专利名称:一种欧亚种无核葡萄高效育种方法
技术领域：
本发明涉及式一种欧亚种无核葡萄高效育种方法，属于植物育种技术领域：
。
技术背景
1、公开号CN 101238791A、名称“一种提高无核葡萄育种效率的方法”，它是将一种植物生长抑制剂类物质矮壮素，或细胞分裂素类物质6-BA溶解配制成的药剂，在花前10 20天喷施到花穗上，在花后40 50天摘取葡萄果粒，取出胚珠进行胚挽救，使用本发明的胚发育率无核白由0 4. 4%提高至8. 3 11. 9% ；森田尼无核由0. 5 2. 5%提高到 1. 8 21. 9% ；火焰无核由7. 1 17. 提高到14. 1 25. 4%。
2、无核葡萄的合子胚在发育过程中败育而不能发育成正常的种子，因而常规育种只能以无核品种作父本杂交选育无核葡萄品种，但后代中无核几率低(0 15. 9% )，育种效率低下。在亲本选择方面，不同父本胚萌发及成苗率差异显著。在胚珠接种时期方面，由于不同品种、不同年份、不同生态条件及部位，胚珠的败育期存在较大差异，使胚培养的适宜接种时期也因品种而异。在幼胚的取材时间上，采取过早，幼胚太小，难以成活；采取时间过晚，幼胚已经夭折，也不能达到培养目的。
发明内容
设计目的提供一种技术操作相对简便、成本较低、并且无核葡萄育种效率较高的一种欧亚种无核葡萄高效育种技术。
设计方案本申请使用植物生长调节剂调控植物生殖器官的生长发育进程，利用胚挽救技术，成功地克服无核葡萄做为母本进行有性杂交得不到种子的困难。通过假单性结实类型的欧亚种无核品种，在其合子胚败育之前进行人工离体培养，阻止幼胚的败育，最终形成完整的植株，是一种高效的无核葡萄育种技术。
影响无核葡萄胚发育率的原因主要有两方面一方面是基因型的影响，不同基因型形成合子胚的能力以及胚发育的大小、数目有很大差异；另一方面是胚珠离体培养下的条件，包括培养基的种类、激素种类及浓度、接种时期、培养方式等等。
满足幼胚离体培养的营养极为重要，选择适宜的培养基是胚培养的基础。果树组织培养中应用的基本培养基很多，大致可以分为三种类型高盐型(如MS培养基)、中盐型 (如Nitsch+Nitsch培养基)和低盐型(如White培养基)。不同的器官及不同的分化时期要求用不同的培养基。每种培养基都包括矿质营养和有机营养，使用时常添加激素。人们根据自己不同的培养目的和需要，进行培养基的选择并加以改进。
在种子的发育过程中经常受到激素的调节。大量实验表明，在未成熟种子中含有各种激素。并且在不同的发育阶段，有的激素产生而有的激素消失，有的浓度或存在型态发生变化。各种激素的消长变化，其功能大致有以下四个方面(1)控制果实的生长与发育； (2)控制干物质在果实中的积累；C3)控制种子本身的发育；(4)控制种子萌发与幼苗生长。 不同的无核葡萄品种对激素的敏感程度有显著的差异，并且这种敏感程度随胚的发育程度不同而变化，胚的发育程度越高，对激素的要求越不严格。由于不同品种对激素的敏感性不同而附加不同的激素。这些激素同时还能抑制和打破种子休眠，削弱和清除种皮障碍，显著缩短胚的萌发时间，提高胚的成苗率。进行胚培养时认为在培养基中附加0. 5mg · ml—1的 GA3、IAA以及6-BA对本发明的成功起了决定性的作用。
无核葡萄胚培养技术，无疑使无核葡萄有性杂交组合方式更为丰富，从而大大提高了无核葡萄品种的选育效果。然而，胚培养无论在技术和费用要求都很高，从胚珠培养到出苗，需时较长，而且在此期间严格要求无菌操作及培养，这就需要很高的专业技术水平的人进行这项工作，因而在普及上受到一定的限制。
方法方案
一种欧亚种无核葡萄高效育种的培养基，其特征在于，所述培养基包括胚挽救的胚培养培养基、胚萌发培养基和成苗培养基，其中，所述胚挽救的胚培养培养基是大量元素为:KN031900mg · Λ NH4N031650mg · Λ KH2PO4170mg · Λ MgSO4 · 7Η20 370mg · Λ CaCl2 · 2Η20 440mg · Γ1 ；微量元素为KI 0. 83mg · Λ Η3Β036 · 2mg · Λ MnSO4 · 4Η20 22. 3mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 0. 25mg · Λ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；铁盐为=Na2 · EDTA37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η2027· 8mg · Γ1 ；有机物为肌醇IOOmg · ΙΛ甘氨酸2mg · L—1，盐酸硫胺素VB10. Img · L-1，盐酸吡哆醇VB60. 5mg · L-1， 烟酸0. 5mg · L-1 ；附加植物生长调节剂=GA3O. 5mg · L—1，吲哚乙酸IAA 1. Omg · L-U-苄氨基腺嘌呤 6-ΒΑ 0. 5mg · L—1，蔗糖 30g · L-1，琼脂 5g · L—1，pH = 5. 8 ；
