一种用于显微注射的松材线虫虫体固定技术的制作方法

本发明涉及一种用于显微注射的松材线虫虫体固定技术，具体涉及分子生物学技术领域。

背景技术：

松材线虫bursaphelenchusxylophilus是一种生活在松树体内的寄生性线虫，松树被松材线虫感染之后，最快在两个月内即可发病死亡。松材线虫成虫虫体长约1mm，雌虫尾部近圆锥形，末端圆；雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲。松材线虫借助松墨天牛等媒介昆虫实现在松树之间的传播，并引发松材线虫病的流行。被松材线虫感染的松树针叶呈黄褐色或红褐色，整株干枯死亡。

作为一种重要的病原线虫，松材线虫的基础生物学研究是当前森林病理学研究的前沿和热点。然而，由于缺乏有效的虫体固定技术，国内外尚不能够对松材线虫开展转基因显微注射研究，这极大地制约了一些关键基因的表达特性和功能验证等基础理论研究，也为进一步在分子水平上开展特异性的松材线虫病防控技术研究设置了障碍。

在线虫的虫体固定和转基因显微注射研究方面，国内外研究最多的当属模式线虫秀丽隐杆线虫caenorhabditiselegans。目前，秀丽隐杆线虫的显微注射技术已经广泛应用于基因表达、基因功能验证和基因互作等方面的研究。秀丽隐杆线虫体壁薄，虫体在注射油中的活动能力不强，虫体固定的效率高，操作步骤简易。现有的秀丽隐杆线虫虫体固定方法是：直接用睫毛针从培养基板中挑取一条雌雄同体线虫，在解剖镜下放置于已添加注射油的2％琼脂糖固定垫中，由于虫体密度比注射油大且虫体体表成分可与固定垫相互黏附，故虫体会自然下沉并黏附于固定垫表面，虫体固定步骤操作简单，固定效率高。

在自然条件下，松材线虫生活于松树体内，而秀丽隐杆线虫生活于土壤中，在长期的适应性进化过程中，松材线虫形成了与秀丽隐杆线虫截然不同的体表组织。与秀丽隐杆线虫相比，松材线虫的体壁坚硬厚实，体表角质层成分复杂多样，蛋白含量高，与2％琼脂糖固定垫的粘合度差。另外，与秀丽隐杆线虫相比，松材线虫的活动能力更强，很容易挣脱固定垫的束缚。因此，采用上述秀丽隐杆线虫的显微注射虫体固定技术无法有效实现对松材线虫的固定，固定率≤10％。由于固定效果差，松材线虫在注射的过程中仍然处于活动状态，无法准确注射到正确部位，对虫体造成较大的机械损伤，注射后虫体的存活率≤20％。

技术实现要素：

本发明针对上述瓶颈问题，提出了一种专门用于显微注射的松材线虫虫体固定技术，可以有效地解决松材线虫注射前的虫体固定这一难题，有效提高对松材线虫的虫体固定效果。

具体的技术方案如下：

一种用于显微注射的松材线虫虫体固定技术，采用琼脂糖水溶液制成的固定垫来固定松材线虫虫体。

进一步的，松材线虫虫体固定技术包括以下步骤：

1)虫体选择与清洗：挑选健康活跃的松材线虫成虫，滤除线虫悬液中的菌丝杂质，再用无菌水清洗松材线虫2-3遍，浓缩于1.5ml离心管中备用；该步骤中的浓缩是指将多余的无菌水弃去，然后将剩余的无菌水及松材线虫一起装于1.5ml的离心管中，剩余的无菌水要将松材线虫淹没；

2)角质层软化：用sds-dtt溶液室温黑暗条件下处理松材线虫1h，再用无菌水清洗2-3遍；

3)角质层消解：用pronasee溶液室温处理松材线虫5h，并用无菌水清洗2-3遍，进一步软化并消解角质层，让松材线虫坚硬厚实的外表皮变得粗糙薄弱，有利于更好地固定；

4)固定垫制备：配制浓度为1.5％-5.0％的琼脂糖水溶液，用微波炉加热2min，用移液枪吸取50μl液滴快速滴于盖玻片上，迅速用另一盖玻片盖在液滴上，待琼脂糖凝固稳定后(约1-2min)，将两个盖玻片分开，让琼脂糖垫完整地黏附于其中一个盖玻片，将黏有琼脂糖固定垫的盖玻片置于65℃干燥箱中干燥处理1h，保存于4℃冰箱备用；

