一种霍山石斛组培育种方法与流程

本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种霍山石斛组培育种方法。

背景技术

霍山石斛为兰科石斛属多年生草本植物，具有极高的观赏价值和独特的药用价值。其种子繁殖能力极低，生长周期长，对生长条件要求极为苛刻，近些年来在其主产地安徽霍山已极难发现野生个体。

目前，种质资源缺乏限制了霍山石斛的可持续利用，霍山石斛研究主要集中在石斛组培快繁技术，包括以种子离体萌发诱导原球茎，茎尖、茎段分生组织直接诱导成苗以及组培苗驯化移栽等方面，而从茎段诱导类原球茎的研究鲜见报道，霍山石斛育种过程中容易出现性状分离，难以保证霍山石斛种源一致性，且其增殖系数较低，难以满足产业化生产需要。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于现有的霍山石斛育种过程中容易出现性状分离，难以保证霍山石斛种源一致性，且其增殖系数较低，难以满足产业化生产需要。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

一种石斛组培育种方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌：选取霍山石斛带节间茎段，清洗干净后，于无菌条件下去除叶片及膜质叶鞘，进行消毒处理后，采用无菌水进行冲洗，控水后接种；

(2)类原球茎诱导：取步骤(1)中处理后的霍山石斛节间茎段，接种于类原球茎诱导培养基中，进行诱导类原球茎培养；

(3)类原球茎增殖：将步骤(2)中诱导的类原球茎从茎段上分离下来转入增殖培养基中进行增殖培养；

(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中增殖后的类原球茎切块后接入丛生芽诱导培养基中进行培养；

(5)根的诱导：将步骤(4)中的丛生芽接种到生根培养基中进行培养。

优选的，所述步骤(1)中的清洗步骤包括先用自来水冲洗干净，用稀释后的洗洁精浸泡后，采用自来水继续冲洗，用70％酒精浸泡后用无菌水进行冲洗。

优选的，将所述步骤(1)中去除叶片及膜质叶鞘的霍山石斛带节间茎段浸泡于含有吐温80的0.1％hgcl2中，用无菌水冲洗，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后进行接种。

优选的，所述步骤(2)中的类原球茎诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为20-40g/l的蔗糖、1.0-3.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.5-1.0mg/l的萘乙酸、0.6-1.0g/l的活性炭，所述培养基的ph值为5.8。

优选的，所述步骤(2)中的培养温度为25℃，湿度70％-80％，初期在黑暗条件下培养7-10d，然后在光强度为2000-25001x，每天光照12h条件下培养。

优选的，所述步骤(3)中增殖培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为20-40g/l的蔗糖、0.1-0.3mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.1-0.2mg/l的萘乙酸，所述培养基的ph值为5.8。

优选的，所述步骤(4)中的丛生芽诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为10-40g/l的蔗糖、0.4-0.6mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.1-0.5mg/l的萘乙酸、100-200g/l的香蕉泥，所述培养基的ph值为5.8。

优选的，所述步骤(5)中的生根培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为10-20g/l的蔗糖、1.0-2.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.4-0.6mg/l的萘乙酸、80-120g/l的香蕉泥。

优选的，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中的培养温度为25℃，光照强度2000lx、光照时间10h/d。

优选的，所述石斛组培育种方法包括以下步骤：

(1)外植体灭菌：选取霍山石斛带节间茎段，先用在自来水重新干净，用稀释后的洗洁精浸泡10min后，采用自来水继续冲洗，用70％酒精浸泡1min后用无菌水冲洗5次，于超净工作台上去除叶片及膜质叶鞘后，浸泡于含有吐温80的0.1％hgcl2中消毒10min，采用无菌水进行冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后进行接种；

(2)类原球茎诱导：取步骤(1)中处理后的霍山石斛节间茎段，接种于类原球茎诱导培养基中，进行诱导类原球茎培养；所述类原球茎诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为20g/l的蔗糖、1.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.5mg/l的萘乙酸、0.6g/l的活性炭，所述培养基的ph值为5.8；培养温度为25℃，湿度70％，初期在黑暗条件下培养7d，然后在光强度为20001x，每天光照12h条件下培养；