所述胚萌发培养基是大量元素为KN039 50mg · L—1，NH4N03825mg · L—1， KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7H20 185mg · Λ CaCl2 · 2H20 220mg · L—1 ；微量元素为: KI 0. 83mg ·厂1，H3B036. 2mg ·厂1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg ·厂1，ZnSO4 · 7H20 8. 6mg ·厂1， Na2MoO4 · 2H200. 25mg · Λ CuSO4 · 5H20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · L-1 ；铁盐为=Na2 · EDTA37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有机物为肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸 2mg · L—1，盐酸硫胺素VB10. Img · L—1，盐酸吡哆醇VB60. 5mg · L-1，烟酸0. 5mg · L-1，附加植物生长调节剂α -萘乙酸NAA 0. 4mg · L-1，吲哚乙酸IAA 0. 4mg · L-1，6-苄氨基腺嘌呤6-BA 0. 6mg · ΙΛ 蔗糖 30g · ΙΛ 琼脂 5g · L-1，pH = 5. 8 ；
所述成苗培养基是大量元素为KN039 50mg · Γ1, NH4N03825mg · Γ1, KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7Η20 185mg · Λ CaCl2 · 2Η20 220mg · L—1 ；微量元素为: ΚΙΟ. 83mg · I/1，Η3ΒΟ36. 2mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · I/1，ZnSO4 · 7H20 8. 6mg · I/1， Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg · Λ CuSO4 · H2O 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · L-1 ；铁盐为=Na2 · EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有机物为肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸 2mg · L—1，盐酸硫胺素VB10. Img · L-1，盐酸吡哆醇VB60. 5mg · L—1，烟酸0. 5mg · L-1，附加植物生长调节剂吲哚丁酸 IBA 0. 2mg · ΙΛ 蔗糖 30g · L-1，琼脂 5g · L—1，pH = 5. 8。
一种欧亚种无核葡萄高效育种方法，(1)花期常规授粉受精，花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗lhr，超净工作台上，将幼果用70%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3 次；再用0. 09 0. 11%升汞浸泡8 12min，然后无菌水漂洗4 5次；(2)在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种在含有不同水平植物生长调节剂赤霉素酸(GA!3)、吲哚乙酸(IAA)、6_苄氨基腺嘌呤(6-BA)的胚培养培养基上进行胚挽救；(3)胚挽救的条件将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，再转入培养室中培养30d，经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍；(4)无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内即可萌发，萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗，将其试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁至一定数量，得到不同株系的杂交苗，每月更换一次新鲜培养基；( 试管苗长出4 5 片叶，将至三角瓶瓶口时，即可炼苗移栽，成活后定植到大田。
本发明与背景技术相比，一是操作简单，成本降低，显著提高了无核葡萄胚挽救的幼胚发育率、萌发率以及成苗率，能得到更多的杂交后代；二是以无核葡萄品种做母本，后代无核性状出现的比率大幅度增高，大大增加了无核葡萄杂交育种的亲本选择范围，增加亲本选配的成功率，加速无核葡萄新品种的选育进程，是一种高效无核葡萄育种技术；三是对6个欧亚种无核葡萄品种进行胚培养时试验了不同培养基和激素的配方，在胚培养、胚萌发以及成苗培养基都使用MS培养基，效果最好，而且母液配制与储存方便，节约药品与材料；三是不需要花前10 20d用50 500mg · ml—1的矮壮素或者10 IOOmg · ml—1的 6-BA溶液处理，既节约了价格昂贵的外源激素类药品的使用，减少用工成本，同时避免了外源激素对葡萄植株以及果品质量的影响，减小污染，尤其避免对人类健康的潜在或者不明影响。
