本发明涉及猪冷冻精液技术领域，具体为一种猪冷冻精液稀释液的制备方法。
背景技术：
随着人们生活水平的提升，科学养殖会对家畜业的养殖有很大的帮助，家畜精液冷冻保存研究已经开展了50多年，但是解冻后的精液活力仅在30％-50％左右，人工授精后不返情率和产仔率均显著低于新鲜和低温冷藏精液(本交和常温保存的精液)。猪养殖在我们家畜业养殖中扮演中必不可少的角色，但是猪精液冷冻过程中，细胞内外形成的冰晶对动物精子造成的机械损伤直接导致冷冻后精子活力的下降，如何降低冰晶的产生、减少冰晶对家畜精子的损伤一直是家畜繁殖技术和低温生物学研究领域的研究热点。通过改变精液稀释液的组成成分可以降低冷冻处理对精子的损伤，精液冷冻是保存遗传资源，建立精子基因库的重要措施。而冷冻后精子质量的好坏与家畜的妊娠率，产子率等密切相关。目前为止，猪精子在冷冻以后的精子活力、顶体完整率、质膜完整率等不很理想，致使在商品化养猪生产中，利用冷冻精液进行人工授精的母猪受胎率和产仔率较低而不能广泛应用，严重降低了优质公猪的利用率，饲养成本不能降低，生态环境的污染更没有得到缓解。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种猪冷冻精液稀释液的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种猪冷冻精液稀释液的制备方法，稀释液包括以下重量组份以及稀释溶液的配置步骤：双蒸水100ml、三羟甲基氨基甲烷0.45～0.90g、柠檬酸0.71～0.86g、单糖5.0～8.10g、青霉素0万u～100万u、链霉素0.20g～0.5g、肌醇类化合物0.29～6.97g、甘油6.7～9.5g、鲜蛋黄25～33ml；
s1：取料，取100ml双蒸水放置烧杯中，向烧杯中添加以上配比的三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、单糖、青霉素、链霉素、肌醇类化合物和甘油，然后均匀搅拌20～30分钟，得到溶液；
s2：调节ph值，在上述的溶液中添加柠檬酸调节溶液的ph值，其ph值为6.8～7.2；
s3：添加鲜蛋黄，在s2中的溶液中添加鲜蛋黄，进行均匀搅拌5～10分钟；
s4：离心，混合均匀后的溶液置于3～5℃下且以15000转/分的速率离心1～1.5小时；
s5：静置，把s4中的溶液静置20～30分钟，其中温度为3～5℃；
s6：过滤，取得s5中的上清液在0.45μm滤器过滤即可制得稀释溶液。
优选的，所述双蒸水的温度为32～38℃。
优选的，所述单糖为葡萄糖、果糖和乳糖之间任意两者的混合物。
优选的，所述肌醇类化合物为1，3-环己二醇或者1，4-环己二醇或者1，3，5-环己三醇或者三者的混合物。
优选的，所述鲜蛋黄经过50～60℃、25～35min的灭活处理。
本发明的有益效果是：本发明中肌醇类化合物能有效降低精液冷冻过程中冰晶的形成量，减少冰晶对精子的机械性损伤，最终提高猪动物冷冻精液的活率、活力、顶体完整性和质膜完整性等技术指标，使用肌醇类化合物作为精液冷冻稀释液的冰晶抑制剂，具有不会产生免疫反应、纯度有保证、价格低廉等优点。其中青霉素和链霉素主要起到杀菌、抑制微生物生长作用；单糖作为主要的能源物质；柠檬酸和三羟甲基氨基甲烷相互配合主要作为缓冲溶液使用，降低精子活动，从而延长精子寿命并保持受精能力。
