本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液及其应用。
背景技术：
细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。
冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、dmso、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，一般是写大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。
现在常用的细胞冻存方案是使用dmso为冻存保护剂，同时加入牛血清，这样的方案可以用于科研产品的保存，但是存在细胞毒性、成分不确定、可能引入细菌和病毒等污染源的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种细胞冻存液及其应用。该细胞冻存液减少了环境对细胞的影响，提高了细胞的存活率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了细胞冻存液，包括甘油、丙二醇、海藻糖、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖或缓冲液中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，细胞冻存液包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，缓冲液包括pbs缓冲液或细胞基础培养基；所述细胞培养基包括rpmi1640、dmem、dmem/f12、a-mem或l-15。
具体的，pbs：1l配方ph7.4：磷酸二氢钾(kh2po4)：0.27g；
磷酸氢二钠(na2hpo4)：1.42g；
氯化钠(nacl)：8g；
氯化钾(kcl)0.2g；
加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容到1l。
在本发明的一些具体实施方案中，细胞冻存液包括如下组分：
本发明还提供了所述的细胞冻存液在细胞冻存中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，细胞在所述细胞冻存液中的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冻存为：当温度不低于-25℃时，降温速率为-1～-2℃/min；当温度低于-25℃时，降温速率为-5℃～-10℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
本发明还提供了所述的细胞冻存液的使用方法，取细胞与所述的细胞冻存液混合后冻存，细胞在所述细胞冻存液中的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液的使用方法中所述冻存为：当温度不低于-25℃时，降温速率为-1～-2℃/min；当温度低于-25℃时，降温速率为-5℃～-10℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
本发明还提供了一种细胞的冻存方法，取细胞与所述的细胞冻存液混合后冻存，细胞在所述细胞冻存液中的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
在本发明的一些具体实施方案中，细胞的冻存方法中所述冻存为：当温度不低于-25℃时，降温速率为-1～-2℃/min；当温度低于-25℃时，降温速率为-5℃～-10℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
本发明提供了一种细胞冻存液，将甘油、丙二醇、海藻糖、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖等溶解于pbs缓存溶液中而配制成的。其中，渗透性的保护液有甘油、丙二醇；非渗透性的保护液有海藻糖、蔗糖和人白蛋白。同时使用葡萄糖为细胞提供能量，使用pbs缓冲液维持细胞冻存液的ph的稳定性。成分固定，批次间差异小，不引入细菌和病毒等污染源；同时使用渗透性的和非渗透性的保护液，提供细胞抗冻的能力，提高细胞的存活率；再者加入了葡萄糖为细胞提供能量，进一步提高细胞的存活率；最后使用pbs缓冲液维持细胞冻存液的ph稳定，减少了环境对细胞的影响，提高了细胞的存活率。
具体实施方式
本发明公开了一种细胞冻存液及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的细胞冻存液及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.细胞冻存液包括如下组分：
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞复苏：
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例2
1.细胞冻存液包括如下组分：
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：标准的冻存程序为降温速率-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞复苏：
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例3
1.细胞冻存液包括如下组分：
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：标准的冻存程序为降温速率-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-8℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞复苏：
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例4
台盼蓝染色计数的操作步骤：
1、4％台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用pbs稀释至0.4％。
2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。
3、染色：细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀。
4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
6、统计细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。
分别使用本发明实施例1～3提供的冻存液、zenoaq公司的stem-cellbanker-dmsofree和实验室常用的冻存液(配方是dmem/f12+10％dmso+10％胎牛血清)冻存人脐带间充质干细胞(msc)，同样以实施例1～3的方法复苏后，使用台盘蓝染色计算细胞的存活率，结果如表1所示：
表1
注：*示与对照组相比具有显著差异(p＜0.05)；#示与对照组相比具有极显著差异(p＜0.01)。
结果分析：本发明实施例1～3提供的冻存液在细胞存活率上与商用的zenoaq公司stem-
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。