具体实施方式
实施例1 一种欧亚种无核葡萄高效育种技术，具体包括下列步骤(1)花期常规授粉受精，花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗Ihr，超净工作台上，将幼果用70% 酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后无菌水漂洗4 5次， (2)在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种在含有不同水平植物生长调节剂赤霉素酸(GA3)、喷哚乙酸(IAA)、6_苄氨基腺嘌呤(6-BA)的胚培养培养基上进行胚挽救。⑶ 胚挽救的条件将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，再转入培养室中培养30d。经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍。(4)无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内即可萌发。萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗。将其试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁至一定数量，得到不同株系的杂交苗。每月更换一次新鲜培养基。 (5)试管苗长出4 5片叶，将至三角瓶瓶口时，即可炼苗移栽，成活后定植到大田。
所述胚挽救培养基是大量元素为KN031900mg · Λ NH4N031650mg · Λ KH2PO4170mg · Λ MgSO4 · 7Η20 370mg · Λ CaCl2 · 2Η20 440mg · Γ1 ；微量元素为KI 0. 83mg · ΛΗ3Β036 · 2mg ·L-1 ,MnSO4 ·4Η20 22. 3mg ·L^ZnSO4 ·7Η20 8. 6mg Γ1,Na2MoO4 ·2Η20 0. 25mg · ΙΛ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；铁盐为=Na2 · EDTA 37. 3mg · Γ1，FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有机物为肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸 2mg · Λ 盐酸硫胺素(Vbi)O. Img · L-1，盐酸吡哆醇(VB6)0. 5mg · L—1，烟酸(VB5 或 VPP)0. 5mg · L-1。附加植物生长调节剂赤霉素酸(GA3)O. 5mg · ΙΛ吲哚乙酸(IAA) 1. Omg · L-U-苄氨基腺嘌呤 (6-BA) 0. 5mg · L-1，蔗糖 30g · Λ 琼脂 5g · Λ pH = 5· 8。
所述胚萌发培养基是大量元素为KN039 50mg · L—1，NH4N03825mg · L—1， KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7H20 185mmg · Λ CaCl2 · 2H20 220mg · L—1 ；微量元素为: KIO. 83mg · I/1，H3BO36. 2mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · I/1，ZnSO4 · 7H20 8. 6mg · I/1，Na2MoO4 · 2Η20 0. 25mg · Λ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；铁盐为=Na2 · EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有机物为:肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸ang · ΙΛ盐酸硫胺素(Vbi) 0. Img · ΙΛ盐酸吡哆醇(Vb6) 0. 5mg · Λ烟酸(VB5 或VPP)0. 5mg · L—1。附加植物生长调节剂α -萘乙酸(NAA)O. 4mg · L—1，吲哚乙酸 (IAA)O. 4mg ·ΙΛ6-苄氨基腺嘌呤(6_ΒΑ)0· 6mg · Λ 蔗糖 30g · Λ 琼脂 5g · ΛρΗ = 5· 8。