本发明稀释液制备简单，且容易操作，能够高效率的产生人们所需要的猪精液溶液，进而提高猪精子的成活率，以方便人们大规模的养殖培育猪，进而减少猪养殖的成本，利用鲜蛋黄灭活处理，减少鲜蛋黄携带细菌而感染猪精子，提高稀释液中猪精子的成活率。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：
实施例一
一种猪冷冻精液稀释液的制备方法，稀释液包括以下重量组份以及稀释溶液的配置步骤：双蒸水100ml、三羟甲基氨基甲烷0.45g、柠檬酸0.71g、单糖5.0g、青霉素0万u、链霉素0.20g、肌醇类化合物0.29g、甘油6.7g、鲜蛋黄25ml；
s1：取料，取100ml双蒸水放置烧杯中，向烧杯中添加以上配比的三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、单糖、青霉素、链霉素、肌醇类化合物和甘油，然后均匀搅拌20分钟，得到溶液；
其中双蒸水的温度为32℃，单糖为葡萄糖、果糖和乳糖之间任意两者的混合物，肌醇类化合物为1，3-环己二醇或者1，4-环己二醇或者1，3，5-环己三醇或者三者的混合物；
本发明中的肌醇类化合物能有效降低精液冷冻过程中冰晶的形成量，减少冰晶对精子的机械性损伤，最终提高猪动物冷冻精液的活率、活力、顶体完整性和质膜完整性等技术指标，使用肌醇类化合物作为精液冷冻稀释液的冰晶抑制剂，具有不会产生免疫反应、纯度有保证、价格低廉等优点；
s2：调节ph值，在上述的溶液中添加柠檬酸调节溶液的ph值，其ph值为6.8；
s3：添加鲜蛋黄，在s2中的溶液中添加鲜蛋黄，进行均匀搅拌5分钟，鲜蛋黄经过50℃、25min的灭活处理，利用鲜蛋黄灭活处理，减少鲜蛋黄携带细菌以感染猪精子，进而影响稀释液的培养猪精子的效果；
s4：离心，混合均匀后的溶液置于3℃下且以15000转/分的速率离心1小时；
s5：静置，把s4中的溶液静置20分钟，其中温度为3℃；
s6：过滤，取得s5中的上清液在0.45μm滤器过滤即可制得稀释溶液。
本发明中其中青霉素和链霉素主要起到杀菌，抑制微生物生长作用；单糖使用作为主要的能源物质；柠檬酸和三羟甲基氨基甲烷相互配合主要作为缓冲溶液使用，降低精子活动，从而延长精子寿命并保持受精能力。
本发明稀释液制备简单，且容易操作，能够高效率的产生人们所需要的猪精液溶液，进而提高猪精子的成活率，以方便人们大规模的养殖培育猪，进而减少猪养殖的成本，利用鲜蛋黄灭活处理，减少鲜蛋黄携带细菌而感染猪精子，提高稀释液中猪精子的成活率。
实施例二
一种猪冷冻精液稀释液的制备方法，稀释液包括以下重量组份以及稀释溶液的配置步骤：双蒸水100ml、三羟甲基氨基甲烷0.75g、柠檬酸0.79g、单糖6.40g、青霉素50万u、链霉素0.3g、肌醇类化合物4.84g、甘油8.56g、鲜蛋黄30ml；
s1：取料，取100ml双蒸水放置烧杯中，向烧杯中添加以上配比的三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、单糖、青霉素、链霉素、肌醇类化合物和甘油，然后均匀搅拌25分钟，得到溶液；
其中双蒸水的温度为35℃，单糖为葡萄糖、果糖和乳糖之间任意两者的混合物，肌醇类化合物为1，3-环己二醇或者1，4-环己二醇或者1，3，5-环己三醇或者三者的混合物；
本发明中的肌醇类化合物能有效降低精液冷冻过程中冰晶的形成量，减少冰晶对精子的机械性损伤，最终提高猪动物冷冻精液的活率、活力、顶体完整性和质膜完整性等技术指标，使用肌醇类化合物作为精液冷冻稀释液的冰晶抑制剂，具有不会产生免疫反应、纯度有保证、价格低廉等优点；
s2：调节ph值，在上述的溶液中添加柠檬酸调节溶液的ph值，其ph值为7.0；
