一种血红密孔菌新菌株及其人工栽培方法和用途与流程

本发明涉及一种新菌株及其人工栽培方法和用途，尤其涉及一种一种血红密孔菌新菌株及其人工栽培方法和用途。
背景技术：
：目前，食药用菌的产业发展迅猛，据中国食用菌协会统计，2017年我国食药用菌的产量达到3712万吨，比2016年增长了3.21％，产值为2721.92亿元，我国占全球75％以上，从业人员超过2000万人，食用菌产业在种植业中排在除了粮、菜、果、油之后的第五位，超过了茶叶和蚕桑。在食药用菌产业蓬勃发展的今天，越来越多的珍稀食药用菌品种逐渐进入人们的视野，许多原有的珍稀品种逐渐被驯化，如竹荪、茶薪菇、离褶伞、羊肚菌等。但是也有大批的野生食药用菌由于未能被人类认识，没有得到研究。据研究，目前世界上约有300多万种真菌物种，仅仅有1％的物种被认识，其中已知的大型真菌约14000种，国内已确认的食用菌有1789种，药用菌798种，而当中又只有不到100种的野生食药用菌被人类驯化，规模化栽培的品种更只有30多种。人类距离大型真菌的研究与利用还有相当长的道路要走。随着人们生活水平的逐步上升，对于生活品质的要求更高，而大型真菌由于其富含具有营养及功能作用的各种成分，包括真菌多糖、三萜类、甾醇等，对于人体健康具有非常良好的作用，日益受到人们的重视。血红密孔菌分布广泛，通常在夏、秋两个季节采收，采后烘干。该菌有较高的药用价值，可以止痒、止血、生肌、顺气等，其子实体含有多孔蕈素(polyporin)，多孔蕈素对革兰氏阴、阳性菌有抑制作用，而且该菌还可用于消炎。血红栓菌经济用途广泛，药用价值明显，所以越来越多的人对其进行开发和利用，但至目前为止，未有规模栽培及应用的报道。技术实现要素：针对以上不足，本发明提供一种具有体外抗肿瘤活性及抑菌作用的野生的珍稀药用菌品种血红密孔菌pycnoporussanguineus新菌株及其人工驯化栽培方法和用途。本发明通过以下方案达到上述目的：第一方面，本发明的血红密孔菌新菌株采自福建武夷山，经鉴定为血红密孔菌，并且组织分离获得原始菌株，命名为血红密孔菌(pycnoporussanguineus)hmgim-140415，于2019年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国武汉)，保藏编号为cctccno：m2019514。第二方面，本发明提供一种血红密孔菌(pycnoporussanguineus)cctccno:m2019514的人工栽培方法，包括制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及栽培管理，以重量百分比计，所述栽培料包括杂木屑37-41％、棉籽壳18-20％、玉米芯18-20％、麦麸16-18％、玉米粉2-3％、石灰1-2％。在第三方面，本发明提供一种血红密孔菌新菌株cctccno:m2019514或其提取物的应用，用于抗肿瘤或者抗细菌引起的相关疾病。在第四方面，本发明提供一种血红密孔菌新菌株cctccno:m2019514或其提取物的应用，用于制备抗肿瘤或者抗细菌引起的相关疾病的药物。在第五方面，本发明提供一种抗肿瘤或者抗细菌引起的相关疾病的药物，包括血红密孔菌新菌株cctccno：m2019514或其提取物和载体。本发明的新菌株，已经实现人工驯化栽培，并且与同种的其他菌株相比，对肿瘤和葡萄球菌都表现出更加强烈和显著的抑制率。附图说明图1为实施例1的血红密孔菌pycnoporussanguineus的野生子实体图。图2为实施例2的人工驯化的血红密孔菌子实体图。图3为实施例2的人工驯化的血红密孔菌子实体图。图4为实施例1的its序列。图5为实施例4的划线培养分区示意图。图6为实施例4的抑金黄色葡萄球菌示意图。具体实施方式第一方面，本发明的血红密孔菌新菌株采自福建武夷山，经鉴定为血红密孔菌，并且组织分离获得原始菌株，命名为血红密孔菌(pycnoporussanguineus)hmgim-140415，于2019年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国武汉)，保藏编号为cctccno：m2019514。对采集的原始菌株进行基因组dna提取并且进行its测序，将测序结果在genbank进行序列blast，发现与血红密孔菌pycnoporussanguineus(l.)murrill相似性高达近100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与pycnoporussanguineus描述一致，鉴定结果为pycnoporussanguineus。