一种桃花药愈伤组织的诱导和继代保存方法与流程

本发明属于组织培养
技术领域：
，具体涉及一种桃花药愈伤组织的诱导和继代保存方法。
背景技术：
桃是我国重要的果树树种之一，在我国果品经济中占有重要地位。桃的品种改良是影响其产业发展的关键环节，而生物技术手段将成为桃品种改良的重要途径。桃愈伤组织的获得是开展生物技术研究的重要基础，研究者可以通过诱导愈伤组织，进一步实现体细胞胚发育和植株再生。此外，植物愈伤组织不涉及复杂的发育过程，并且便于遗传和生化操控；因此，在开展代谢调控研究方面表现出明显的优势，其中在色素代谢研究方面体现出了重要价值，如花青苷代谢相关研究。因此，获得性状优良的桃愈伤组织(离体细胞系)，可以为后期的植株再生和遗传转化，以及利用愈伤组织开展代谢相关的基础研究奠定材料基础。前人获得桃愈伤组织主要来源于叶片和胚培养途径，得到的细胞系易褐化，性状不稳定，不易于遗传操作，并且少有花青苷积累。至今，尚未有利用桃花药培养获得愈伤组织的研究报道。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种桃花药愈伤组织的诱导方法。本发明提供的桃花药愈伤组织的诱导方法包括如下步骤：将桃花药在含有诱导培养基的三角瓶中进行诱导培养，得到桃花药愈伤组织；所述诱导培养基包括玉米素(zt)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)和吲哚-3-乙酸(iaa)。上述方法中，所述zt在所述诱导培养基中的浓度可为0.8-1.2mg/l；优选为1.0mg/l。所述2,4-d在所述诱导培养基中的浓度为0.8-1.2mg/l；优选为1.0mg/l。所述iaa在所述诱导培养基中的浓度为0.3-0.7mg/l；优选为0.5mg/l。上述方法中，所述诱导培养的条件如下：25℃、黑暗条件下培养2-3月。上述方法还包括继代保存所述桃花药愈伤组织的步骤；所述继代保存的方法包括如下步骤：将所述桃花药愈伤组织在继代培养基中在光照条件下进行继代培养；所述继代培养基包括6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、吲哚丁酸(iba)和赤霉素(ga3)。进一步的，所述6-ba在所述继代培养基中的浓度可为0.8-1.2mg/l；优选为1.0mg/l。所述iba在所述继代培养基中的浓度可为0.1-0.3mg/l；优选为0.2mg/l。所述ga3在所述继代培养基中的浓度可为0.05-0.2mg/l；优选为0.1mg/l。上述方法中，所述继代培养前还包括将所述桃花药愈伤组织在所述诱导培养基中在光照条件下进行培养的步骤；在所述诱导培养基中在光照条件下进行培养的条件如下：25℃，光照强度：40-50μmolm-2s-1培养20-40天。上述方法中，所述继代培养还包括每30-40天转接新的继代培养基中进行继代培养的步骤。上述方法中，所述诱导培养基是将ms基础培养基、玉米素(zt)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、吲哚-3-乙酸(iaa)和蔗糖混匀得到的培养基。所述继代培养基是将ms基础培养基、6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、吲哚丁酸(iba)、赤霉素(ga3)和蔗糖混匀得到的培养基。进一步的，所述蔗糖在所述诱导培养基和所述继代培养基中的浓度均为30g/l。本发明的另一个目的是提供一种桃花药愈伤组织的继代保存方法。本发明提供的桃花药愈伤组织的继代保存方法是将桃花药愈伤组织在上述继代培养基中进行培养。所述培养还包括每30-40天转接新的继代培养基中进行继代培养的步骤。上述诱导培养基和上述继代培养基也属于本发明的保护范围。本发明又有一个目的是提供上述诱导培养基或继代培养基的新用途。本发明提供了上述诱导培养基在诱导桃花药愈伤组织中的应用。本发明还提供了上述继代培养基在桃花药愈伤组织继代保存中的应用。本发明还有一个目的是提供一种用于桃花药愈伤组织的诱导和/或继代保存的产品。本发明提供的用于桃花药愈伤组织的诱导和/或继代保存的产品包括上述诱导培养基和/或上述继代培养基。本发明的最后一个目的是提供上述产品的新用途。本发明提供了上述产品在桃花药愈伤组织的诱导和继代保存中的应用。本发明提供了一种桃花药愈伤组织的诱导和继代保存方法。