一种神经干细胞冻存液及其使用方法与流程

本发明属于细胞技术领域，具体公开了一种神经干细胞冻存液及其使用方法。

背景技术：

神经干细胞(neuralstemcell,nsc)作为干细胞的一种,近年来越来越多地受到神经科学领域的重视,实行细胞替代治疗是新发展起来并具有广阔应用前景的治疗战略。神经干细胞的发现及其体外培养的成功,使今后有效地治疗中枢神经系统损伤和神经退行性疾病成为可能。

由中枢神经系统损伤如脑梗死、脑出血、脑外伤、脊髓外伤等和神经变性疾病如帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等所致的功能性丧失,是目前临床治疗领域的难题。传统的手术和药物治疗,只能够终止或预防外伤所致的继发损伤,但不能修复或补偿已经损伤丢失的神经细胞。对于神经变性进展性疾病,药物的疗效不佳,且长期服用易引起其他不良反应。许多向发育中和成年中枢神经系统内植入含有神经干细胞的胚胎脑组织以治疗帕金森氏病、脑外伤和垂体功能低下等的实验,已证明能够部分重建神经环路和功能。

目前神经干细胞的冻存只要有两种形式：第一种为冻存神经球，以直径80～100μm的神经干细胞球为标准进行冻存，冻存液为体积分数70％的dmemf12、体积分数20％的血清、体积分数10％的dmso组成。但是神经干细胞间的亲密联系和信号与直径尺寸共同作用，影响着神经干细胞的冻存复苏效果，且很难确定细胞数量，复苏后活率仅能到达80％左右；第二种为冻存单个神经干细胞，冻存液为体积分数70％的dmemf12、体积分数20％的血清、体积分数10％的dmso组成。由于冻存液组成相对单一，缺少必要的维持因子等，复苏后细胞活率也只能到达70％左右。

因此，寻找一种有效的保持高活性神经干细胞冻存液和操作方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明人对人nsc成功地进行了冻存、复苏及复苏后再培养,为神经干细胞移植的择期手术和建立“神经干细胞库”提供了方法学基础。还可避免由于神经干细胞传代次数增加而导致的细胞退化、衰老、甚至突变的可能。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高活性神经干细胞冻存液及其使用方法，建立一种长期低温保存神经干细胞的方法，以保持细胞的最大存活率，开展有效的干细胞移植及建立干细胞库。

在一个方面，本发明提供了一种神经干细胞冻存液，其包含细胞培养基、二甲基亚砜、血清、白蛋白、添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。

其中，二甲基亚砜(dmso)的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，避免细胞脱水褶皱；血清能够提高细胞复苏后的活率。在本发明的实施方案中，添加了人血白蛋白作为细胞冻存稳定剂使用，有利于调节细胞复苏时调节渗透压，具有保护细胞的作用，可进一步提高冻存细胞的存储稳定性；在冻存液中添加添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等神经干生长所必须的因子，可以维持冻存微环境，提供必要的营养物质。

在一个具体的实施方案中，按体积百分比计，在神经干细胞冻存液中细胞培养基占50-60％，二甲基亚砜占10-20％，血清占10-20％，白蛋白的溶液占10-40％，添加剂占1-2％；表皮生长因子在神经干细胞冻存液中的浓度为20-30ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子在神经干细胞冻存液中的浓度为20-30ng/ml。

在一个具体的实施方案中，按体积百分比计，在神经干细胞冻存液中白蛋白的溶液占10-20％。

在一个更具体的实施方案中，按体积百分比计，在神经干细胞冻存液中细胞培养基占50％，dmso占10％，血清占20％，白蛋白的溶液占18％，添加剂占2％；表皮生长因子在神经干细胞冻存液中的浓度为20ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子在神经干细胞冻存液中的浓度为20ng/ml。

在一个具体的实施方案中，其中白蛋白的溶液中的蛋白质的质量体积百分比浓度为20％。

在一个具体的实施方案中，其中白蛋白为人血白蛋白，表皮生长因子为人表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子为人碱性成纤维细胞生长因子。