血红密孔菌pycnoporussanguineus属于多孔菌目，多孔菌科，是血红栓菌trametessanguinea的现名，子实体一年生，革质，菌盖扇形、半圆形或肾形，外伸可达3cm，宽可达5cm，基部厚可达1.5cm；表面新鲜时浅红褐色、锈褐色至黄褐色，后期褪色，干后颜色几乎不变；边缘锐，颜色较浅，有时波状。孔口表面新鲜时砖红色，干后颜色几乎不变；近圆形，每毫米5～6个；边缘薄，全缘。不育边缘明显，杏黄色，宽可达1mm。菌肉浅红褐色，厚可达13mm。菌管红褐色，长可达2mm。担孢子3.6～4.4×1.7～2μm，长椭圆形至圆柱形，无色，薄壁，光滑，非淀粉质，不嗜蓝。夏秋季单生或簇生于多种阔叶树倒木、树桩和腐木上，造成木材白色腐朽。药用。各区均有分布。第二方面，本发明提供一种血红密孔菌(pycnoporussanguineus)cctccno:m2019514的人工栽培方法，包括制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及栽培管理，以重量百分比计，所述栽培料包括杂木屑37-41％、棉籽壳18-20％、玉米芯18-20％、麦麸16-18％、玉米粉2-3％、石灰1-2％。优选的，上述栽培料的料水比为1:1.1-1.3。优选的，以重量百分比计，所述栽培料包括39％杂木屑、20％棉籽壳、20％玉米芯、17％麦麸、3％玉米粉、1％石灰，料水比：1:1.1-1.3。优选的，所述栽培培养包括：将生产种转接至栽培料中，25-26℃恒温、遮光培养，湿度60％-70％，菌丝长满菌袋进入栽培管理。优选的，所述栽培管理包括：待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料后，继续遮光后熟培养15天，进入出菇阶段，控制温度在23-27℃，并加大通风量，保持空间二氧化碳含量在1％以下，空气相对湿度调整至90％以上，经5-7天后，去除菌盖，菌丝开始扭结并形成鲜红色米柆状原基；原基生长至0.5cm后，继续控制温度在23℃-27℃之间，空气相对湿度85-90％之间，每天光照9小时，光照强度300-500lx，并保持空气中二氧化碳浓度350～1500ppm，保持空气湿润，经30天左右，在此期间，每天向幼菇喷施水雾1-2次，直至子实体大小基本不变，子实体已成熟，采收。优选的，所述制作母种包括：将分离的菌种转接至母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取，得到母种。优选的，所述母种培养基为孟加拉红培养基。进一步优选的，以重量百分比计，所述孟加拉红培养基包括：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，其余为水。优选的，所述制作生产母种包括：将母种转接至生产母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面得到生产母种。优选的，所述生产母种培养基为加富综合pda。进一步优选的，以重量百分比计，所述加富综合pda包括：马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量，其余为水。优选的，所述制作生产种包括：向生产种培养基中无菌接入生产母种，接种时确保生产母种料块埋入原种料中，置于25℃恒温暗培养，待菌丝吃满料后得到生产种。优选的，以重量百分比计，所述生产种培养基包括：98-99％高粱和1-2％碳酸钙。进一步优选的，以重量百分比计，所述生产种培养基包括：98％高粱和2％碳酸钙。优选的，所述人工栽培方法的制作母种前还包括组织分离菌种。一种血红密孔菌(pycnoporussanguineus)cctccno:m2019514的人工栽培方法，包括组织分离菌种后制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及栽培管理，以重量百分比计，所述栽培料包括杂木屑37-41％、棉籽壳18-20％、玉米芯18-20％、麦麸16-18％、玉米粉2-3％、石灰1-2％。优选的，所述组织分离菌种包括：采集回来的血红密孔菌子实体在无菌条件下酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织，置于25℃中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后得到分离的菌种。优选的，所述组织分离培养基为综合pda培养基。进一步优选的，以重量百分比计，所述综合pda培养基包括马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量。在第三方面，本发明提供一种血红密孔菌新菌株cctccno:m2019514或其提取物的应用，用于抗肿瘤或者抗细菌引起的相关疾病。优选的，所述提取物为乙酸乙酯提取物。