所述方法包括如下步骤：将桃花药在含有诱导培养基的三角瓶中在黑暗条件下进行诱导培养2-3个月，得到桃花药愈伤组织；将所述桃花药愈伤组织在诱导培养基中在光照条件下进行培养30天，然后再转接入继代培养基中在光照条件下进行继代培养；所述继代培养基包括6-ba、iba和ga3。本发明的方法可获得具有一定花青苷积累并且可以长期保存的优良愈伤组织，该愈伤组织是开展花青苷，特别是桃花青苷相关研究的重要基础。附图说明图1为桃花蕾样品，花药诱导与愈伤形成(桃品种：雪雨露)。a为萼片前端处在花蕾中部区的花蕾；b为在培养皿中花药诱导与愈伤形成情况(诱导培养约60-70天时的图片)；c为在三角瓶中花药诱导与愈伤形成情况(诱导培养约60-70天时的图片)。图2为桃花药诱导而来的愈伤组织在不同继代培养基中的继代培养效果。a-h分别为桃花药诱导而来的愈伤组织在培养基1、培养基2、培养基3、培养基4、培养基5、培养基7、培养基8和培养基9中的继代培养效果。图3为不同品种的愈伤组织在光照条件下呈现差异的颜色特征。a-c分别为雨花露、久保和燕红愈伤组织从花药诱导培养基中转接入继代培养基(培养基6)中继代一周后的状态；d-f分别为雨花露、久保和燕红愈伤组织从花药诱导培养基中转接入继代培养基(培养基6)中继代25天后的状态。图4为雨花露和久保愈伤组织中的花青苷组分分析。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的桃品种：燕红、雨花露、久保、瑞蟠14、早熟有明和雪雨露均记载于文献：中国桃遗传资源，王力荣等编著，中国农业出版社中，采自保定市顺平县桃树栽培基地和河北农业大学实验基地。下述实施例中的zt(玉米素，化学名称：6-反式-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基氨基嘌呤)、2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)、iaa(吲哚-3-乙酸)、6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)、iba(吲哚丁酸)、tdz(n-苯基-n-1,2,3-噻二唑-5-脲)、naa(萘乙酸)、ga3(赤霉素)和vc(抗坏血酸)均是sigma公司的产品。下述实施例中的ms基础培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如表1所示。表1、ms基础培养基的配方实施例1、一种桃花药愈伤组织的诱导和继代保存方法一、实验材料本发明选取燕红、雨花露、久保、瑞蟠14、早熟有明和雪雨露6个桃品种作为实验材料。二、实验方法1、待诱导花药的获得(1)花蕾的采集于桃树处于花蕾期时，采集不同桃品种中萼片前端处在花蕾中部区的花蕾，然后将采集的花蕾放于自封袋中(避免水分丢失)，于4℃，黑暗条件下存放5-7天。(2)花蕾的灭菌先用体积分数为1％的盐酸溶液浸泡步骤(1)采集的花蕾，浸泡30秒后倒掉盐酸；然后再加入含有效氯3％的次氯酸钠溶液浸泡花蕾，浸泡6-8分钟后倒掉次氯酸钠溶液；最后用无菌水冲洗4-5次，得到灭菌后花蕾。(3)花药的剥取在超净台中将步骤(2)获得的灭菌后花蕾转移至无菌培养皿中，培养皿内铺有无菌滤纸；利用手术刀和镊子剥去花瓣，取出所需花药，切除花丝，得到待诱导花药。2、桃花药愈伤组织的诱导将步骤1获得的待诱导花药转入诱导培养基中进行诱导培养，根据诱导培养的器皿不同分为如下两组：三角瓶组：将步骤1获得的待诱导花药转入含有诱导培养基的三角瓶(三角瓶规格为100ml)中，每个三角瓶转接约30-40个花药，用无菌透气封口膜封口；然后将转接完成的三角瓶放入25℃培养箱中黑暗条件下培养2-3月。培养皿组：将步骤1获得的待诱导花药转入含有诱导培养基的培养皿(培养皿规格为90mm)中，每个培养皿转接约60-70个花药，用无菌透气封口膜封口；然后将转接完成的培养皿放入25℃培养箱中黑暗条件下培养2-3月。上述诱导培养基是将ms基础培养基、玉米素(zt)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、吲哚-3-乙酸(iaa)和蔗糖混匀得到的培养基，其中，zt、2,4-d、iaa和蔗糖在诱导培养基中的浓度分别为1.0mg/l、1.0mg/l、0.5mg/l和30g/l。3、愈伤组织的转接待花药上长出一定愈伤组织，将愈伤组织继代入新的含有诱导培养基的三角瓶中，然后转入25℃，光照条件下(光照强度：40-50μmolm-2s-1)培养30天。