5)虫体固定：用睫毛针自水中挑取一条松材线虫成虫，快速放置于制备好的固定垫上，在解剖镜下用睫毛针轻轻下压虫体全身，使虫体表面水膜被固定垫吸收，迅速在虫体全身覆盖上注射油，完成固定。

进一步的，步骤2)中sds-dtt溶液的原液配方由以下组分组成：200mmdtt、2.5％sds、20mmhepes和3％蔗糖。其中，sds(sodiumdodecylsulfate)十二烷基硫酸钠可以有效软化松材线虫的体壁，dtt(dl-dithiothreitol)二硫苏糖醇可以破坏二硫键，两者混合使用可以有效地软化松材线虫坚硬厚实的体表角质层；同时由于缓冲剂hepes和蔗糖的存在，即能软化松材线虫的体表角质层，又能够保持其活力。sds-dtt原液ph为8.0，无菌过滤处理后分装冻藏于-20℃冰箱，sds-dtt溶液的工作浓度为原液的10％。

进一步的，步骤2)-3)中用sds-dtt与pronasee溶液处理的最佳虫体密度是在1ml处理液中放置20μl线虫悬液，处理过程中需要每隔10min颠倒混匀一次，使得虫体与溶液充分接触；

进一步的，步骤3)中pronasee溶液的原液浓度为15mg/ml，无菌过滤分装冻藏于-20℃冰箱，步骤3)中使用的pronasee溶液的工作浓度为原液的10％；

进一步的，步骤4)中琼脂糖水溶液的浓度为2％-4％时，固定效果较为理想；

进一步的，步骤4)中所述琼脂糖水溶液的最佳浓度为3％，固定率≥80％；

进一步的，步骤4)中盖玻片的长度、宽度和厚度分别为50mm、24mm和0.15mm，比较方便操作。

进一步的，步骤4)中固定垫制备过程中不能产生气泡，以免降低对虫体的固定效果，万一操作不当产生气泡，应重新制作；

进一步的，步骤5)中睫毛针包括针头1和针杆2，针头的一端与针杆的一端用针座3固定和连结，针头采用假睫毛材料制成，针头远离针杆的一端呈弧形设置。该种设置的睫毛针操作方便，即有一定的韧性，也有一定的弹性，可以有效下压虫体，并可避免在下压虫体时对虫体造成伤害；

进一步的，步骤5)中从水中挑取的松材线虫成虫体表需要有均匀的水膜覆盖；

进一步的，步骤5)操作过程要快速平稳，要准确把握虫体水膜被固定垫琼脂完全吸收的瞬时关键时间节点，在此瞬间迅速覆盖注射油方可保证虫体表面在一定时间内不会皱缩，虫体既能保持一定的活力，又能被很好地固定。

进一步的，步骤1)-5)中为防止松材线虫活力减退和注射后恢复创伤能力下降，虫体从真菌中分离到固定前处理的时间不可超过36h。

采用本发明所述的操作技术，松材线虫固定率≥80％，注射后松材线虫的存活率≥80％。

附图说明

图1本发明不同浓度琼脂糖固定垫固定松材线虫的成功率；

图2本发明睫毛针示意图。

附图标记：

针头1、针杆2和针座3。

具体实施方式

为使本发明的技术方案更加清晰明确，下面对本发明进行进一步描述，任何对本发明技术方案的技术特征进行等价替换和常规推理得出的方案均落入本发明保护范围。

一种用于显微注射的松材线虫虫体固定技术，采用琼脂糖水溶液制成固定垫来固定松材线虫虫体。

进一步的，松材线虫虫体固定技术包括以下步骤：

1)虫体选择与清洗：挑选健康活跃的松材线虫成虫，滤除线虫悬液中的菌丝杂质，再用无菌水清洗松材线虫2-3遍，浓缩于1.5ml离心管中备用；该步骤中的浓缩是指将多余的无菌水弃去，然后将剩余的无菌水及松材线虫一起装于1.5ml的离心管中，剩余的无菌水要将松材线虫淹没；分离出的松材线虫成虫首先需要检查虫体状态是否健康活跃，确认无误后清洗干净，保证无可见菌丝杂质。

2)角质层软化：用sds-dtt溶液室温黑暗条件下处理松材线虫1h，再用无菌水清洗2-3遍；

3)角质层消解：用pronasee溶液室温处理松材线虫5h，用无菌水清洗2-3遍，放置于无菌水中备用。

软化和消解角质层可以让松材线虫坚硬厚实的外表皮变得粗糙薄弱，有利于更好地固定虫体。用sds-dtt与pronasee溶液最佳处理的虫体密度是在1ml处理液中放置20μl线虫悬液，处理过程中需要每隔10min颠倒混匀一次，使得虫体与溶液充分接触。