优选的，所述肿瘤为hepg2细胞引起的肿瘤。优选的，所述细菌为葡萄球菌，进一步优选为金黄色葡萄球菌。在第四方面，本发明提供一种血红密孔菌新菌株cctccno:m2019514或其提取物的应用，用于制备抗肿瘤或者抗细菌引起的相关疾病的药物。优选的，所述提取物为乙酸乙酯提取物。优选的，所述肿瘤为hepg2细胞引起的肿瘤。优选的，所述细菌为葡萄球菌，进一步优选为金黄色葡萄球菌。在第五方面，本发明提供一种抗肿瘤或者抗细菌引起的相关疾病的药物，包括血红密孔菌新菌株cctccno:m2019514或其提取物和载体。优选的，所述提取物为乙酸乙酯提取物。优选的，所述肿瘤为hepg2细胞引起的肿瘤。优选的，所述细菌为葡萄球菌，进一步优选为金黄色葡萄球菌。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。实施例1：血红密孔菌pycnoporussanguineus(l.)murrill的鉴定刘远超、黄志勇在福建武夷山采集到一份血红密孔菌(初步鉴定)标本，如图1所示。经组织分离法得到其pda纯培养物，通过液体培养收集菌丝，低温(40℃)烘干，使用液氮研磨，利用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒，进行dna基因组的提取，得到的dna溶液-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物its1/its4(its1:tccgtaggtgaacctgcgg，its4:tcctccgcttattgatatgc，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行材料的its-pcr实验，扩增在biometrapcr仪上进行，pcr反应液组成(共50μl)为：反应条件为:94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min.pcr产物直接送检进行双向测序，由华大基因完成。测序得到的its序列如图4所示。将图4的测序结果在genbank进行序列blast，发现与血红密孔菌pycnoporussanguineus(l.)murrill相似性高达近100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与pycnoporussanguineus描述一致，鉴定结果为pycnoporussanguineus。该菌种e140415于2019年7月保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉)，保藏编号为cctccno：m2019514。实施例2一、培养基(以重量百分比计)：1、组织分离培养基(综合pda)：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量，其余为水。2、纯化母种培养基(孟加拉红培养基)：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，其余为水。3、生产母种培养基(加富综合pda)：马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量，其余为水。4、生产种培养基：98-99％高粱、1-2％碳酸钙。5、栽培料：39％杂木屑、20％棉籽壳、20％玉米芯、17％麦麸、3％玉米粉、1％石灰，料水比：1:1.1-1.3。二、方法：1、组织分离菌种：制作组织分离培养基，分装试管，在0.11mpa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却摆成斜面。采集回来的野生簇生沿丝伞子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后则可进行转接，其长满的时间大概在10天-15天之间。2、制作纯化母种：按配方制作纯化培养基，分装试管，在0.11mpa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，对于分离后感染细菌的菌种进行转接。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接，得到纯化母种。3、制作生产母种：制作生产母种培养基，分装试管，在0.11mpa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却无菌操作接入分离成功的纯化母种。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后得到生产母种则可进行转接。