一种培养结球甘蓝种荚高效获得再生植株的方法与流程

本发明涉及一种培养结球甘蓝种荚高效获得再生植株的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

植物组织培养再生技术体系的建立对于一些具有重要价值的植物育种材料的保存与繁殖,发挥着无可取代的作用。国内外对甘蓝外植体的组织培养的研究，以无菌苗的子叶和下胚轴作为外植体为最多。但该种方法对于雄性不育系、自交不亲和系，以及自交接籽困难材料的保存和扩繁不适合。以生殖生长期种株的腋芽为外植体进行组织培养，是较为高效和简单的无性繁殖方法；但又因多数品种不发生腋芽或腋芽较少而存在困难。每个健壮的结球甘蓝种株花蕾数量，因品种和栽培管理条件而异，一般有800～2000个，材料丰富易得。本发明以蕾期授粉后的种荚为外植体，建立了一种更为简便、高效、通用的离体再生技术体系，为雄性不育系、自交不亲和系，以及接籽困难结球甘蓝材料的无性繁殖保存和扩繁提供了更适用的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种培养结球甘蓝种荚高效获得再生植株的方法，旨在通过不同取材时间、不同光照处理、以及不定芽和继代增殖培养基的激素配比对再生技术体系进行调整、改良，提出了一套系统的高效创新体系。

1.一种培养结球甘蓝种荚高效获得再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)外植体选择

结球甘蓝种株开花前1～2d进行剥蕾授粉，取授粉后8～9d的种荚作为外植体；用体积分数75％的乙醇对外植体进行灭菌1～2min，然后用体积分数7～8％的次氯酸钠消毒15～20min，最后用无菌水冲洗3～4次。

2)分化诱导

灭菌后把外植体接种到诱导培养基上，置于温度为25±0.5℃，每天光照时间为14h的培养室中培养，15～20d可直接诱导出不定芽；

所述诱导培养基为ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8；

所述光照为：红光灯与白光灯的数量比为1:3；

3)继代增殖

将诱导产生的单芽或丛生芽(丛生芽切割成单芽)转接到继代增殖培养基上，25～30d进行转接一次，经过3～4次的继代，芽的倍数达220倍左右的增殖；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14h/d，培养温度为25±0.5℃；

所述继代增殖培养基为ms+0.1mg/lnaa+0.8mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8；

4)生根诱导

幼芽生长至3～4cm高时，将其转接到生根培养基上，15～20d可诱导生根，获得生根苗；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14h/d，培养温度为25±0.5℃；

所述生根培养基为ms+0.1mg/lnaa+0.1mg/liba+7～8g/l琼脂+20～25g蔗糖,ph5.8；

5)移栽与定植

生根苗在正常室温下炼苗24h后，移植到50孔的穴盘中生长，基质为十字花科蔬菜育苗基质；待幼苗长到6～8片真叶定植到大田。

有益效果：

(1)所用外植体数量丰富。所用外植体为蕾期授粉后的种荚，每个健壮的结球甘蓝种株花蕾一般有800～2000个。因此，外植体容易获得；

(2)不定芽形成早。通过不同取材时间、培养基配方、光照处理等培养条件的优化，本发明最早15d左右可直接诱导出不定芽。在结球甘蓝离体再生体系中，一般不定芽的诱导需40～50d(郑子松等，一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，cn103125398a；张恩慧等，一种保持甘蓝rgms雄性不育系的繁殖方法，cn101564009a)。

(3)本发明的再生频率约90％，直接诱导出的丛生芽所含单芽约为7个，再生频率和分化频率均较高，是一种高效、便捷的离体再生技术方法。

附图说明

图1形成不定芽初期。

图2形成不定芽后期。

图3再生苗。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例是这样实现的，一种培养结球甘蓝种荚高效获得再生植株的方法包括以下步骤：

1)外植体选择

结球甘蓝种株开花前1～2d进行剥蕾授粉，取授粉后8～9d的种荚作为外植体；用体积分数75％的乙醇对外植体进行灭菌1～2min，再用体积分数7～8％的次氯酸钠消毒15～20min，最后用无菌水冲洗3～4次。