4)固定垫制备：配制浓度为3％的琼脂糖水溶液，用微波炉加热1-2min，用移液枪吸取50-80μl液滴快速滴于盖玻片上，迅速用另一盖玻片盖在液滴上，待琼脂糖凝固稳定后，约1-2min，将两个盖玻片分开，让琼脂糖垫完整地黏附于其中一个盖玻片，将黏有琼脂糖固定垫的盖玻片置于65℃干燥箱中干燥处理1h，保存于4℃冰箱备用；

琼脂糖水溶液的浓度为3％，该浓度可以达到固定与注射的最佳平衡，制作过程要严禁气泡的生成，固定垫不可干燥过度，存放4℃不可超过1个月；

5)虫体固定：用睫毛针自水中挑取一条松材线虫成虫，快速放置于制备好的固定垫上，在解剖镜下用睫毛针轻轻下压虫体全身，使其虫体表面水膜被固定垫吸收，迅速在虫体全身覆盖上注射油，完成固定。为防止松材线虫活力减退和注射后恢复创伤能力下降，虫体从真菌中分离出来到固定前处理的时间跨度不可超过36h。

步骤2)中sds-dtt溶液的原液配方由以下组分组成：200mmdtt、2.5％sds、20mmhepes和3％蔗糖，该原液ph为8.0，无菌过滤处理后分装冻藏于-20℃冰箱，sds-dtt溶液的工作浓度为原液的10％。

步骤3)中pronasee溶液的原液浓度为15mg/ml，无菌过滤分装冻藏于-20℃冰箱，步骤3)中使用的pronasee溶液的工作浓度为原液的10％。

步骤4)中盖玻片的长度、宽度和厚度分别为50mm、24mm和0.15mm，即方便操作，又能确保固定垫的制备质量；步骤4)中固定垫制备过程中需要排除气泡的干扰，万一产生气泡，需重新制作固定垫。

步骤5)中睫毛针包括针头1和针杆2，针头的一端与针杆的一端用针座3连结和固定，针头采用假睫毛材料制成，针头远离针杆的一端呈弧形设置。该种设置的睫毛针操作方便，即有一定的韧性，也有一定的弹性，可以有效下压虫体，并且避免在下压虫体时对虫体造成伤害。

步骤5)中从水中挑取的松材线虫成虫体表需要有均匀的水膜覆盖，并在虫体表面水膜被固定垫吸收的瞬间，迅速在虫体全身覆盖上注射油，防止虫体体表皱缩，并阻止其活动，最大效率地实现对虫体的固定。

实施例二

采用与实施例一相同的步骤，配制浓度为1.5％的琼脂糖水溶液制成固定垫来固定松材线虫虫体。

实施例三

采用与实施例一相同的步骤，配制浓度为2％的琼脂糖水溶液制成固定垫来固定松材线虫虫体。

实施例四

采用与实施例一相同的步骤，配制浓度为2.5％的琼脂糖水溶液制成固定垫来固定松材线虫虫体。

实施例五

采用与实施例一相同的步骤，配制浓度为3.5％的琼脂糖水溶液制成固定垫来固定松材线虫虫体。

实施例六

采用与实施例一相同的步骤，配制浓度为4％的琼脂糖水溶液制成固定垫来固定松材线虫虫体。

实施例七

采用与实施例一相同的步骤，配制浓度为4.5％的琼脂糖水溶液制成固定垫来固定松材线虫虫体。

实施例八

采用与实施例一相同的步骤，配制浓度为5％的琼脂糖水溶液制成固定垫来固定松材线虫虫体。

实施例九

本发明通过实施例一到实施例八制成固定垫分别来固定松材线虫虫体，虫体固定成功率从图1可知，琼脂糖水溶液浓度由1.5％逐渐升高时，其成功率也逐渐升高，但并不是浓度越高，固定成功率越高，当琼脂糖水溶液浓度达到3％时，其成功率达到最高，超过80％，当浓度继续增加，其成功率逐渐下降。

实施例十

本发明采用分离自枯死松木的松材线虫，并经实验室纯化家系培养处理。采用秀丽隐杆线虫固定技术共试验松材线虫1320条，成功固定102条，固定成功率为7.73％，注射后存活17条，存活率为16.67％采用本发明提出的专门用于松材线虫虫体固定的方法，共注射松材线虫1543条，成功固定1298条，固定率为84.12％，注射后存活1102条，存活率为84.90％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。