在一个具体的实施方案中，其中所述血清为胎牛血清。

在一个具体的实施方案中，其中所述的细胞培养基为dmem/f12基础培养基。

在另一方面，本发明提供了使用如上所述的神经干细胞冻存液的方法，其包括：

收集神经干细胞的神经球；

木瓜蛋白酶消化神经干细胞，形成单细胞的神经干细胞悬液；

过滤神经干细胞，计数，离心收集神经干细胞；

按冻存神经干细胞所需的浓度1.5-2.5×10⁷个细胞/ml冻存液，加入预冷的上述的神经干细胞冻存液；

充分混匀后，转移至冻存管，冻存。

在具体的实施方案中，所述的神经干冻存液的使用方法是，低速离心收集神经球，细胞球大小约为200μm至400μm时进行冻存收集，去上清，保留细胞球沉淀；加入木瓜蛋白酶消化液，轻轻吹散神经干细胞沉淀，37℃水浴摇床孵育5分钟；轻轻吹打神经干细胞悬液，显微镜镜下观察细胞球状态，如未消化完全，继续37℃水浴摇床孵育5分钟；加入10mldmem/f12基础培养基，轻轻吹打神经干细胞悬液至形成单细胞，bd45μm滤膜过滤神经干细胞；计数，高速离心收集神经干细胞。按冻存细胞所需的浓度2×10⁷个细胞/ml冻存液，定量加入预冷的神经干细胞冻存液，充分混匀后，将细胞悬液转移至冻存管内，每管1ml，封口，粘贴标签，冻存扫码后，放入程序降温盒内；分级冷冻细胞：4℃，20min；-20℃，30min；-80℃，过夜；次日转入液氮内长期保存。

本发明提供的冻存方法在收集细胞时采用低速离心，收集细胞球，丢弃漂浮的单细胞或者死细胞；消化酶采用木瓜蛋白酶，此酶是一种含巯基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨，能够很好的保持细胞完整性。另外，消化后的单细胞中会存在一些死细胞团活细胞片，必须经滤膜过滤后才能计数、冻存，以保证冻存前的细胞活率。

本发明的主要优势在于本发明提供的冻存液中添加人血白蛋白作为细胞冻存稳定剂使用，有利于调节细胞复苏时调节渗透压，保护细胞的作用，可进一步提高冻存细胞的存储稳定性；另外，在冻存液中添加添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等神经干生长所必须的因子，可以维持冻存微环境，提供必要的营养物质，可以保证神经干细胞复苏后活力高达95％以上，大幅度提高复苏后的扩增能力，更不会出现丢失分化潜能的现象。

附图说明

图1a至图1c：测试例1中检测神经干细胞的表型的实验结果，流式细胞术检测巢蛋白(nestin)、sox2、pax6的表面标志的表达。

图2：测试例3中神经干细胞的细胞周期中s期比例检测的实验结果。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。

以下实施例中所采用的实验材料：

dmem/f12基础培养基：购自gibco，货号：11330-032；

二甲基亚砜(dmso)：购自：sigma，货号：d5879；

胎牛血清：购自：hyclone，货号：sh30070.03；

人血白蛋白：购自：广东双林生物制药有限公司，批准文号：国药准字s10970069，蛋白质的质量体积百分比浓度20％(每瓶含蛋白质10g，每瓶50ml)；

添加剂：购自gibco，货号：17504-044；

人表皮生长因子(无动物成分)：购自peprotech，货号：96-af-100-15-500；

人碱性成纤维细胞生长因子(无动物成分)：购自peprotech，货号：96-af-100-18b-100。

各实施例选用的细胞及细胞来源：从脑组织中提取、诱导多能干细胞(ipsc)诱导得到神经干细胞，或市售的神经干细胞系。

实施例1：

在本实施例中的冻存液由dmem/f12基础培养基、二甲基亚砜(dmso)、胎牛血清、人血白蛋白、添加剂、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子混合配制，其中：dmem/f12基础培养基的添加量占冻存液的体积百分比为50％；dmso的添加量占冻存液的体积百分比为10％；胎牛血清的添加量占冻存液的体积百分比为20％；人血白蛋白溶液的添加量占冻存液的体积百分比为18％；添加剂溶液的添加量占冻存液的体积百分比为2％；在冻存液中含有浓度为20ng/ml的表皮生长因子；在冻存液中含有浓度为20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的体积可忽略不计，或与dmem/f12基础培养基共同占冻存液的体积百分比的50％)。

细胞冻存：

1.从脑组织中分离单个神经干细胞，进行细胞培养；

2.培养至第五代细胞球时收集低速离心(400rpm/min，5min)收集神经球，加入木瓜蛋白酶(solarbio，g8430)进行消化至单细胞；

3.45μm滤膜(购自bd)过滤神经干细胞；计数，高速离心(2500rpm/min，5min)收集神经干细胞；

4.按2×10⁷个细胞/ml冻存液进行冻存，1ml/管；

5.标记名称后，4℃，20min；-20℃，30min；-80℃，过夜；次日转入液氮内长期保存；

6.冻存3个月、6个月、12个月后进行复苏，计算细胞数量及活率。

细胞复苏：

1.无菌工作台内，15ml离心管内加入10mldmem/f12培养基；

2.从液氮中迅速取出预复苏的神经干细胞，置于37℃水浴锅内，不断摇晃，让细胞与管壁脱离时(约30秒)，迅速取出；

3.打开冻存管，巴氏吸管吸取细胞悬液置dmem/f12培养基中；

4.轻轻吹打细胞悬液，高速离心(2500rpm/min，5min)后，弃上清，dmem/f12培养基重悬细胞，计算数量及活率。

实施例2：

在本实施例中的冻存液由dmem/f12基础培养基、dmso、胎牛血清、人血白蛋白、添加剂、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子混合配制，其中：dmem/f12基础培养基的添加量占冻存液的体积百分比为50％；dmso的添加量占冻存液的体积百分比为10％；胎牛血清的添加量占冻存液的体积百分比为18％；人血白蛋白的添加量占冻存液的体积百分比为20％；添加剂的添加量占冻存液的体积百分比为2％；在冻存液中含有浓度为20ng/ml的表皮生长因子；在冻存液中含有浓度为20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。

