一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于非洲菊组织培养技术领域，具体涉及一种通过诱导体细胞胚获得非洲 菊再生植株的方法。
【背景技术】
[0002] 非洲菊（Gerbera jamesonii)又称扶郎花，原产南非，系菊科大丁草属多年生草本 植物，具有花色丰富、花型独特、产花量高、观赏期长等优点，是世界五大切花之一。由于非 洲菊自花不孕，种子苗变异大，分株繁殖可以保持原有的种性特征，不发生变异，但存在繁 殖过程中种苗易被病虫害侵染，受季节限制，增殖速度慢等问题，难以适应规模化、工厂化 生产的需求，且长期无性繁殖还存在病毒积累，种性退化等问题。
[0003]非洲菊在国际、国内花丼市场上发展迅速，良种种苗需求大，成本高，目前产业化 生产中使用的非洲菊种苗多为组培苗。一般非洲菊的培养程序是：利用非洲菊花托、花瓣、 嫩叶、茎尖、叶茎等为起始外殖体，脱分化诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织培养于分化培 养基获得不定芽，从而利用不定芽增殖培养，最后将不定芽分割后诱导生根。此操作过程复 杂，周期长，还存在外植体经过愈伤组织途径形成的种苗容易发生变异等问题。
[0004]何俊平等开展了非洲菊品种玲珑再生体系建立的研宄，以非洲菊花托为外植体， 研宄了不同消毒浓度、消毒时间的消毒效果以及激素种类对外植体不定芽分化、增殖及生 根的影响。结果表明，用2%次氯酸钠灭菌IOmin对玲珑外植体有良好的消毒效果。花托 诱导不定芽分化的最佳培养基为MS+10.0 mg/L 6-BA+O. 5mg/L IAA，芽体分化率达60. 5%。 增殖培养基以MS+0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA最为适宜，增殖系数为3. 70。生根培养基以 1/2MS+0. lmg/L NAA最为适宜，生根率达100%【何俊平，涂小云，周艳宝等，非洲菊品种玲 珑再生体系的建立，江苏农业科学，2012,40(7) :56 - 58】。
[0005] 冯新等以非洲菊无菌苗的带节茎段为外植体开展组织培养研宄，结果表明，以 0. 8-1. 2cm的非洲菊带节茎段为外植体，可以不通过愈伤组织途径，直接诱导出芽。非洲菊 带节茎段诱导芽苗的最佳培养基为MS+6-BA 3.0mg/L+NAA0. lmg/L。较高浓度的6-BA有利 于增殖系数的提高，但容易出现玻璃化现象，高浓度的NAA会使芽苗叶色退绿，故最适合的 增殖培养基为MS+6-BA 2. Omg/L+NAA 0. 3mg/L。非洲菊芽苗生根的浓度范围较宽，最佳生根 培养基为1/2MS+NAA 0. 2mg/L【冯新，赖呈纯，赖钟雄，非洲菊离体快繁条件的优化，亚热带 农业研宄，2009,5(4):222-228】。
[0006] 王春彦等为探寻非洲菊离体叶片培养的不定芽再生条件，完善非洲菊离体叶片的 不定芽再生体系，以不同解离方式的离体叶为外植体，进行不同激素浓度配比的试验。结果 表明，除叶柄剪半的外植体无不定芽再生外，另外2种离体叶在叶柄基部均有器官型再生 不定芽和器官发生型再生不定芽。自株丛基部撕脱的离体叶于l/2MS+KT5mg/L+NAA0.1 mg/ L+蔗糖30g/L的培养基中，器官型不定芽的再生率最高达60%~70%。再生比例为1~ 2,器官发生型再生率20%~30%，再生比例1~2。器官型不定芽再生主要集中在接种后 4~12天的时间段内，而器官发生型不定芽形成主要集中在接种后12~24天的时间段内。 若将KT换成不同浓度的6-BA，则以自株丛基部撕脱离体叶的器官型再生率最高达60%~ 70%，再生比例4~5,器官发生型再生率为50%~60%，再生比例为2~3。试验表明： 6-BA和KT二者同属细胞分裂素类物质，二者浓度上的变化对不定芽再生影响不大，而二者 种类不同对不定芽再生差异很大【王春彦，罗凤霞。非洲菊离体叶培养诱导不定芽研宄，中 国农学通报 2011，27(13) :144-148】。
[0007] 利用体细胞胚途径培养非洲菊再生植株，可简化培养程序、缩短培养周期，降低种 苗培育成本，提高种苗质量，降低或避免种苗发生变异。
[0008] 王丽花等以非洲菊的未受精胚珠为试材，研宄胚珠发育时期培养基及供体基因型 对非洲菊的未受精胚珠离体诱导效果的影响，并以根尖染色体计数为基础对获得的33株 再生植株的倍性进行了流式细胞术鉴定。结果表明，胚珠发育时期培养基及供体基因型均 极显著影响愈伤组织和胚状体的诱导频率，且外轮舌状花完全水平展开内轮管状花开放前 ld，剥取的胚珠诱导频率较高；MS中的大量元素和有机物+Heller中的微量元素+1/2铁盐 +0. 5mg/L2,4-D预培养7~IOd有利于启动雌核发育诱导胚状体形成；经胚状体或愈伤组 织2种途径可再生植株【王丽花，瞿素萍，吴学尉等。非洲菊未受精胚珠离体培养影响因素 研宄，西南农业学报，2013, 26 (4) : 1639-1644】。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，以非 洲菊的幼小花托为外植体，不经过愈伤组织阶段，通过体细胞胚途径获得再生植株，可避免 外植体经脱分化诱导愈伤组织再生植株途径而发生突变，为非洲菊的大量离体繁殖优质种 苗及转基因研宄提供基础材料，取材方便，操作简单，又不伤害母株。
[0010] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0011] 一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，包括如下步骤：
[0012] 1)选取非洲菊花蕾，清洗，70%酒精消毒30-60s，0. 1%取(：12消毒8-14min，用无 菌水冲洗，吸干表面水分待用；
[0013] 2)剥去非洲菊花蕾上的花萼和小花序，得到花托，并切去花托的外表层，作为外植 体；
[0014] 3)将步骤2)的外植体整体接种到权利要求1所述的诱导培养基中，弱光照培养 5~8天；
[0015] 所述的用于非洲菊体细胞胚的诱导培养基，包含如下表1所示物质：
[0016]表1
[0017]
【主权项】
1. 一种用于诱导非洲菊体细胞胚的诱导培养基，包括以下组分：
其中，每升诱导培养基添加蔗糖30-40克，琼脂粉6. 5-8. O克；所述诱导培养基pH = 5. 5~6. 5〇
2. -种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 选取非洲菊花蕾，清洗，70%酒精消毒30-60s，0. 1% HgCl2消毒8-14min，用无菌水 冲洗，吸干表面水分待用； 2) 剥去非洲菊花蕾上的花萼和小花序，得到花托，并切去花托的外表层，作为外植体； 3) 将步骤2)的外植体整体接种到权利要求1所述的诱导培养基中，弱光照培养5~8 天； 4) 将步骤3)培养的外植体置于强光照下培养，培养45-50天，获得非洲菊体细胞胚，继 续培养10-15天，体细胞胚逐渐萌发，形成小芽； 5) 将萌发2-3片叶的非洲菊体胚小芽转接于新鲜的分化培养基上，小芽不断生长发 育，叶片数逐渐增多，基部形成根系，获得再生植株。
3. 根据权利要求2所述的通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，其特征在 于，步骤1)中，所述非洲菊花蕾直径为4-7mm，清洗前于4-6°C冷藏处理24-48h。
4. 根据权利要求2所述的通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，其特征在 于，步骤3)中，所述弱光照培养的光照强度为300-5001x，培养温度23-26°C。
5. 根据权利要求2所述的通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，其特征在 于，步骤4)中，所述强光照培养的光照强度为2400-28001x，培养温度23-26°C。
6. 根据权利要求1至5任一项所述的通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法， 其特征在于，步骤5)所述的分化培养基组分如下：
其中，每升分化培养基添加蔗糖25-35克，琼脂粉6. 5-7. O克；所述诱导培养基pH = 5. 5~6. 5〇
【专利摘要】本发明公开了一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法，以非洲菊花托为外植体材料，培养于含6-苄氨基嘌呤、激动素、苯基噻二唑基脲、萘乙酸、毒莠定、水解酪蛋白的体细胞胚诱导培养基中，诱导体细胞胚，体细胞胚萌发后，将其继代培养于分化培养基中，获得再生植株。本发明以非洲菊的花托做外植体，不经过愈伤组织阶段，通过体细胞胚途径获得再生植株，可避免外植体经脱分化诱导愈伤组织再生植株途径而发生突变。利用本发明进行非洲菊组织培养培育种苗，使培养程序简化、培养周期缩短、种苗质量提高，为非洲菊的大量离体繁殖优质种苗及转基因研究提供基础材料。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104719161
【申请号】CN201510127620
【发明人】殷丽青, 孙翊, 李水根, 陆锦明, 张永春, 周音, 范晓芬
【申请人】上海市农业科学院, 上海景香农业科技有限公司, 上海闵行区苗圃
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月23日