(3)类原球茎增殖：将步骤(2)中诱导的类原球茎从茎段上分离下来转入增殖培养基中进行增殖培养；其中增殖培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为20g/l的蔗糖、0.1mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.1mg/l的萘乙酸，所述培养基的ph值为5.8；培养温度为25℃，光照强度2000lx、光照时间10h/d；图2为类原球茎增殖图片；

(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中增殖后的类原球茎切块后接入丛生芽诱导培养基中进行培养；其中丛生芽诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为10g/l的蔗糖、0.4mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.1mg/l的萘乙酸、100g/l的香蕉泥，所述培养基的ph值为5.8；

(5)根的诱导：选取步骤(4)中生长状况一致的的丛生芽接种到生根培养基中进行培养；其中生根培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为10g/l的蔗糖、1.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/l的萘乙酸、80g/l的香蕉泥。

本发明的有益效果在于：

(1)霍山石斛种子离体萌发诱导原球茎，在育种过程中可能出现性状分离，而采用霍山石斛茎段脱分化形成类原球茎，减少育种过程中发生的性状分离，类原球茎能够保留亲本的优良性状，保证霍山石斛的种源一致性；

(2)茎尖、茎段分生组织直接诱导成苗虽然能够保持亲本的优良性状，但是增殖系数较低，采用霍山石斛类原球茎进行液体或固体培养，保证类原球茎能够快速增殖，霍山石斛类原球茎再分化形成丛生芽，并进一步形成小苗，可以满足大规模产业化生产需要。

附图说明

图1为类原球茎诱导图片；

图2为类原球茎增殖图片；

图3为丛生芽诱导图片；

图4为根的诱导图片。

具体实施方式

为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例对本发明进行详细的说明。

本发明中，所涉及的组分和原料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。

实施例1

一种石斛组培育种方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌：选取霍山石斛带节间茎段，先用在自来水重新干净，用稀释后的洗洁精浸泡10min后，采用自来水继续冲洗，用70％酒精浸泡1min后用无菌水冲洗5次，于超净工作台上去除叶片及膜质叶鞘后，浸泡于含有吐温80的0.1％hgcl2中消毒10min，采用无菌水进行冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后进行接种；

(2)类原球茎诱导：取步骤(1)中处理后的霍山石斛节间茎段，接种于类原球茎诱导培养基中，进行诱导类原球茎培养；所述类原球茎诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为20g/l的蔗糖、1.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.5mg/l的萘乙酸、0.6g/l的活性炭，所述培养基的ph值为5.8；培养温度为25℃，湿度70％，初期在黑暗条件下培养7d，然后在光强度为20001x，每天光照12h条件下培养；图1为类原球茎诱导图片；

(3)类原球茎增殖：将步骤(2)中诱导的类原球茎从茎段上分离下来转入增殖培养基中进行增殖培养；其中增殖培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为20g/l的蔗糖、0.1mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.1mg/l的萘乙酸，所述培养基的ph值为5.8；培养温度为25℃，光照强度2000lx、光照时间10h/d，增殖培养三代后，培养时间为2个月，类原球茎表面轮廓逐渐分明，顶端出现芽点，图2为类原球茎增殖图片；

(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中增殖后的类原球茎切块后接入丛生芽诱导培养基中进行培养；其中丛生芽诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为10g/l的蔗糖、0.4mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.1mg/l的萘乙酸、100g/l的香蕉泥，所述培养基的ph值为5.8；丛生芽诱导培养时间为3个月，图3为丛生芽诱导图片；

(5)根的诱导：选取步骤(4)中高度2-3cm、粗细一直，其比例和母本相似的的丛生芽接种到生根培养基中进行培养；其中生根培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为10g/l的蔗糖、1.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/l的萘乙酸、80g/l的香蕉泥；培养时间为3个月，图4为根的诱导图片。