s3：添加鲜蛋黄，在s2中的溶液中添加鲜蛋黄，进行均匀搅拌8分钟，鲜蛋黄经过55℃、30min的灭活处理，利用鲜蛋黄灭活处理，减少鲜蛋黄携带细菌以感染猪精子，进而影响稀释液的培养猪精子的效果；
s4：离心，混合均匀后的溶液置于4℃下且以15000转/分的速率离心1.3小时；
s5：静置，把s4中的溶液静置25分钟，其中温度为4℃；
s6：过滤，取得s5中的上清液在0.45μm滤器过滤即可制得稀释溶液。
本发明中其中青霉素和链霉素主要起到杀菌，抑制微生物生长作用；单糖使用作为主要的能源物质；柠檬酸和三羟甲基氨基甲烷相互配合主要作为缓冲溶液使用，降低精子活动，从而延长精子寿命并保持受精能力。
本发明稀释液制备简单，且容易操作，能够高效率的产生人们所需要的猪精液溶液，进而提高猪精子的成活率，以方便人们大规模的养殖培育猪，进而减少猪养殖的成本，利用鲜蛋黄灭活处理，减少鲜蛋黄携带细菌而感染猪精子，提高稀释液中猪精子的成活率。
实施例三
一种猪冷冻精液稀释液的制备方法，稀释液包括以下重量组份以及稀释溶液的配置步骤：双蒸水100ml、三羟甲基氨基甲烷0.90g、柠檬酸0.86g、单糖8.10g、青霉素100万u、链霉素0.5g、肌醇类化合物6.97g、甘油9.5g、鲜蛋黄33ml；
s1：取料，取100ml双蒸水放置烧杯中，向烧杯中添加以上配比的三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、单糖、青霉素、链霉素、肌醇类化合物和甘油，然后均匀搅拌30分钟，得到溶液；
其中双蒸水的温度为38℃，单糖为葡萄糖、果糖和乳糖之间任意两者的混合物，肌醇类化合物为1，3-环己二醇或者1，4-环己二醇或者1，3，5-环己三醇或者三者的混合物；
本发明中的肌醇类化合物能有效降低精液冷冻过程中冰晶的形成量，减少冰晶对精子的机械性损伤，最终提高猪动物冷冻精液的活率、活力、顶体完整性和质膜完整性等技术指标，使用肌醇类化合物作为精液冷冻稀释液的冰晶抑制剂，具有不会产生免疫反应、纯度有保证、价格低廉等优点；
s2：调节ph值，在上述的溶液中添加柠檬酸调节溶液的ph值，其ph值为7.2；
s3：添加鲜蛋黄，在s2中的溶液中添加鲜蛋黄，进行均匀搅拌10分钟，鲜蛋黄经过60℃、35min的灭活处理，利用鲜蛋黄灭活处理，减少鲜蛋黄携带细菌以感染猪精子，进而影响稀释液的培养猪精子的效果；
s4：离心，混合均匀后的溶液置于5℃下且以15000转/分的速率离心1.5小时；
s5：静置，把s4中的溶液静置30分钟，其中温度为5℃；
s6：过滤，取得s5中的上清液在0.45μm滤器过滤即可制得稀释溶液。
本发明中其中青霉素和链霉素主要起到杀菌，抑制微生物生长作用；单糖使用作为主要的能源物质；柠檬酸和三羟甲基氨基甲烷相互配合主要作为缓冲溶液使用，降低精子活动，从而延长精子寿命并保持受精能力。
本发明稀释液制备简单，且容易操作，能够高效率的产生人们所需要的猪精液溶液，进而提高猪精子的成活率，以方便人们大规模的养殖培育猪，进而减少猪养殖的成本，利用鲜蛋黄灭活处理，减少鲜蛋黄携带细菌而感染猪精子，提高稀释液中猪精子的成活率。
以上三组实施例中实施例二中猪精子的成活率相对另外两组中的精子成活率偏高，且在实施例一和实施例三之间的数据范围之内，猪精子成活率相对在本发明中数据范围之外条件下的猪精子成活率较高。因此本发明研发了一种猪冷冻精液稀释液的制备方法，能够高效保证猪精子的成活率，以方便对家畜中猪的养殖。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。