所述成苗培养基是大量元素为KN039 50mg · Γ1, NH4N03825mg · Γ1, KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7Η20 185mg · Λ CaCl2 · 2Η20 220mg · L—1 ；微量元素为: ΚΙΟ. 83mg · I/1，Η3ΒΟ36. 2mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · I/1，ZnSO4 · 7H20 8. 6mg · I/1， Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg · Λ CuSO4 · 5H20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · L-1 ；铁盐为=Na2 · EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Γ1 ；有机物为:肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸ang · L-1，盐酸硫胺素(Vm)O. Img · L-1，盐酸吡哆醇(VB6)0. 5mg · Λ烟酸(VB5或 VPP)0. 5mg · L-1。附加植物生长调节剂吲哚丁酸(IBA)O. 2mg · L-1，蔗糖30g · L-1，琼脂 5g · Λ ρΗ = 5. 8。
所述的欧亚种无核葡萄品种是无核白葡萄、优无核葡萄(超级无核、黄提)、奇妙无核葡萄(黑美人)、红宝石无核(鲁贝)葡萄、克瑞森无核(绯红无核、淑女红)葡萄、皇家秋天(无核皇后)葡萄。
所述的6-ΒΑ溶液时按照下列技术配制先配制0.5mg .11111-84母液。称取 50mg6-BA，用2ml稀盐酸或95%乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀， 定容至100ml，即为0. 5mg · HiF1B-BA母液，4°C冷藏保存。配制IL胚挽救培养基时，用移液管或移液枪量取Iml母液即可；配制IL胚萌发培养基时，用移液管或移液枪量取1. 2ml母液即可.
所述的GA3溶液时按照下列技术配制先配制0. 5mg -Hir1GA3母液。称取50mgGA3， 用2ml稀盐酸或95 %乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至 100ml,即为0. Smg-Hir1GA3母液，4°C冷藏保存。配制IL胚挽救培养基时，用移液管或移液枪量取Iml母液即可。
所述的IAA溶液时按照下列技术配制先配制0. 5mg ^r1IAA母液。称取50mgIAA， 用2ml稀盐酸或95 %乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至 100ml,即为0. 5mg -ml^IAA母液，4°C冷藏保存。配制IL胚挽救培养基时，用移液管或移液枪量取2ml母液即可；配制IL胚萌发培养基时，用移液管或移液枪量取800 μ 1母液即可。
所述的NAA溶液时按照下列技术配制先配制0. 5mg ^r1NAA母液。称取50mgNAA， 用2ml稀盐酸或95 %乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至 100ml,即为0. 5mg -ml^NAA母液，4°C冷藏保存。配制IL胚萌发培养基时，用移液管或移液枪量取800 μ 1 NAA母液即可。
所述的IBA溶液时按照下列技术配制先配制0. 5mg .mPlBA母液。称取50mgIBA， 用2ml稀盐酸或95 %乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至 100ml,即为0. 5mg · ml^IBA母液，4°C冷藏保存。配制IL成苗培养基时，用移液枪量取 400 μ 1 IBA母液即可。
所述的胚珠在MS培养基中低温处理的条件为温度5 8°C，时间为60d，空气湿度为60%左右，暗培养。[0027]所述的发育胚在萌发培养基中以及幼苗在成苗培养基中培养，培养条件为温度 25士 1°C，湿度50% 60%，光强2000 3000Lx，光照/黑暗为16h/8h。
根据无核葡萄胚发育特点以及无核葡萄离体培养下的有关激素、培养方式、接种时期、成苗途径等多方面内容，采用MS固体或液体培养基附加不同激素配比，于花后30 50d接种，使无核葡萄品种胚发育率平均达到84 %，胚萌发率占发育胚的60 % 92 %，成苗率占萌发胚的50 % 98 %，从而使无核葡萄胚培养技术更接近于实用化。
例1 无核白葡萄进入始花期前三天去雄套袋。选择气温在20 30°C，无风的晴朗早晨(6:00 7:00开始)。去雄时用尖头小镊子将花冠及雄蕊一起除去。既要将雄蕊除净，又要避免碰伤柱头。为防止去雄时花粉落到柱头上造成自交，每次去雄后都用清水冲洗柱头，干后立即套袋。每穗100粒以上。每个品种去雄100穗。每个品种至少要选20株生长健壮的植株做母本。杂交后用常规技术管理。
花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗lhr，超净工作台上无菌条件下，将幼果用70%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后无菌水漂洗 4 5次。
在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种胚培养培养基上进行胚挽救。