实施例2

一种石斛组培育种方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌：选取霍山石斛带节间茎段，先用在自来水重新干净，用稀释后的洗洁精浸泡10min后，采用自来水继续冲洗，用70％酒精浸泡1min后用无菌水冲洗5次，于超净工作台上去除叶片及膜质叶鞘后，浸泡于含有吐温80的0.1％hgcl2中消毒10min，采用无菌水进行冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后进行接种；

(2)类原球茎诱导：取步骤(1)中处理后的霍山石斛节间茎段，接种于类原球茎诱导培养基中，进行诱导类原球茎培养；所述类原球茎诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为30g/l的蔗糖、2.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.75mg/l的萘乙酸、0.8g/l的活性炭，所述培养基的ph值为5.8；培养温度为25℃，湿度75％，初期在黑暗条件下培养8d，然后在光强度为22001x，每天光照12h条件下培养，培养时间为1.5个月；

(3)类原球茎增殖：将步骤(2)中诱导的类原球茎从茎段上分离下来转入增殖培养基中进行增殖培养；其中增殖培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为30g/l的蔗糖、0.2mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.15mg/l的萘乙酸，所述培养基的ph值为5.8；培养温度为25℃，光照强度2000lx、光照时间10h/d，培养时间为2.5个月；

(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中增殖后的类原球茎切块后接入丛生芽诱导培养基中进行培养；其中丛生芽诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为30g/l的蔗糖、0.5mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.3mg/l的萘乙酸、150g/l的香蕉泥，所述培养基的ph值为5.8，培养时间为2.5个月；

(5)根的诱导：选取步骤(4)中高度2-3cm、粗细一直，其比例和母本相似的的丛生芽接种的丛生芽接种到生根培养基中进行培养；其中生根培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为15g/l的蔗糖、1.5mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.5mg/l的萘乙酸、100g/l的香蕉泥。

实施例3

一种石斛组培育种方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌：选取霍山石斛带节间茎段，先用在自来水重新干净，用稀释后的洗洁精浸泡10min后，采用自来水继续冲洗，用70％酒精浸泡1min后用无菌水冲洗5次，于超净工作台上去除叶片及膜质叶鞘后，浸泡于含有吐温80的0.1％hgcl2中消毒10min，采用无菌水进行冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后进行接种；

(2)类原球茎诱导：取步骤(1)中处理后的霍山石斛节间茎段，接种于类原球茎诱导培养基中，进行诱导类原球茎培养；所述类原球茎诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为40g/l的蔗糖、3.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、1mg/l的萘乙酸、1g/l的活性炭，所述培养基的ph值为5.8；培养温度为25℃，湿度70％，初期在黑暗条件下培养10d，然后在光强度为20001x，每天光照12h条件下培养，培养时间为3个月；

(3)类原球茎增殖：将步骤(2)中诱导的类原球茎从茎段上分离下来转入增殖培养基中进行增殖培养；其中增殖培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为40g/l的蔗糖、0.3mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.2mg/l的萘乙酸，所述培养基的ph值为5.8；培养温度为25℃，光照强度2000lx、光照时间10h/d，培养时间为3.5个月；

(4)丛生芽诱导：将步骤(3)中增殖后的类原球茎切块后接入丛生芽诱导培养基中进行培养；其中丛生芽诱导培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为40g/l的蔗糖、0.6mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.5mg/l的萘乙酸、200g/l的香蕉泥，所述培养基的ph值为5.8，培养时间为3.5个月；

(5)根的诱导：选取步骤(4)中高度2-3cm、粗细一直，其比例和母本相似的的丛生芽接种的的丛生芽接种到生根培养基中进行培养；其中生根培养基为以ms为基本培养基，添加浓度为20g/l的蔗糖、2.0mg/l的6-苄基腺嘌呤、0.6mg/l的萘乙酸、120g/l的香蕉泥。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。