一种棉花耐Na2SO4的鉴定方法与流程

本发明属于农业领域中的品种评价技术，具体涉及一种快速评价棉花对中性盐—na2so4耐受性的鉴定方法，适用于棉花耐na2so4种质资源的筛选与评价。

背景技术：

近年来，我国盐碱地面积不断扩增，据unesco与fao不完全统计，全球盐碱化土地总面积约9.5亿公顷，约占世界陆地总面积的10％，其中我国盐碱(渍)地面积大约9913万公顷，是世界盐碱地大国之一，其中严重盐渍化土壤大约3666.7万公顷，主要分布在包括西北、东北、华北和滨海地区在内的17个省份(郑素珊，高琛，黄龙生.盐碱地改良研究[j].河北林业科技，2014，(3)：74-76)。由于环境和人为的原因，土壤退化及土壤盐渍化面积逐渐增大。在众多农作物中，棉花是耐盐性较强的作物之一，棉花是盐碱地的先锋作物，是开发利用盐渍化土地的理想作物之一(叶武威.真菌的耐盐基因挖掘与棉花的耐盐性改良研究[a].中国农学会棉花分会.中国农学会棉花分会2016年年会论文汇编[c].中国农学会棉花分会:《棉花学报》编辑部,2016:1.)，盐碱地棉花已经成为一种新的优势作物。而且棉花的应用范围广，经济价值可观，因此研究盐胁迫条件下棉花的发育及新的抗盐基因的挖掘具有重要意义。

na2so4是一种中性盐，高浓度的na2so4是一种重要的盐胁迫因子(richterjuliaa,behrjanh,erbanalexanderetal.ion-dependentmetabolicresponsesofviciafabal.tosaltstress.[j].plantcellenviron.,2019,42:295-309.)。当土壤中盐的含量过高时，盐胁迫影响种子萌发和植物生长发育(贾玉珍,朱僖月,唐予迪,等.棉花出苗及苗期耐盐性指标的研究[j].河南农业大学学报,1987,21(1):30-41；叶武威,刘金定.氯化钠和食用盐对棉花种子萌发的影响[j].中国棉花,1994,21(3):14-15；李玉梅,孙艳涛,姜云天,潘立雪.盐胁迫对肥皂草种子萌发的影响[j].东北林业大学学报,2019,47(09):17-23+27.)。我国棉花种质资源丰富，为棉花耐盐性鉴定、筛选和培育提供了丰富的材料，因此建立一种方便、快速且适合大规模筛选、鉴定棉花耐盐材料的方法尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种方便、经济的棉花耐na2so4的鉴定方法。

本发明所提供的鉴定棉花耐na2so4的方法，包括下述步骤：

(1)将棉花种子进行脱绒处理；对脱绒后的棉花种子进行消毒处理；再用无菌水浸泡进行催芽，得到催芽后的种子；

(2)采用竖直双夹层滤纸法对催芽后的种子进行na2so4胁迫处理，清水做对照，考察两种处理下的相对发芽率，进行耐na2so4性综合性评价；其中，以中j221作为鉴定对照材料，计算相对发芽率，得到棉花种质耐na2so4评价标准；

(3)采用步骤(1)中的方法对待鉴定棉花种质进行预处理，对预处理后的种子进行na2so4胁迫处理，清水做对照，考察其相对发芽率，以中j221作为鉴定对照材料，计算相对发芽率，根据步骤(2)中的棉花种质耐na2so4评价标准，鉴定待鉴定棉花种质的耐na2so4级别。

上述方法步骤(1)中，可采用浓硫酸对棉花种子进行脱绒处理。

所述消毒处理的操作可为：依次用双氧水浸泡灭菌，再用无菌水清洗。

所述双氧水质量浓度可为20％。

所述无菌水冲洗每次1min，可进行5-6次，具体可为5次。

所述无菌水浸泡的时间可为10-24h，具体可为12h。

上述方法步骤(2)中，所述na2so4胁迫处理的条件为：150mmna2so4处理5d。

发芽率％＝na2so4胁迫处理发芽率/清水组发芽率×100％；

相对发芽率％＝待测材料发芽率×50％/对照材料发芽率；

所述棉花种质耐na2so4评价标准为：当相对发芽率≥90.0％时，该棉花种质为“高抗”耐na2so4级别；当相对发芽率在75.0％-89.9％之间时，该棉花种质为“抗”耐na2so4级别；当相对发芽率在50.0％-74.9％之间时，该棉花种质为“耐”耐na2so4级别；当相对发芽率在0.0％-49.9％时，该棉花种质为“不耐”耐na2so4级别。