将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，空气湿度为60%左右，暗培养。
再转入培养室中培养30d，温度25 士 1°C，湿度50% 60%，光强2000 3000Lx， 光照/黑暗为16h/ !。。经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍。
无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内即可萌发。萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗。将其试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁至一定数量，得到不同株系的杂交苗。每月更换一次新鲜培养基。培养条件为温度25士 1°C，湿度50% 60%，光照强度2000 3000Lx，光照/黑暗为16h/8h。
试管苗长出4 5片叶，将至三角瓶瓶口时，即可炼苗移栽，成活后定植到大田。
例2 优无核葡萄(超级无核、黄提)进入始花期前三天去雄套袋。选择气温在 20 30°C，无风的晴朗早晨(6:00 7:00开始)。去雄时用尖头小镊子将花冠及雄蕊一起除去。既要将雄蕊除净，又要避免碰伤柱头。为防止去雄时花粉落到柱头上造成自交，每次去雄后都用清水冲洗柱头，干后立即套袋。每穗100粒以上。每个品种去雄100穗。每个品种至少要选20株生长健壮的植株做母本。杂交后用常规技术管理。
花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗lhr，超净工作台上无菌条件下，将幼果用70%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后无菌水漂洗 4 5次，
在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种胚培养培养基上进行胚挽救。
将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，空气湿度为60%左右，暗培养。
再转入培养室中培养30d，温度25 士 1°C，湿度50% 60%，光强2000 3000Lx， 光照/黑暗为16h/ !。。经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍。
无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内即可萌发。萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗。将其试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁至一定数量，得到不同株系的杂交苗。每月更换一次新鲜培养基。培养条件为温度25士 1°C，湿度50% 60%，光强2000 3000Lx，光照/黑暗为16h/8h。
试管苗长出4 5片叶，将至三角瓶瓶口时，即可炼苗移栽，成活后定植到大田
例3 奇妙无核葡萄(黑美人)进入始花期前三天去雄套袋。选择气温在20 30°C，无风的晴朗早晨(6:00 7:00开始)。去雄时用尖头小镊子将花冠及雄蕊一起除去。 既要将雄蕊除净，又要避免碰伤柱头。为防止去雄时花粉落到柱头上造成自交，每次去雄后都用清水冲洗柱头，干后立即套袋。每穗100粒以上。每个品种去雄100穗。每个品种至少要选20株生长健壮的植株做母本。杂交后用常规技术管理。
花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗lhr，超净工作台上无菌条件下，将幼果用70%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后无菌水漂洗 4 5次。
在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种胚培养培养基上进行胚挽救。
将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，空气湿度为60%左右，暗培养。
再转入培养室中培养30d，温度25 士 1°C，湿度50% 60%，光强2000 3000Lx， 光照/黑暗为16h/ !。。经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍。
无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内即可萌发。萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗。将其试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁至一定数量，得到不同株系的杂交苗。每月更换一次新鲜培养基。培养条件为温度25士 1°C，湿度50% 60%，光照强度2000 3000Lx，光照/黑暗为16h/8h。