生产母种长满的时间大概在15天-20天之间。4、制作生产种称取所需比例的高粱，经水泡湿过夜，按比例混入碳酸钙，装入250ml锥形瓶中，折合每瓶装干料100-150g，得到生产种培养基，以硅胶塞封口，在0.147mpa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后将培养基抖散后无菌操作接入生产母种。接种时确保生产母种料块埋入生产种料中。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝吃满料后(20天左右)则可作为生产种使用接入栽培袋中。5、栽培培养称人工驯化培养基取所需比例的培养料，充分混合并加水(含水量为55-65％)，装入17cm×35cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。折合每袋装干料400-420g。装好料后用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，即得一个制好的栽培料袋。在0.147mpa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后无菌操作接入生产种。接种时确保料块埋入栽培料中。接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养。待菌丝吃满料后(18天左右)则可进入栽培管理。6、栽培管理(包括后熟管理、原基形成、子实体生长)(1)后熟管理待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料后，继续遮光后熟培养15天，进入出菇阶段。(2)原基形成控制温度在23-27℃，并加大通风量，保持空间二氧化碳含量在1％以下，空气相对湿度调整至90％以上，经5-7天后，去除菌盖，把栽培袋横排放置(袋与袋之间应留有空隙)，此时菌丝开始扭结并形成鲜红色米柆状原基。此时保持相对湿度，不直接朝原基上喷水。(3)子实体生长期原基生长至0.5cm后，继续控制温度在23℃-27℃之间，空气相对湿度85-90％之间，每天光照9小时，光照强度300-500lx，并保持空气中二氧化碳浓度350～1500ppm，保持空气湿润。经30天左右，子实体完全成熟。在此期间，每天向幼菇喷施水雾1-2次，直至子实体大小基本不变，说明子实体已趋成熟，此时应采收。从长出原基到子实体成熟约经过35天。如图2和图3所示。三、出菇情况1、出菇期：该品种出菇期为81天，采摘一潮。2、产量：每个菇袋每潮出菇9.87-13.69克，平均袋产量为11.99克，生物转化率在3.43％左右。3、子实体性状：子实体呈扇形或如意形，叠生至单生，呈鲜红色。4、与野生状态相比，该品种在人工驯化后子实体个体增加了2-3倍，外形圆整，产量较高。实施例3抑制肿瘤细胞功能一、实验方法1、乙酸乙酯提取物的制备血红栓菌菌株进行固体发酵，培养基为大米和水。培养45天后将长满菌丝体的大米培养基用乙酸乙酯浸泡时间在10小时后超声提取，超声100min，提取二次，合并二次有机相。将收集好的有机相进行抽滤后，将抽滤得到的液体用旋转蒸发仪旋蒸至无液滴状态，低温保藏(4℃)备用。同时发酵其他野生菌株同样操作作为对照。以紫杉醇为阳性对照，浓度为0.5mg/ml。2、肿瘤细胞培养用含青霉素、链霉素和10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液进行肿瘤细胞hepg2(人肝癌)培养。将含有10％fbs的dmem细胞悬液接种于96孔组织培养板上，细胞浓度为2×104cells/ml。培养物置于37℃、5％co2的组织培养箱中培养4小时待用。3、抑制肿瘤细胞实验(1)样品配制将乙酸乙酯提取物用dmso溶解，配制成浓度为20mg/ml的母液，用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液将母液稀释为100ug/ml的样品溶液。(2)加样小心吸去96孔板里的细胞培养液，加入终浓度为100ug/ml的样品溶液。每样品三个复孔。同时设置调零孔(培养基)，对照孔(细胞、培养液)。(3)培养置于37℃、5％co2组织培养箱中培养44小时。(4)抑肿瘤细胞能力观察采用mtt法进行观察。培养44小时后，每孔加入20ulmtt，继续培养4h。振荡均匀后，在490nm下用酶标仪进行读数，计算其抑制率。样品重复两次实验。(5)ic50计算重复(1)-(4)，在(1)浓度配制时用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液将母液稀释为15.625，31.25，62.5，125，250ug/ml的梯度样品溶液。