4、愈伤组织的继代培养30天后将步骤3中的新鲜愈伤组织转入含有不同继代培养基的三角瓶中，在25℃，光照条件下(光照强度：40-50μmolm-2s-1)进行继代培养；此后，每30天挑取新鲜愈伤组织转入新的继代培养基中在光照条件下继代培养。各继代培养基的配方如表2所示。表2、不同继代培养基的配方培养基编号配方1ms基础培养基+1.0mg/lzt+1.0mg/l2,4-d+0.5mg/liaa+30g/l蔗糖2ms基础培养基+0.6mg/ltdz+0.4mg/l2,4-d+30g/l蔗糖3ms基础培养基+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖4ms基础培养基+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+5.0mg/lvc+30g/l蔗糖5ms基础培养基+10.0mg/l6-ba+30g/l蔗糖6ms基础培养基+1.0mg/l6-ba+0.2mg/liba+0.1mg/lga3+30g/l蔗糖7ms基础培养基+1.0mg/l2,4-d+0.1mg/l6-ba+30g/l蔗糖8ms基础培养基+0.2mg/l2,4-d+0.2mg/l6-ba+30g/l蔗糖9ms基础培养基+0.2mg/l2,4-d+5.0mg/l6-ba+30g/l蔗糖三、实验结果1、桃花药在培养皿和三角瓶中诱导培养的诱导率比较诱导培养约2个月时发现部分花药上形成愈伤组织。于诱导培养2个月后统计了瑞蟠14、雪雨露和早熟有明的花药诱导率。花药诱导率＝(可形成愈伤的花药数量/诱导培养的花药总量)×100％。结果表明：在培养皿中，雪雨露的花药诱导率最高，达到16.77％，瑞蟠14同早熟有明类似，小于7％；在三角瓶中，瑞蟠14和雪雨露的诱导率均明显高于培养皿，其中雪雨露可达25％(图1；表3)。通过比较瑞蟠14和雪雨露分别在培养皿和三角瓶中的诱导率差异，发现三角瓶的更利于桃花药愈伤组织的诱导。表3、花药诱导率比较2、桃花药愈伤组织在不同继代培养基中的继代培养效果将桃花药诱导而来的愈伤组织分别在不同继代培养基中进行继代培养发现：在培养基1-5或7-9中继代培养，愈伤组织或者块状化，或者褐化严重等(图2)，严重影响了愈伤组织的研究利用。如在培养基1中的愈伤组织呈硬块状，生长速度慢，并且愈伤形成后15-20天时出现褐化。而在培养基6中继代培养，愈伤组织生长稳定，状态良好，每30-40天挑取新鲜愈伤组织转入新的继代培养基中在光照条件下继代培养，培养五年后愈伤组织依然生长稳定，状态良好，且具有一定花青苷积累(图3)。说明桃花药诱导而来的愈伤组织在培养基6中继代培养可实现长期继代保存，可将其作为桃花药愈伤组织继代培养的继代培养基。3、桃花药愈伤组织中的花青苷检测来自不同桃品种花药诱导而来的愈伤组织在光照条件下通常具有花青苷的积累。花青苷是植物维系生存至关重要的次生代谢类色素，也是人类健康所需的重要活性物质。花青苷积累同样是桃果实品质性状的重要指标。因此，深入研究这类色素在植物中的积累规律，揭示其分子基础，对实现花青苷的有效利用具有重要意义。利用高效液相色谱检测雨花露和久保两个品种的花药诱导而来的愈伤组织中的花青苷组分。具体步骤如下：(1)将愈伤样品在液氮条件下研磨成粉状，称量0.5g样品放入2ml离心管中，每份样品设置3-4个重复。(2)每管加入1ml甲醇提取液(内含0.1％盐酸)，将提取样品放于冰盒中，在黑暗条件下于100转/分钟的摇床上提取2个小时。(3)将提取样品于4度，10000rcf/分钟离心5分钟，取上清液于新的2ml离心管中。(4)将上清液于氮气下吹干，用200μl甲醇提取液(内含0.1％盐酸)重新溶解作为液相色谱上样溶液。(5)高效液相色谱检测花青苷。具体参数条件如下：高效液相系统：安捷伦1100/1200，二极管阵列检测器；色谱柱：反相c18柱(250×4.6mm)；流动相：a相---乙腈(含0.1％甲酸)；b相---乙腈：水：甲酸(5：92：3)；流速：1ml/min；柱温：45摄氏度；检测波长：520nm；梯度洗脱条件如表24所示。表4、梯度洗脱条件时间(min)溶剂a(％)溶剂b(％)流速(ml)0.000.0100.01.00017.0017.083.01.00020.0020.080.01.00026.0030.070.01.00028.5050.050.01.00032.0095.05.01.00036.0095.05.01.00042.000.0100.01.000结果表明：雨花露和久保两个品种的花药诱导而来的愈伤组织中的花青苷均为矢车菊-3-葡萄糖苷，同桃果实相同(图4)。当前第1页12