选用的细胞与实施例1相同，细胞冻存、冻存时间及复苏过程如实施例1所述。

实施例3：

在本实施例中的冻存液由dmem/f12基础培养基、dmso、胎牛血清、人血白蛋白、添加剂、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子混合配制，其中：dmem/f12基础培养基的添加量占冻存液的体积百分比为60％；dmso的添加量占冻存液的体积百分比为10％；胎牛血清的添加量占冻存液的体积百分比为15％；人血白蛋白的添加量占冻存液的体积百分比为13％；添加剂的添加量占冻存液的体积百分比为2％；在冻存液中含有浓度为20ng/ml的表皮生长因子；在冻存液中含有浓度为20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。

选用的细胞与实施例1相同，细胞冻存、冻存时间及复苏过程如实施例1所述。

实施例4：

在本实施例中的冻存液由dmem/f12基础培养基、dmso、胎牛血清、人血白蛋白、添加剂、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子混合配制，其中：dmem/f12基础培养基的添加量占冻存液的体积百分比为50％；dmso的添加量占冻存液的体积百分比为10％；人血白蛋白的添加量占冻存液的体积百分比为38％；添加剂的添加量占冻存液的体积百分比为2％；在冻存液中含有浓度为20ng/ml的表皮生长因子；在冻存液中含有浓度为20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。

选用的细胞与实施例1相同，细胞冻存、冻存时间及复苏过程如实施例1所述。

对比例：

采用常规细胞冻存液的配置方法，冻存液由dmem/f12基础培养基、dmso、胎牛血清混合配制，其中：dmem/f12基础培养基的添加量占冻存液的体积百分比为60％；dmso的添加量占冻存液的体积百分比为10％；胎牛血清的添加量占冻存液的体积百分比为30％。

选用的细胞与实施例1相同，细胞冻存、冻存时间及复苏过程如实施例1所述。

测试例1：复苏后细胞活率

活率检测：采用台盼蓝染色法进行活率鉴定。

1.制备单细胞悬液，进行细胞稀释(10⁶/ml)；

2.染色：细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以1:1均匀混合；

3.计数：三分钟内用计数板计数活细胞数和死细胞数；

4.统计：细胞活率(％)＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100。

具体结果参见下表1：

表1：

测试例2：神经干细胞的表型鉴定

选取的实施例1中冻存12个月细胞，复苏后一周流式细胞仪对神经干细胞的表型鉴定：神经球复苏培养一周后，再次成球，酶消化成单细胞后进行神经干表型检测。检测指标：巢蛋白、sox2、pax6。

实验过程：

1、收集细胞悬液，分装5管(1×10⁶/管)；

2、3000rpm/min离心5min，后加入固定液a(fix&permgas-3)混匀，室温放置30min；

4、3000rpm/min离心5min，去上清，后加入破膜剂b(fix&permgas-3)混匀，同时加入抗体1管为空白管，2管为巢蛋白(bd，561230)测试管，3管为sox2(bd，562195)测试管，4管为pax6对照管，5管为pax6(bd，561664)测试管室温避光放置30min；

5、第4管、第5管3000rpm/min离心5min，去上清，加入300μlpbs和二抗(abcam，ab96895)，室温避光放置30min；

6、加入pbs清洗一次，3500rpm/min离心5min，去上清，加入300μlpbs混匀；

7、上机检测，结果参见图1a至图1c。

结果显示：复苏后的细胞三种指标均高表达，表达率近乎100％，其中巢蛋白阳性细胞占98.4％、sox2阳性细胞占97.1％、pax6阳性细胞占99.2％。

可见，本发明提供的冻存液有益于神经干细胞的长期稳定保存。

测试例3：神经干细胞的细胞周期s期比例检测

细胞周期(cellcycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。其中s期是细胞周期的关键时刻，dna经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。s期值越大，细胞分裂越活跃，增殖能力越强。选取的实例1中冻存12个月的细胞，复苏后一周，采用流式细胞仪对神经干细胞的细胞周期s期比例检测：

神经球复苏培养一周后，再次成球，酶消化法成单细胞后，70％乙醇固定，4℃放置1小时，加入rnaasea(beyotime，st579)，37℃孵育1小时降解rna。加入pi标记dna。流式细胞技术检测细胞周期，参见图2结果显示g1比例为56.59％，s期比例为33.07％，g2比例为10.4％细胞分裂活跃，增殖能力强。此种冻存方法益于神经干细胞的复苏后再培养，保持着原有增殖能力及活力。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导作出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。