黄柏提取物用体积浓度为5％的乙醇溶解，制成饱和黄柏溶液，加入甲基硅油和环氧氯丙烷后震荡混匀，黄柏提取物、甲基硅油和环氧氯丙烷的质量百分比分别为96％、3％和1％，即得到所述的杀菌剂。

将上述得到的杀菌剂进行平板抑菌试验，采用菌丝生长速率法生物测定技术进行测定。先将本发明的杀菌剂用无菌水溶解，配制成500倍浓度溶液备用，用打孔器在长满烟草黑胫病病原菌的培养基上切取菌饼，将菌饼放入杀菌剂溶液中浸泡5分钟，再转移到无菌空培养皿(直径90mn)中，置于25℃恒温箱中培养，分别在3天和5天后，以无菌水作为空白对照，用十字交叉法测定抑菌圈直径，以分析杀菌剂(500倍浓度)对黑胫病病菌的影响，实验结果如表1和图3所示。

表1：杀菌剂(500倍浓度)对黑胫病病菌的影响(cm)

(注明：数字后附不同大、小写字母分别表示差异水平达0.01、0.05显著水平，下同。)

由表1可以看出，在培养3天和5天时，与对照相比，杀菌剂处理的菌落直径更小，

有极显著差异，说明本发明的杀菌剂500倍浓度液对黑胫病菌有很好的抑菌效果。与化学药剂对照(体积浓度为72％的甲霜锰锌可湿性粉剂)相比，在5天时，杀菌剂处理的菌落直径要大，但没有显著差异，说明杀菌剂对黑胫病菌的抑菌效果与甲霜锰锌可湿性粉剂相当。

如图3所示，图左边为对照，右边为本发明的杀菌剂，2个培养皿中的小黑圈是菌饼和其生长的菌丝，对照采用的是杀菌后的无菌水，菌落直径近5.0cm，杀菌剂是本发明杀菌剂，菌落直径不到1.0cm，在对照(无菌水)对照中，菌饼的菌丝直径明显比本发明的杀菌剂直径要大。

为检验本发明的杀菌剂的室内防治效果，进行了以下实验。实验设计了12个配方的制剂，500倍浓度的室内效果生物测定，3d后调查菌落生长直径，见表2。

表2：各生物制剂(500倍浓度)对黑胫病病菌的影响(cm)

由表2可看出，1)在3天时，与空白对照(ck1)相比，各处理的菌落直径要小，均有极差异，说明各个配方的药剂，均有极显著的抑菌效果；2)在3天时，与各个提取液原液配方(c100％、a100％、b100％，即不添加增效剂和稳定剂)相比，配方(黄柏提取物+甲基硅油+环氧氯丙烷)处理的菌落直径要小，且有显著差异，这说明添加了增效剂甲基硅油和稳定剂环氧氯丙烷的黄柏提取液的制剂抑菌效果要明显好于黄柏提取液(不添加增效剂和稳定剂)；3)在3天时，与土黄连和黄独的配方相比，配方(黄柏提取物+甲基硅油+环氧氯丙烷)处理的菌落直径要小，说明配方(黄柏提取物+甲基硅油+环氧氯丙烷)的抑菌效果要好于中药材土黄连和黄独提取液；4)与阳性对照(ck2)，即72％甲霜锰锌可湿性粉剂(市购)相比，配方(黄柏提取物+甲基硅油+环氧氯丙烷)处理的菌落直径要小，尤其是本发明配方(黄柏提取物96％+甲基硅油3％+环氧氯丙烷1％)且有显著差异，说明本发明药剂具有明显的抑菌效果。

为检验本发明的杀菌剂的大田防治效果，进行了以下试验，试验现场如图4所示。

1.试验设计：试验在大田移栽后进行，试验设不施药(ck1)、化学农药(ck2：甲霜-锰锌)、本发明的杀菌剂共3个处理，共9个小区，每个小区种烟60株以上，小区按随机区组试验设计，3次重复。杀菌剂由本发明的制备方法制得，阳性对照化学农药为72％甲霜锰锌可湿性粉剂(市购)，空白对照为清水。

2.试验地点：试验地点分别设在湖南省龙山县大安镇烟草基地，上年黑胫病发病较重的田块。

3.供试品种：云烟87。

4.施药时期与方法

烟苗4月21日移栽。施药时期在烟株移栽后7天和团棵期，共施药两次。施药方法：将本发明的杀菌剂用水稀释100倍后，每株烟灌根500ml稀释药液。本发明的杀菌剂保持于避光阴凉处，使用前要充分摇匀。

5.观察与记载

调查时间：第一次在团棵期用药后7天；第二次调查在打顶后7天；第三次调查在烟叶上部叶采收之前；共调查三次，主要调查大田烟株发病率和烟株发病级数，计算病情指数。

6.病情分级

0级：全株无病。

1级：茎部病斑不超过茎围的三分之一，或三分之一以下叶片凋萎。

3级：茎部病斑环绕茎围三分之一至二分之一，或三分之一至二分之一叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑。