试管苗长出4 5片叶，将至三角瓶瓶口时，即可炼苗移栽，成活后定植到大田
例4 克瑞森无核(绯红无核、淑女红)葡萄进入始花期前三天去雄套袋。选择气温在20 30°C，无风的晴朗早晨(6:00 7:00开始)。去雄时用尖头小镊子将花冠及雄蕊一起除去。既要将雄蕊除净，又要避免碰伤柱头。为防止去雄时花粉落到柱头上造成自交，每次去雄后都用清水冲洗柱头，干后立即套袋。每穗100粒以上。每个品种去雄100穗。 每个品种至少要选20株生长健壮的植株做母本。杂交后用常规技术管理。
花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗lhr，超净工作台上无菌条件下，将幼果用70%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后无菌水漂洗 4 5次。
在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种胚培养培养基上进行胚挽救。
将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，空气湿度为60%左右，暗培养。
再转入培养室中培养30d，温度25 士 1°C，湿度50% 60%，光强2000 3000Lx， 光照/黑暗为16h/ !。。经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍。
无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内即可萌发。萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗。将其试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁至一定数量，得到不同株系的杂交苗。每月更换一次新鲜培养基。培养条件为温度25士 1°C，湿度50% 60%，光照强度2000 3000Lx，光照/黑暗为16h/8h。
试 管苗长出4 5片叶，将至三角瓶瓶口时，即可炼苗移栽，成活后定植到大田
例5 红宝石无核(鲁贝)葡萄进入始花期前三天去雄套袋。选择气温在20 30°C，无风的晴朗早晨(6:00 7:00开始)。去雄时用尖头小镊子将花冠及雄蕊一起除去。 既要将雄蕊除净，又要避免碰伤柱头。为防止去雄时花粉落到柱头上造成自交，每次去雄后都用清水冲洗柱头，干后立即套袋。每穗100粒以上。每个品种去雄100穗。每个品种至少要选20株生长健壮的植株做母本。杂交后用常规技术管理。
花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗lhr，超净工作台上无菌条件下，将幼果用70%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后无菌水漂洗 4 5次，
在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种胚培养培养基上进行胚挽救。将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，空气湿度为60%左右，暗培养。
再转入培养室中培养30d，温度25 士 1°C，湿度50% 60%，光强2000 3000Lx， 光照/黑暗为16h/8h。。经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍。
无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内即可萌发。萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗。将其试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁至一定数量，得到不同株系的杂交苗。每月更换一次新鲜培养基。培养条件为温度25士 1°C，湿度50% 60%，光照强度2000 3000Lx，光照/黑暗为16h/8h。
试管苗长出4 5片叶，将至三角瓶瓶口时，即可炼苗移栽，成活后定植到大田
例6 皇家秋天(无核皇后)葡萄进入始花期前三天去雄套袋。选择气温在20 30°C，无风的晴朗早晨(6:00 7:00开始)。去雄时用尖头小镊子将花冠及雄蕊一起除去。 既要将雄蕊除净，又要避免碰伤柱头。为防止去雄时花粉落到柱头上造成自交，每次去雄后都用清水冲洗柱头，干后立即套袋。每穗100粒以上。每个品种去雄100穗。每个品种至少要选20株生长健壮的植株做母本。杂交后用常规技术管理。
花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗lhr，超净工作台上无菌条件下，将幼果用70%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次；再用0. 升汞浸泡lOmin，然后无菌水漂洗 4 5次。
