一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基。
【背景技术】
[0002] 国槐（Sophora japonica Linn)，别名家槐、中国槐，属蝶形花亚科、槐属。国槐为 落叶乔木，树势优美，花期较长，极耐修剪，耐寒、耐旱、耐空气污染，又是吉祥、幸福、美好的 象征，是理想的行道树种和庭院绿化树种，而且国槐材质优良，花、果实、根皮、树皮可入药， 种子可榨油制皂，具有较高的经济价值，应用前景十分广阔。目前，国槐是嫁接龙爪槐、金枝 槐、聊红槐、蝴蝶槐等观赏品种的唯一砧木树种，苗木需求大。国槐主要以种子繁殖为主，但 其开花结果具有大小年现象，且种子易受病虫害危害，干瘪、空洞现象严重。常规的育种方 法，依靠种子或扦插繁殖，难以满足生产的需求，基于此有必要对国槐进行组培快繁研究， 提供优质、大量国槐种苗，切实解决国槐苗木需求的瓶颈。
[0003] 国槐古树资源历经千百年的风霜岁月，具有最原始的长寿和抗逆基因，但由于各 种原因，衰老死亡的现象时常发生。就古槐衰败的现状来看，常表现为树干腐朽空洞、冠形 残缺、顶梢枯萎、枝叶凋零、病虫害严重、根系生长不良等等。这些古槐是大自然和前人留给 我们的宝贵的基因资源。
[0004]近年来，利用生物转基因技术培育具有抗性如抗逆、抗虫、抗病等新型品种是国槐 育种的新趋势。到目前为止，对槐树的形成层培养、茎培养、叶片培养、胚培养、未授粉子房 的培养均已获得了完整的植株，对原生质的培养也取得了一定的进展。袁秀云等利用国槐 的子叶和下胚轴产生了不定芽，王喆之等利用花药培养形成了单倍体植株，Han K.H等 (1993，1997)将直径为0.5~1.0cm的枝条消毒后，取出形成层接入愈伤诱导培养基中诱导 愈伤，再将愈伤组织转入分化培养基中，获得了丛生芽，将成苗转入生根培养基中，可诱导 生根。上述的方法存在的缺点：由于国槐为多年生木本植物，其再生率普遍较低，出芽少，直 接影响了国槐的遗传转化。利用植物体胚诱导技术不但能达到保存母株优良基因、快速繁 育的目的，还是提高基因遗传转化或诱变育种的重要途径。目前，有关国槐的体细胞胚诱导 技术研究的较少，可以参考的现有技术比较少。国槐为多年生乔木，基因组庞大，鉴于基因 型的限制，其他物种的体细胞胚诱导的繁殖技术对国槐没有参考价值。在这一方面，即使是 同一物种，不同的品种之间，体胚诱导培养基也不相同。例如，同样是国槐，同一种培养基， 对黄金槐适合，对金叶槐就不适合。
[0005] 专利CN 102499086 A公开了一种刺槐的繁殖方法，以不同胚龄的合子胚为外植 体，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+琼脂为胚性愈伤组织的诱导培养基；以MS基本培养基+MES+谷氨 酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-苄氨基腺嘌呤+蔗糖+琼脂为体细胞胚诱导培养基，通过对愈 伤组织的诱导，形成球形胚后将其转接到MS+水解酪蛋白培养基上，进行体细胞胚的成熟培 养，然后转接到MS基本培养基上萌发形成完整小植株。该专利使用刺槐的不同胚龄的合子 胚(荚果)作为原料进行体细胞培养，不论是刺槐还是国槐，其每年的花期以及果实期都是 固定的两个月左右，所以在进行体细胞培养时具有时间的局限性；国槐的离体叶片、不成熟 的合子胚均可诱导产生胚状体。但是，在山东地区，最近几年的国槐小峰危害非常严重，很 难采到无虫害的完整种子。其次，相对于国槐叶片诱导来说，不成熟合子胚的诱导时间更 长，且诱导出的丛生芽也不如叶片诱导的多。因此，本专利采用取材方便、诱导率高的叶片 进行国槐体胚诱导。国槐与刺槐分属不同的属，物种差别较大，不能参考荚果的体细胞培养 得到叶片的体细胞培养。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁 的成套培养。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基，包括芽启动培养基、试管苗 增殖培养基、体细胞胚诱导培养基、不定芽诱导培养基、壮苗培养基和生根培养基，其中：
[0009] 所述芽启动培养基是指:MS+5. Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8~6.0;
[0010] 所述试管苗增殖培养基是指:MS+1 · 0~2 · Omg/LBA+1 · 0~2 · Omg/LIBA+5 · Og/L琼脂 +30g/L 蔗糖，pH值5.8 ~6.0;
[0011] 所述体细胞胚诱导培养基是指:MS+3.0~5.0mg/L 2,4-D+0.5~1.0mg/L BA+0.5 ~1.0mg/L NAA+0.1~0.5mg/L TDZ+0.5~1.0mg/L谷氨酰胺+0.5~1.0mg/L CH(水解酪蛋 白）+5 · 0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0012] 所述不定芽诱导培养基是指：MS+0 · 1~0 · 5mg/L ΒΑ+0 · 1~0 · 5mg/L ΝΑΑ+0 · 5~ 1 · 0mg/L谷氨酰胺+0 · 5~1 · 0mg/L CH(水解酪蛋白）+5 · 0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~ 6.0；
[0013] 所述壮苗培养基MS+5 · 0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0014] 所述生根培养基是指：1/2MS+0.1 ~0.5mg/L ΙΒΑ+0~0.05mg/L NAA+5.0g/L琼脂+ 20g/L蔗糖，pH值5.8~6.0;所述1/2MS指的是MS全量减半。
[0015] 所述MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
[0016] 所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵 1650mg/L，七水硫酸镁370mg/L，无水磷酸二氢钾170mg/L，二水氯化|丐44〇11^凡，乙二胺四乙 酸二钠37 · 3mg/L，七水硫酸亚铁27 · 8mg/L。