5级：茎部病斑超过茎围的二分之一，但未全部环绕茎围，或二分之一至三分之二叶片凋萎。

7级：茎部病斑全部环绕茎围，或三分之二以上叶片凋萎。

9级：病株基本枯死。

7.调查数据及计算

药效计算方法参照以下方法进行：

8.试验结果

不同处理对烟草黑胫病的防治效果见表3所示。

表3：不同处理对烟草黑胫病的防治效果

由表3可知，本发明的药杀菌剂对烟草大田黑胫病具有很好的防治效果，对黑胫病的防治效果达到了81.77％。结合表1可知，室内平板抑菌试验结果显示本发明的杀菌剂对黑胫病菌的抑菌效果与甲霜锰锌可湿性粉剂相当，而在大田试验结果却显示本发明的杀菌剂对黑胫病菌的防治效果比甲霜锰锌可湿性粉剂的防治效果高出了70％以上，这说明本发明的杀菌剂药效稳定，药剂的附着力更强，受雨水冲刷或者露水稀释影响相对较少，防治效果更明显，更适合用于烟草大田黑胫病的防治。

由图4可知，左行为对照，即喷施清水，可明显看到烟草茎杆基本黑死，而右行喷施本发明的杀菌剂，与对照处理行相邻却无烟草茎杆黑死现象，这说明本发明对烟草黑胫病的防治效果明显。

实施例2：

一种本发明的用于烟草黑胫病的杀菌剂，包括以下质量分数的各组分：黄柏提取物96％、h201甲基硅油3％和环氧氯丙烷1％，所述黄柏提取物包括小檗碱、黄柏碱和黄柏酮中的至少一种。其制备方法包括以下步骤：

(1)把黄柏阴干，粉碎，得到黄柏粉150g，倒入电热套加热回流提取装置，再倒入体积浓度为75％的乙醇溶液1200ml，温度设置为60-95℃，浸泡120-180min，进行提取30min，得到一次提取液；

(2)将步骤(1)后得到的一次提取液抽滤后，加入体积浓度为75％的乙醇溶液500ml，温度控制为60-95℃，进行第二次提取30min，得到二次提取液；

(3)将步骤(2)后得到的二次提取液倒入旋转蒸发仪中，温度控制为60-75℃，真空泵的制冷温度为4℃左右，形成负压真空，进行减压旋转，旋转的转速为75转/min，蒸发至膏状，得到黄柏提取物(膏状黄柏提取物便于保存，也便于后期用5％的乙醇溶解制成饱和黄柏溶液时控制用量)；

(4)将步骤(3)后得到的膏状黄柏提取物用体积浓度为5％的乙醇溶解，制成饱和黄柏溶液，加入甲基硅油和环氧氯丙烷后震荡混匀，黄柏提取物、甲基硅油和环氧氯丙烷的质量百分比分别为96％、3％和1％，即得到所述的杀菌剂。

为检验本发明的杀菌剂的大田防治效果试验，进行了以下试验。

1.试验设计：试验在大田移栽后进行，试验设不施药(ck1)、化学农药(ck2：甲霜-锰锌)、本发明的杀菌剂共3个处理，共9个小区，每个小区种烟60株以上，小区按随机区组试验设计，3次重复。杀菌剂由本发明的制备方法制得，阳性对照化学农药为72％甲霜锰锌可湿性粉剂(市购)，空白对照为清水。

2.试验地点：试验地点分别设在湖南省农业生物资源利用研究所药用植物基地进行。

3.供试品种：烟草k326。

4.施药时期与方法

烟苗3月16日移栽。施药时期在烟株移栽后7天和团棵期，共施药两次。施药方法：将本发明的杀菌剂按100倍稀释后，每株烟灌根500ml稀释药液。本发明的杀菌剂保持于避光阴凉处，使用前要充分摇匀。

5.观察与记载

调查时间：第一次在团棵期用药后7天；第二次调查在打顶后7天；第三次调查在烟叶上部叶采收之前；共调查三次，主要调查大田烟株发病率和烟株发病级数，计算病情指数。

6.病情分级

0级：全株无病。

1级：茎部病斑不超过茎围的三分之一，或三分之一以下叶片凋萎。

3级：茎部病斑环绕茎围三分之一至二分之一，或三分之一至二分之一叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑。

5级：茎部病斑超过茎围的二分之一，但未全部环绕茎围，或二分之一至三分之二叶片凋萎。

7级：茎部病斑全部环绕茎围，或三分之二以上叶片凋萎。

9级：病株基本枯死。

7.调查数据及计算

药效计算方法参照以下方法进行：

8.试验结果

不同处理对烟草黑胫病的防治效果见表4所示。

表4：不同处理对烟草黑胫病的防治效果

由表4可知，本发明的药杀菌剂对烟草大田黑胫病具有很好的防治效果，对黑胫病的防治效果达到了80.79％。