在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种胚培养培养基上进行胚挽救。
将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，空气湿度为60%左右，暗培养。
再转入培养室中培养30d，温度25 士 1°C，湿度50% 60%，光强2000 3000Lx， 光照/黑暗为16h/8h。。经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍。
无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内即可萌发。萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗。将其试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁至一定数量，得到不同株系的杂交苗。每月更换一次新鲜培养基。培养条件为温度25士 1°C，湿度50% 60%，光照强度2000 3000Lx，光照/黑暗为16h/8h。
试管苗长出4 5片叶，将至三角瓶瓶口时，即可炼苗移栽，成活后定植到大田以下是采用本发明的方法取得的结果，以进一步说明本发明在无核葡萄育种上的高效性。
权利要求
1.一种欧亚种无核葡萄高效育种的培养基，其特征在于，所述培养基包括胚挽救的胚培养培养基、胚萌发培养基和成苗培养基，其中，所述胚挽救的胚培养培养基是大量元素为:KN031900mg .I71，NH4N031650mg · Γ1，KH2PO4170mg 'T1jMgSO4 ‘ 7H20370mg 'U1jCaCl2 ·2Η20 440mg · L—1 ；微量元素为:KI0. 83mg · Λ Η3Β036· 2mg · Λ MnSO4 · 4Η20 22. 3mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 0. 25mg · Λ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；铁盐为=Na2 · EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η2027· 8mg · Γ1 ；有机物为肌醇 IOOmg · ΙΛ甘氨酸2mg · L-1，盐酸硫胺素VB10. Img · L-1，盐酸吡哆醇VB60. 5mg · Λ烟酸 0. 5mg · L-1 ；附加植物生长调节剂=GA3O. 5mg · Λ吲哚乙酸IAA 1. Omg · L-U-苄氨基腺嘌呤 6-ΒΑ 0. 5mg · L-1，蔗糖 30g · Λ 琼脂 5g · Λ pH = 5· 8 ；所述胚萌发培养基是大量元素为KN039 50mg · Λ NH4N038 2 5mg · Λ KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7Η20 185mg · Λ CaCl2 · 2Η20 220mg · Γ1 ；微量元素为KI 0. 83mg · Λ Η3Β036· 2mg · L-1 ,MnSO4 ·4Η20 22. 3mg · L^ZnSO4 ·7Η20 8. 6mg 'T1jNa2MoO4 ·2Η200· 25mg · Λ CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；铁盐为=Na2 · EDTA37. 3mg · Λ FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · L—1 ；有机物为肌醇IOOmg · L—1，甘氨酸2mg · L—1，盐酸硫胺素 VB10. Img · ΙΛ盐酸吡哆醇VB60. 5mg · Λ烟酸0. 5mg · L-1，附加植物生长调节剂α -萘乙酸 NAA 0. 4mg · Γ1，吲哚乙酸 ΙΑ40. 4mg · Γ1，6-苄氨基腺嘌呤 6-BA 0. 6mg · Γ1，蔗糖 30g · Γ1, 琼脂 5g · L—1，pH = 5. 8 ；所述成苗培养基是大量元素为KN039 50mg · Λ NH4N038 2 5mg · Λ KH2P0485mg · Λ MgSO4 · 7Η20 185mg · Λ CaCl2 · 2Η20 220mg · Γ1 ；微量元素为KI 0. 83mg · Λ H3B036. 2mg · I/1，MnSO4 · 4Η20 22. 3mg · I/1，ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg · I/1，Na2MoO4 · 2Η20 0. 25mg · ΙΛ CuSO4 · H2O 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；铁盐为=Na2 · EDTA 37. 3mg · Γ1，FeSO4 · 7H20 27. 8mg · Γ1 ；有机物为肌醇 IOOmg · Λ 甘氨酸 2mg · Λ 盐酸硫胺素VB10. Img · ΙΛ盐酸吡哆醇VB60. 5mg · Λ烟酸0. 5mg · L-1，附加植物生长调节剂口引哚丁酸 IBA 0. 2mg · ΙΛ 蔗糖 30g · L-1，琼脂 5g · L—1，pH = 5. 8。