经实验后计算其半致死率。4、数据分析使用spss.21专用统计软件进行统计，采用配对t检验，p<0.05具有显著性差异。二、实验结果spss.21专用统计软件进行统计，结果如表1所示。表1：表1的结果显示，在100μg/ml浓度下，血红栓菌对hepg2的抑制率为96.70％，对于hepg2的ic50值为0.34ug，显示其具有强烈的体外抑制肿瘤细胞作用。同时开展的对照实验中，其他大多数野生菌的提取物均没有抑制肿瘤细胞的效果。在其他平行实验中，同样为血红密孔菌pycnoporussanguineus的菌株a140247的大米发酵物的乙酸乙酯提取物在100μg/ml浓度下对hepg2的抑制率为46.9％，这也佐证了本发明中的新菌株的体外抑制肿瘤细胞hepg2效果更加显著。实施例4发酵液抑菌活性测定一、实验方法1、培养基的制备细菌用培养基：营养琼脂/肉汤培养基；营养琼脂/肉汤培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂15g，加水定容至1000ml调ph为7.4(营养肉汤不加琼脂)。2、样品的制备对照品的制备：取氨苄霉素冻存液，用无菌水稀释成浓度为5μg/ml的对照品溶液，紫外杀菌30min，待用。供试品的制备：血红栓菌菌株进行固体发酵，培养基为大米和水。培养45d后将长满菌丝体的大米培养基用乙酸乙酯浸泡时间在10小时后超声提取，超声100min，提取二次，合并二次有机相。将收集好的有机相进行抽滤后，将抽滤得到的液体用旋转蒸发仪旋蒸至无液滴状态，低温保藏(4℃)备用。实验时配制成10mg/ml，含1％dmso的乙酸乙酯溶液，使用无菌注射器和滤膜过滤除菌，待用。3、菌悬液的制备(1)将金黄色葡萄球菌冻存液从-80℃冰箱中取出，平板划线接种取得单菌落；注：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。如图5所示。1)先划a区：将平板置于酒精灯火焰旁，用左手食指与大拇指抓住培养皿盖，其他三指托住培养皿底部，面向火焰打开培养皿，右手持含菌的接种环，先在a区轻巧地划3～4条连续的平行线当作初步稀释的菌源，烧去接种环上的残余菌样；2)划其余区：将灼烧后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使b区转至划线位置，把接种环通过a区(菌源区)而移至b区，随即在b区轻巧地划上6～7条致密的行线，接着再以同样的操作在c区和d区划上更多的平行线，并使d区的线条与a区平行(但不能与a区或b区的线条接触)；3)恒温培养：将划线后的平板至37℃培养2～3天；4)从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。(2)用无菌接种环挑取单菌落接种在营养肉汤培养基中，37℃、220r/min振荡培养24h，得到供试菌的菌悬液。(3)吸取供试菌的菌悬液，用无菌蒸馏水梯度稀释，得到10-1～10-8倍原浓度的菌液；(4)分别吸取各浓度的菌液200μl均匀涂到营养琼脂平板上，37℃培养24h，每个浓度重复3次；(5)通过平板计数法，确定菌液的浓度，待用。4、抑菌圈的测定采用预加菌液倾注平板法，向已冷却至50℃左右的平板培养基中注入一定量的菌液，使培养基中菌浓度为105～106cfu/ml，摇匀，倾注平板(约30ml/平板)，水平静置待凝固后待用，用已灭菌的打孔器在含菌平板上均匀打孔，仔细挑去孔中培养基，在无菌条件下吸取对照品/供试品200μl打入孔中，放置于37℃条件下静置培养1天，测量抑菌圈大小。阳性对照为10μg/ml的氨苄霉素。二、实验结果：结果如表2所示。表2e140415对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径(x±s，n＝3)样品抑菌圈直径(mm)阳性对照19.79±1.7血红密孔菌e14041519.39±0.86结果如图6所示，在图6中，左上角为空白，右上角为阳性对照，左下角为血红密孔菌e140415，右下角为另外一个对照品种鳞伞属某种w140054。在同样采用10mg/ml浓度进行检测的600余个野生食药用菌品种乙酸乙酯提取物中，本发明菌种呈现明显的抑菌圈，是效果最为明显的10个样品之一，并且，本发明菌株的样品对金黄色葡萄球菌有强烈的抑菌活性。综上所述，本发明中的血红栓菌菌株是一个开展尚未开展研究的新品种，其通过野外采集分离出纯菌种，进行人工栽培，从功能实验来看，其乙酸乙酯提取物具有体外抑制肿瘤效果明显，抑制金黄色葡萄球菌效果显著，栽培后农艺性状较好等特性，是一个具有开发前景的菌种。以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页12