在本发明实施例中，外植体取样处理分别为：取授粉后5d、7d、8d、9d、10d、12d的种荚进行培养。结果表明，授粉后5d、7d的种荚进行培养时再生率低，授粉后10d、12d再生率与授粉后8d、9d的再生率差异不大，但授粉后10d、12d的不定芽诱导率低，筛选出授粉后8～9d的种荚作为外植体。

2)分化诱导

把外植体接种到ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8的培养基上，培养室温度为25±0.5℃，光照为白光：红光＝3:1，每天光照时间为14h，4～5d种荚基本开始膨大，7～10d开始长出不定芽，15～20d可直接诱导出不定芽；

在本发明实施例中，其中：

a、分化诱导培养基是在ms固体培养基的基础上通过添加不同浓度的6-ba和naa，如下处理：①6-ba浓度分别为1.0mg/l，2.0mg/l，3.0mg/l；②naa的浓度分别为0.1mg/l，0.2mg/l，0.3mg/l；

表1naa和6-ba试验处理

b、在本发明实施例中，光照处理采取了b1(白光)和b2(白光：红光＝3:1)2个处理；

对以上a(激素处理)和b(光照处理)分别进行了单因素和多因素试验，试验结果表明，激素组合浓度较高形成愈伤较多，但直接形成的不定芽低；而a1处理下再生率与激素浓度较高相比无显著差异，但其可直接形成不定芽，且不定芽诱导率最高。在b2(白光：红光＝3:1)下，不定芽形成早；综合试验数据效果，分化诱导的最佳培养条件是a1+b2的组合，即：ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba，白光：红光＝3:1，再生频率平均90％，直接诱导出的丛生芽所含单芽平均为7个。

3)继代增殖

将诱导产生的丛生芽切割成单芽转接到ms+0.1mg/lnaa+0.8mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8的培养基上，25～30d进行转接一次，经过3～4次的继代，芽的倍数达220倍左右的增殖；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14h/d，培养温度为25±0.5℃；

在本发明实施例中，根据以上分化诱导中最适激素配比的浓度，我们对继代增殖培养基的6-ba浓度做了降低处理。继代增殖培养基是在ms固体培养基的基础上通过添加不同浓度的6-ba和naa，如下处理：①6-ba浓度分别为0.6mg/l，0.8mg/l，1.0mg/l；②naa的浓度分别为0.1mg/l，0.2mg/l；

表2naa和6-ba试验处理

试验结果表明，在c2处理下，不定芽的再生增殖系数平均为4.0，且芽生长健壮，没有根生成；其余增殖系数偏低，或不定芽生长缓慢；筛选出最适培养基为c2组合，即：ms+0.1mg/lnaa+0.8mg/l6-ba

4)生根诱导

幼芽生长至3～4cm高时，将其转接到ms+0.1mg/lnaa+0.1mg/liba+7～8g/l琼脂+20～25g蔗糖，ph5.8的培养基上，15～20d可诱导生根，获得生根苗(如图3)；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14h/d，培养温度为25±0.5℃；

5)移栽与定植

生根苗在正常室温下炼苗24h后，移植到50孔的穴盘中生长，基质为十字花科蔬菜育苗基质；待幼苗长到6～8片真叶定植到大田。

综上所述，选取结球甘蓝种株开花前1～2d进行剥蕾授粉，取授粉后8～9d的种荚作为外植体，接种到ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8的不定芽诱导培养基上培养，光照处理为红白组合光(白光：红＝3:1)；叶片边缘形成不定芽后，将不定芽切开，转入ms+0.1mg/lnaa+0.8mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8的增殖培养基上培养；幼芽生长至3～4cm高时，将其转接到ms+0.1mg/lnaa+0.1mg/liba+7～8g/l琼脂+20～25g蔗糖,ph5.8的培养基上诱导生根，获得再生苗。通过本发明的技术体系，不定芽形成早，再生频率约90％，直接诱导出的丛生芽所含单芽约为7个。