2.一种使用权利要求
1的培养基进行欧亚种无核葡萄高效育种的方法，其特征是(1)花期常规授粉受精，花后30 50天摘取幼果，自来水下流水冲洗lhr，超净工作台上，将幼果用70%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次；再用0. 09 0. 11%升汞浸泡8 12min,然后无菌水漂洗4 5次；(2)在无菌条件下切开果粒从浆果中取出胚珠，接种在胚培养培养基上进行胚挽救；(3)胚挽救的条件将接种好的三角瓶，置于5 8°C培养箱中低温处理60d，再转入培养室中培养30d，经胚挽救发育的胚体积增大至2 5倍；(4)无菌条件下将胚珠横切解剖，在胚珠的喙部，取出白色的发育胚，并转接入胚萌发培养基中，两周内萌发，萌发后的幼苗立即转入成苗培养基中进行培养，就得到完整的无核葡萄胚挽救试管苗，将试管苗用成苗培养基分别进行继代扩繁，得到不同株系的杂交苗，每月更换一次新鲜培养基；(5)试管苗长出4 5片叶，将至三角瓶瓶口时，炼苗移栽，成活后定植到大田。
3.根据权利要求
2所述的欧亚种无核葡萄高效育种方法，其特征是所述的6-BA溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg · πιΓ^-ΒΑ母液，称取50mg 6-BA,用2ml稀盐酸或95 %乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至100ml，即为(0. 5mg · mH-BA母液，4°C冷藏保存。
4.根据权利要求
2所述的欧亚种无核葡萄高效育种方法，其特征是所述的GA3溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg · Hir1GA3母液，称取50mg GA3，用2ml稀盐酸或95%乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至100ml，即为0. 5mg ^r1GA3母液，4°C冷藏保存。
5.根据权利要求
2所述的欧亚种无核葡萄高效育种方法，其特征是所述的IAA溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg -Iiir1IAA母液，称取50mg IAA，用2ml稀盐酸或95%乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至100ml，即为0. 5mg -ml^IAA 母液，4°C冷藏保存。
6.根据权利要求
2所述的欧亚种无核葡萄高效育种方法，其特征是所述的NAA溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg -Iiir1NAA母液，称取50mg NAA,用2ml稀盐酸或95%乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至100ml，即为0. 5mg -ml^NAA 母液，4°C冷藏保存。
7.根据权利要求
2所述的欧亚种无核葡萄高效育种方法，其特征是所述的IBA溶液是按照下列方法配制先配制0. 5mg -Iiir1IBA母液，称取50mg IBA，用2ml稀盐酸或95%乙醇溶液溶解，缓缓加入蒸馏水，不断搅拌，以免产生沉淀，定容至100ml，即为0. 5mg -ml^IBA 母液，4°C冷藏保存。
8.根据权利要求
2所述的欧亚种无核葡萄高效育种方法，其特征是所述的胚珠在培养基中低温处理的条件为温度5 8°C，时间为60d，空气湿度为55 65%，暗培养；所述的发育胚在萌发培养基中以及幼苗在成苗培养基中培养，培养条件为温度25士 1°C，湿度 50% 60%，光强2000 3000Lx，光照/黑暗为16h/8h。
专利摘要
本发明涉及式一种欧亚种无核葡萄高效育种方法，它是在无核葡萄在开花后30～50d，摘取葡萄幼果，在无菌条件下取出胚珠，胚接种在含有不同水平植物生长调节剂赤霉素酸(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)的MS培养基上进行胚挽救。使用本发明的平均胚发育率由背景方法公布的专利的8.3～11.9％提高到84％，萌发率达到75.33％，成苗率达到74.17％，并且本申请得到的无核葡萄的胚挽救方法通过提高无核葡萄的胚发育率与萌发率，增加后代的成苗率，能够较容易得到更多的杂交后代，增大无核葡萄杂交育种的亲本选择范围，加速无核葡萄新品种育种进程，提高无核葡萄育种效率。
文档编号C12N5/04GKCN101564011 B发布类型授权 专利申请号CN 200910136797
公开日2011年12月14日 申请日期2009年5月18日
发明者刘海琳 申请人:杭州蓝天园林建设集团有限公司余杭分公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan