织再生成植物 (步骤5 :再生步骤），优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基（MS分 化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物。
[0105] 筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基（MS盐4. 3g/L、MS维他命、干 酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5. 8)上，25°C下培养分 化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2. 15g/L、MS维他命、干酪素300mg/ U蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、植物凝胶3g/L，pH5. 8)上，25°C下培养至约IOcm高，移 至温室培养至结实。在温室中，每天于28°C下培养16小时，再于20°C下培养8小时。
[0106] 2、获得转基因高粱植株
[0107] 参考 Molecular Biology and Genetic Engineering ISSN 2053-5767 的高梁转 化方法。收集高粱品种APKI的种子，并用清水冲洗数次；浸泡于tween-20浸润液中5分钟； 之后用双蒸水悬浮清洗，并在通风橱中干燥；种子表面用70% (v/v)乙醇消毒30秒，紧接 着用0. 1% (WZV)HgCl2消毒6分钟；再用双蒸水清洗5-6次；将种子铺于含有MS基础固体培 养基（pH5. 8)的培养皿中，将培养皿摆放于温度为24±2°C、相对湿度为70%、光周期（光 /暗）为12:12的培养间中；3-5天后，种子发芽，取莖尖外植体浸泡于农杆菌中30分钟； 取出浸泡后的外植体摆放于已灭菌的滤纸上；黑暗条件下共培养72小时；愈伤组织用含有 500mg/L头孢霉素的无菌水清洗3-5次；将清洗后的愈伤组织转移至诱导培养基上培养7 天；再转移至筛选培养基上2-3周，重复筛选3次；抗性愈伤被转移至再生培养基上；再生 出叶片等，将小苗移至生根培养基上，待生根后移栽至温室中。培养基配方参考Molecular Biology and Genetic Engineering ISSN 2053-5767,其中筛选剂根据本发明中转基因载 体所用，更换为潮霉素。由此获得了转入CrylA. 105核苷酸序列的高粱植株、转入Cry2Ab 核苷酸序列的高粱植株和转入CrylA. 105-Cry2Ab核苷酸序列的高粱植株；同时以野生型 高粱植株作为对照。
[0108] 3、获得转基因甘蔗植株
[0109] 转化方法主要参考广西大学2012级硕士李粲学位论文第22页至24页。取甘蔗顶 端新生茎节，去掉蔗梢和叶鞘，留下茎尖生长锥及心叶茎段。在超净工作台上，用75% (v/ v)酒精棉球对表面进行擦拭消毒，用已灭菌的镊子小心剥去心叶外层，取中间5-7cm长的 心叶段，横切成厚度约3mm的薄片接种于诱导培养基上，温度26°C条件下，黑暗培养20天。 挑选生长情况良好的愈伤组织转移到新的MS培养基中预培养4天，再用于转化试验；转化 时，在超净工作台中将待侵染的愈伤组织用已灭菌的镊子夹出，放在干净的滤纸上面静置2 小时，至表面完全干燥，稍有收缩；将干燥的甘蔗愈伤组织放入侵染液中浸泡30分钟，同时 放在摇床上缓慢摇动；将愈伤组织捞出并转移到干净的滤纸上，在超净工作台中完全吹干， 直至愈伤组织表面干燥、无水膜。把愈伤组织块切成0. 6*0. 6cm的小块，之后转移到含有 100 ymol/L乙酰丁香酮（AS)的MR固体培养基中，温度23°C暗培养3天；把侵染后的愈伤组 织夹出，置于滤纸上在超净工作台上吹干，直到材料表面干爽后，将材料转移到含有500mg/ L头孢霉素和潮霉素筛选的分化培养基中；每隔2周更换一次培养基，期间把被污染的愈伤 组织剔除，当幼苗长约3cm高的时候，转移到含有潮霉素筛选剂的生根培养基中诱导生根。 由此获得了转入CrylA. 105核苷酸序列的甘蔗植株、转入Cry2Ab核苷酸序列的甘蔗植株和 转入CrylA. 105-Cry2Ab核苷酸序列的甘鹿植株；同时以野生型甘鹿植株作为对照。
[0110] 第四实施例、用TaqMan验证转基因植株
[0111] 分别取转入CrylA. 105核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植 株和转入CrylA. 105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株的叶片约IOOmg作为样品，用Qiagen 的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测 CrylA. 105基因和Cry2Ab基因的拷贝数。同时以野生型水稻植株作为对照，按照上述方法 进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
[0112] 检测CrylA. 105基因和Cry2Ab基因拷贝数的具体方法如下：
[0113] 步骤11、分别取转入CrylA. 105核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab核苷酸序列 的玉米植株、转入CrylA. 105-Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各 100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
[0114] 步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具 体方法参考其产品说明书；
[0115] 步骤13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓 度；
[0116] 步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为 80-100ng/μ I ；
[0117] 步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知 拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平 均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
[0118] 以下引物和探针用来检测CrylA. 105核苷酸序列：
[0119] 引物 I :GCGCATCCAGTTCAACGAC 如序列表中 SEQ ID N0:8 所示；
[0120] 引物 2 :GTTCTGGACGGCGAAGAGTG 如序列表中 SEQ ID N0:9 所示；
[0121] 探针 I :TGAACAGCGCCCTGACCACCG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
[0122] 以下引物和探针用来检测Cry2Ab核苷酸序列：
[0123] 引物 3 :CTGATACCCTTGCTCGCGTC 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；
[0124] 引物 4 :CACTTGGCGGTTGAACTCCTC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
[0125] 探针 2 :CGCTGAGCTGACGGGTCTGCAAG 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
[0126] PCR反应体系为：
[0127]
[0128]
【主权项】
1. 一种控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，包括将高粱条螟害虫至少与 CrylA. 105蛋白接触。
2. 根据权利要求1所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述CrylA. 105蛋白 存在于至少产生所述Cry 1A. 105蛋白的宿主细胞中，所述高粱条螟害虫通过摄食所述宿主 细胞至少与所述CrylA. 105蛋白接触。
3. 根据权利要求2所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述CrylA. 105蛋白 存在于至少产生所述Cry 1A. 105蛋白的细菌或转基因植物中，所述高粱条螟害虫通过摄食 所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述CrylA. 105蛋白接触，接触后所述高粱条螟 害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对高粱条螟危害植物的控制。
4. 根据权利要求3所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述植物为玉米、高 粱、甘蔗、粟、麻或薏米。
5. 根据权利要求2至4任一项所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述接触 步骤之前的步骤为种植含有编码所述CrylA. 105蛋白的多核苷酸的植物。
6. 根据权利要求1至5任一项所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述 CrylA. 105蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
7. 根据权利要求6所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述Cry 1A. 105蛋白 的核苷酸序列具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
8. 根据权利要求2至7任一项所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述植物 还可以包括至少一种不同于编码所述CrylA. 105蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
9. 根据权利要求8所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸 编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、a -淀粉酶或过氧化物 酶。
10. 根据权利要求9所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸 编码Cry2Ab蛋白。
11. 根据权利要求10所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白 的氨基酸序列具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
12. 根据权利要求11所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷 酸具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
13. 根据权利要求8所述的控制高粱条螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸 为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
14. 一种CrylA. 105蛋白质控制高粱条螟害虫的用途。
15. -种产生控制高粱条螟害虫的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组 中引入编码CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列。
16. -种产生控制高粱条螟害虫的植物繁殖体的方法，其特征在于，包括将由权利要求 15所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，和/或取下由权利要求15所述方法获得的植 株上具有繁殖能力的组织进行培养，从而产生含有编码CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列的 植物繁殖体。
17. -种培养控制高粱条螟害虫的植物的方法，其特征在于，包括： 种植至少一个植物繁殖体，所述植物繁殖体的基因组中包括编码CrylA. 105蛋白的多 核苷酸序列； 使所述植物繁殖体长成植株； 使所述植株在人工接种高粱条螟害虫和/或高粱条螟害虫自然发生危害的条件下生 长，收获与其他不具有编码CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损 伤和/或具有增加的植物产量的植株。
【专利摘要】本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，所述控制高粱条螟害虫的方法包括：将高粱条螟害虫至少与Cry1A.105蛋白接触。本发明通过植物体内产生能够杀死高粱条螟的Cry1A.105蛋白来控制高粱条螟害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法和物理防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治高粱条螟害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。
【IPC分类】A01G1-00, A01G13-00, A01P7-04, A01H5-00, C12N15-84, A01N47-44, A01H4-00, A01H1-02
【公开号】CN104855410
【申请号】CN201510259229
【发明人】张爱红, 杨旭
【申请人】北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月20日