本发明采用胁迫发芽法对棉花种质进行室内耐na2so4鉴定，试验周期为5d，周期短，并且不受外界气候条件限制，花费少，初步建立了一种较为经济的、方便快速的耐na2so4鉴定方法，为棉花种质提供了不同级别的抗na2so4材料，为从棉花中挖掘耐盐基因提供了依据，并且进一步推动了棉花转基因技术在耐盐方面的应用。

附图说明

图1为不同浓度的na2so4处理对棉花种子萌发的影响。a是ck、b是50mm、c是100mm、d是150mm、e是200mm、f是250mm、g是300mm的na2so4处理棉花种子5天的萌发情况。

图2是子叶期验证：用150mm的na2so4处理棉花种子，5天后挑选发芽的种子种入沙土里，观察5天后苗的生长情况，h是材料中j221的ck、i是材料中j221的150mm的na2so4处理、j是材料中jlm87的150mm的na2so4处理、k是材料中jlm87的ck。

图3是三叶期验证：用300mm的na2so4处理棉花三叶期，其中，l是材料中jlm87的300mm的na2so4处理、m是材料中j221的300mm的na2so4处理。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等,均可从商业途径中得到。

实施例

(1)种子预处理

将棉花种子进行浓硫酸脱绒处理；

挑选大小一致、均匀饱满的种子，依次用20％的双氧水浸泡3h消毒灭菌，再用蒸馏水反复清洗5次(1分钟/次)；最后用无菌水浸种催芽12h。

(2)na2so4胁迫条件筛选

材料：常规棉品种：中j0710、中jl16、tm-1、中jgw2、中9807、中jh109、中j10h18；每个品种50粒，三次重复。

竖直双夹层滤纸法：将滤纸平铺在塑料盘上，用(0mm、50mm、100mm、150mm、200mm、250mm、300mm)na2so4浸湿滤纸，将种子均匀地摆放在滤纸上，生长点朝向同一个方向，种子与种子上下间隔6cm，左右间隔5cm，沿种子位置横向卷起滤纸，并且种子应卷在滤纸中间，使得滤纸成直筒状。将直筒状的滤纸竖直放置在烧杯中(生长点朝下)，烧杯底部加入一定量的na2so4溶液，使整个发芽期间滤纸始终保持湿润。

生长条件：将烧杯放入人工培养箱，28℃，24h黑暗，处理3d、5d、7d。观察种子萌发情况(如图1)，发现在150mmna2so4处理5d时发芽率存在显著差异。因此选择在150mm、处理5d作为na2so4胁迫处理条件，调查相对发芽率作为筛选的指标。

(3)棉花70份种质材料耐na2so4性评价

70份材料筛选：种子预处理(同步骤1)，70份种质材料涵盖黄河流域、长江流域、西北内陆棉区，其中陆地棉69份、海岛棉1份，均由本实验室保存以及本课题自主创新的材料。

表1：试验材料名称

表2：150mmna2so4处理5d的发芽率统计表

表3：方差分析

方差分析显示，品种间差异极显著，说明不同品种间在耐na2so4上存在差异，处理间差异极显著，说明不同浓度na2so4胁迫处理对种子发芽率存在明显抑制作用；重复间差异不显著，即三个重复间重复性较好；品种×处理间互作存在极显著差异性，说明不同品种在不同浓度的耐na2so4存在差异。

按照相对发芽率进行耐na2so4排序

相对发芽率％＝试验组发芽率/对照组发芽率×100％

表4：用150mm的na2so4处理70份材料的耐na2so4性大小评价

(4)鉴定结果评价

根据耐na2so4评价结果，选择70份材料中耐na2so4性较强的中j221作为耐na2so4性鉴定的对照材料，计算各材料的相对发芽率，并将材料划分为如下四级：相对发芽率＝待测材料发芽率×50％/对照材料的发芽率

表5：耐盐性等级划分

表6：按照上述等级划分标准，得到70份材料的耐na2so4性评价结果

(5)验证

用萌发期筛选的材料进行子叶期(见图2)和三叶期(见图3)的筛选，胁迫结果与萌发期胁迫结果一致。