[0017]所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：四水硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌 8 · 6mg/L，硼酸6 · 2mg/L，碘化钾0 · 83mg/L，钼酸钠0 · 25mg/L，硫酸铜0 · 025mg/L，氯化钴 0.025mg/L〇
[0018] 所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：盐酸硫胺素10mg/L，烟酸1.0mg/L， 盐酸吡咳醇I .Omg/L，肌醇100mg/L。
[0019] 有益效果：
[0020] 体细胞胚发生的因素包括内因和外因，内因包括物种和基因型，外因主要涉及培 养基中附加成分的种类和浓度。即使是同一属的植物，由于基因型不同，体细胞胚发生频率 相差极大，原因如下：一是不同基因型体细胞胚发生频率不同，二是不同基因型的最适诱导 条件不同。外植体的生理状态和发育程度都直接影响体细胞胚的发生，一般生理代谢旺盛 而分化程度较低的组织有利于体细胞胚的诱导。
[0021]对于培养基中必需的生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸，还原性氮盐和外源氨 基酸，PH值等其他因素，他们的作用方向、作用程度都不相同。诱导植物体细胞胚发生的因 素众多，但它们的作用程度不尽相同，各种因子通过转录与翻译水平复杂而精确地调控，使 体细胞胚发生的相关基因在时间上和空间上得以选择性激活和表达，只有各种因素配合使 用时才能快速、高效地诱导出体细胞胚。
[0022] 外植体的生理状态和发育程度都直接影响体细胞胚的发生，一般生理代谢旺盛而 分化程度较低的组织有利于体细胞胚的诱导，叶片相较于花芽、花药、子叶、子房中的合子 胚，各种单细胞，游离的小孢子、原生质体以及体细胞胚本身的分化程度都高，做体细胞诱 导的难度也更大。
[0023] 发明人综合考虑影响国槐叶片体细胞胚发生的各种因素，围绕提高再生率、增加 出芽，提高植株移栽成活率等目的，设计了本发明的一套培养基，该培养基相较于其他的培 养基再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到95 %以上，种苗生长健壮，不但可有效解决 优良种苗种质退化问题，还可为国槐遗传转化或诱变育种提供一个理想的受体系统
[0024] 使用本发明的培养基繁殖国槐幼苗，可省去先建立国槐快繁再生体系这一步骤， 大大节省时间。
【附图说明】
[0025] 图1离体叶片划伤口；
[0026] 图2经过暗培养形成胚性愈伤组织；
[0027]图3光照培养形成黏性愈伤组织；
[0028]图4愈伤组织诱导出丛生芽；
[0029] 图5切割丛生芽进行快繁培养；
[0030] 图6长成小苗；
[0031] 图7小苗生根；
[0032]图8移栽到花盆中炼苗；
[0033]图9成活后花盆中单株种植。
【具体实施方式】
[0034]下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0035] 实施例一：
[0036] 选取生长健壮、性状表现优良的单株，取其无病虫害的当年生嫩枝，除去多余的茎 叶，用洗洁精仔细清洗后，流水冲洗1小时，清洗干净后，切割成适当大小准备消毒。
[0037]将试材置于超净工作台上，用70%的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升 汞灭菌lOmin，无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干水分，然后剪取Icm左右带一个腋芽或顶芽 的茎段，垂直插入芽启动培养基(MS+5. Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。每瓶接种3个茎 段，诱导顶芽和腋芽萌发。经过15d的培养，茎段腋芽或顶芽开始萌动，茎尖明显伸长，40d左 右芽点可长成2cm左右的新梢。
[0038]将诱导出的新梢，切下接种在试管苗增殖培养基(MS+2.0mg/L BA+2.0mg/L IBA+ 5. Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。一般茎基部有少量愈伤产生并从愈伤处长出2~3个 小芽，25d继代1次，通过连续几次继代培养，可获得试验所需无菌试管苗。
[0039]以试管苗第3到第6片展开叶片为材料，叶片带短叶柄，叶片背面朝上放置在培养 皿中，用手术刀片垂直于叶片主脉轻轻划3刀，不要划至叶边缘。叶背朝下紧贴培养基放置， 接种在体胚诱导培养基（MS+3.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA+0.5mg/L NAA+0.1mg/L TDZ+ 0 · 5mg/L谷氨酰胺+0 · 5mg/L CH(水解酪蛋白）+5 ·Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8)中。暗培养 30d，诱导体胚的形成。开始，叶片慢慢变硬变厚，逐渐形成愈伤组织，经过30d的暗培养，外 植体变为浅黄色黏状愈伤组织。
[0040] 将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基(MS+0 · 3mg/L ΒΑ+0 · lmg/L ΝΑΑ+0 · 5mg/ L谷氨酰胺+0.5mg/L CH(水解酪蛋白）+5. Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。放入温度白 天25 ± 2°C，夜晚20 ± 2°C，光照强度1000~15001X，光照时间16h/d的培养室中培养，愈伤组 织逐渐增殖。在此环境中培养90d，中间用同种培养基继代两次。继代一次后，愈伤组织出现 绿色的芽点。再继续继代一次，绿色的芽点逐渐长成1~2cm的小苗。
[0041 ]将小苗从基部切下，转入壮苗培养基(MS+5. Og/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中，进 行壮苗培养。培养环境同上。大约培养25d，小苗长至3~4cm高。
[0042]将小苗从基部剪下，去除小苗下半部分的叶片，插入生根培养