异构体(Q)。
[0074]图12示出植物CYP450蛋白质家族中的GAME基因的系统发育树。分枝上的数字指示 支持每个节点的自举迭代的分率。
【具体实施方式】
[0075] 本发明公开参与留体生物碱的生物合成途径的一系列共表达的基因。本发明还公 开这种途径中的关键基因，改变其表达导致随之而来的留体生物碱分布变化。改变留体生 物碱的产生水平可导致对病原体抗性增加的包含升高含量的留体生物碱的改良植物，或在 植物可食用部分中具有降低含量的这些次要化合物的植物并因此产生改良作物。可选地或 另外，控制本发明中揭示的基因的表达可用于产生所希望的留体生物碱，以供未来例如用 于制药工业中。特别是，本发明公开用于产生不含有毒量的在这些植物的可食用部分中通 常存在的有害留体生物碱的茄属作物的手段和方法。本发明的植物因此具有显著的营养和 商业价值。
[0076]
[0077] ^文所用，术语"茄果类"是指茄属植物。
[0078]术语"基因"是指包含产生RNA或多肽所需的编码序列的核酸（例如，DNA或RNA)序 列。多肽可由全长编码序列或其任何部分编码。术语"其部分"当关于基因使用时是指所述 基因的片段。所述片段的大小范围可为几个核苷酸到整个基因序列减去一个核苷酸。因此， "包含基因的至少一部分的核酸序列"可包含基因片段或整个基因。
[0079] 术语"基因"任选地也涵盖结构基因的编码区域并且包括与编码区域在5 '和3 '端 在任一端上距离约lkb相邻定位以使得所述基因对应于全长mRNA的长度的序列。位于编码 区域的5'并且存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区域的3'或下游并且存 在于mRNA上的序列被称为3 '非翻译序列。
[0080]术语"多聚核苷酸"、"多聚核苷酸序列"、"核酸序列"和"分离多聚核苷酸"在本文 可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多聚核苷酸可为RNA或DNA或其杂合物的聚合物， 其为单链或双链的，直链或支链的，并且其任选地含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基。 所述术语也涵盖RNA/DNA杂合物。
[0081 ]术语"RNA干扰"或"RNAi"是指由小的双链RNA介导的基因表达的沉默或降低。它是 在动物和植物中序列特异性、转录后基因沉默的过程，其由在其双链体区域中与沉默基因 的序列同源的抑制性RNA(iRNA)起始。所述基因对于生物体可为内源性或外源性的，整合存 在于染色体中或存在于未整合至基因组中的转染载体中。所述基因的表达被完全或部分抑 制。RNAi也可视为抑制靶RNA的功能;所述靶RNA的功能可为完全或部分的。
[0082] 通常，术语RNAi分子是指包含正义和反义序列的单链或双链RNA分子。例如，RNA干 扰分子可为包含自身互补的正义和反义区域的双链多聚核苷酸分子，其中所述反义区域包 含与靶核酸分子的互补性。可选地，RNAi分子可为具有自身互补的正义和反义区域的单链 发夹多聚核苷酸，其中所述反义区域包含与靶核酸分子的互补性或者它可能是具有两个或 更多个环结构和包含自身互补的正义和反义区域的茎的环状单链多聚核苷酸，其中所述反 义区域包含与靶核酸分子的互补性，并且其中所述环状多聚核苷酸可在体内或体外加工以 产生能够介导RNAi的活性分子。
[0083]术语"互补的"或"其互补序列"在本文用于指在整个互补区域内能够与另一个指 定多聚核苷酸形成Watson和Crick碱基配对的多聚核苷酸的序列。这个术语适用于仅基于 其序列而非任何特定组的将实际结合两个多聚核苷酸的条件的多聚核苷酸对。
[0084] 如本文所用的术语"构建体"是指包括所关注多聚核苷酸的人工组装或分离核酸 分子。一般来说，构建体可包括所关注的一种或多种多聚核苷酸，标记基因在一些情况下也 可以是所关注的基因和适当的调节序列。应理解，构建体中包括调节序列是任选的，例如， 在待使用宿主细胞的调节序列的情况下可能不需要这些序列。术语构建体包括载体，但不 应视为对其进行限制。
[0085] 术语"可操作地连接"是指核酸序列在单一核酸片段上的缔合，以使得一个核酸序 列的功能受到另一个核酸序列的调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达（即，所述 编码序列在所述启动子的转录控制下)时，将所述启动子与所述编码序列可操作地连接。编 码序列可以在正义或反义方向上可操作地连接至调节序列。
[0086] 如本文所用的术语"启动子元件"、"启动子"或"启动子序列"是指位于DNA聚合物 的编码区域的5'端（即在前）的DNA序列。实际上已知的大部分启动子的位置在转录区域之 前。所述启动子充当开关，从而激活基因的表达。如果基因被激活，则据称它被转录，或参与 转录。转录涉及从基因合成mRNA。因此，启动子充当转录调节元件以及提供基因向mRNA转录 的起始位点。
[0087] 如本文所用的术语"增强子"是指可以刺激启动子活性并且可能是启动子的固有 元件或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件的DNA序列。
[0088] 如本文所用的术语"表达"是指功能性最终产物例如mRNA或蛋白质的产生。
[0089] 术语"遗传修饰植物"是指人工包含至少一个遗传修饰细胞的植物。所述遗传修饰 包括内源性基因的修饰，例如通过向所关注的内源性多聚核苷酸或基因引入突变、缺失、插 入、可移位元件等。另外或可选地，遗传修饰包括用异源性多聚核苷酸转化植物细胞。如本 文所用的"遗传修饰植物"和"相应的未被修饰的植物"分别是指包含至少一个遗传修饰细 胞的植物和缺乏所述修饰的相同类型的植物。
[0090]根据本发明的教导，术语"转基因"当关于植物使用时（即，"转基因植物"）是指在 一个或多个其细胞中含有至少一种异源性可转录多聚核苷酸的植物。术语"转基因物质"大 致是指植物或其部分，包括在至少一个细胞中含有至少一种异源性多聚核苷酸的细胞或组 织。如本文所用的"转基因植物"和"相应的非转基因植物"分别是指包含至少一个含有异源 性可转录多聚核苷酸的细胞的植物和缺乏所述异源性可转录多聚核苷酸的相同类型的植 物。
[0091 ]术语"转化体"或"转化细胞"包括原代转化细胞和不考虑转移数目的源自所述细 胞的培养物。由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不会精确相同。在转化体的 定义中包括具有与原始转化细胞中所筛选相同功能性的突变后代。
[0092] 细胞的转化可能是稳定的或短暂的。术语"短暂转化"或"短暂转化的"是指在不存 在外源性多聚核苷酸整合至宿主细胞的基因组中的情况下将一个或多个外源性多聚核苷 酸引入细胞中。与此相反，术语"稳定转化"或"稳定转化的"是指一个或多个外源性多聚核 苷酸引入和整合至细胞基因组中。术语"稳定转化体"是指已经将一个或多个外源性多聚核 苷酸稳定整合至基因组或细胞器DNA中的细胞。应理解，生物体或其用本发明的核酸、构建 体和/或载体转化的细胞可以短暂地以及稳定地转化。
[0093] 基于本发明中公开的共表达的基因阵列，提出了从胆固醇至α-番茄素的途径（图 1)。先前已描述，利用GAME7 (US 2012/0159676)对胆固醇在C22处进行羟基化，接着在C26位 置处进行GAMES羟基化。然后将22,26_二羟基胆固醇在C16处羟基化并且在C22处氧化，接着 利用GAME11和GAME6闭合E环以形成呋喃留烷醇型糖苷配基。这种反应次序得到本发明研究 结果的支持，当沉默GAME11时，显示胆留烷醇型皂苷的累积，缺乏C16处的羟基化和半缩醛E 环（图8A-D)。利用GAME4将呋喃甾烷醇中间体氧化为其26-醛，它是由GAME12催化的氨基转 移的底物。在C22处的氨基氮的亲核攻击导致形成番前登醇(tomatidenol)，将其脱氢为番 茄碱。随后通过GAME1将番茄碱转化为T-Gal(Itkin等，2011，同上hT-Gal反过来又被 GAME17葡糖基化形成γ-番茄素，其被GAME18进一步葡糖基化形成β?-番茄素，其最后通过 GAME2转化为α-番茄素(图1)。
[0094] 本发明现在表明，通过调节生物合成途径中所涉及的酶和/或转录因子的表达，可 以改变留体生物碱、留体糖苷生物碱和任选地留体皂苷的水平。
[0095] 本发明现在表明，出乎意料的是，马铃薯植物中与成簇的酶编码基因共表达的单 一基因的沉默导致留体糖苷生物碱查茄碱和α_茄碱的量显著降低，而这种基因的过度表 达导致这些物质的含量显著增加（图5和图6)。发现这种基因包括包含ΑΡ2结构域的编码序 列，并且因此假定为转录因子，在本文称为GAME9转录因子，由GAME9编码。
[0096] 根据一个方面，本发明提供一种遗传修饰植物，其包含具有选自编码GAME9转录因 子的基因、编码2-酮戊二酸依赖性双加氧酶的基因、编码碱性螺旋-环-螺旋(BHLH)转录因 子的基因或其组合的至少一种基因的改变的表达的至少一个细胞，其中所述遗传修饰植物 相比于相应的未被修饰的植物具有改变含量的至少一种留体生物碱或其糖基化衍生物。
[0097] 虽然在遗传修饰植物中示例，但本发明的教导可进一步能够操纵留体生物碱或其 糖基化衍生物在能够天然合成留体生物碱的任何生物体中的合成。如本文关于2_酮戊二酸 依赖性双加氧酶(GAME11)所示例，操纵本发明的基因表达可进一步导致留体皂苷合成的操 纵。
[0098] 因此，根据其他方面，本发明提供一种遗传修饰生物体，其相比于未被修饰的生物 体包含具有至少一种基因的改变的表达的至少一个细胞，所述至少一种基因选自编码 GAME9转录因子的基因、编码2-酮戊二酸依赖性双加氧酶的基因、编码碱性螺旋-环-螺旋 (BHLH)转录因子的基因或其组合，其中所述遗传修饰生物体相比于相应的未被修饰的生物 体具有改变含量的选自留体皂苷、留体生物碱和其糖基化衍生物的至少一种化合物。
[0099] 出乎意料的是，本发明现在表明，通过调节留体生物碱生物合成途径中所涉及的 酶和/或转录因子的表达，可以严重降低马铃薯块茎中的SGA水平。
[0100] 根据某些实施方案，选自编码GAME9转录因子的基因、编码2-酮戊二酸依赖性双加 氧酶的基因、编码BHLH转录因子的基因或其组合的至少一种基因在遗传修饰植物中的表达 相比于其在相应的未被修饰的植物中的表达得到抑制，从而所述遗传修饰植物相比于相应 的未被修饰的植物包含降低含量的至少一种留体生物碱或其糖基化衍生物。
[0101]根据某些实施方案，所述遗传修饰植物包含无毒量的留体生物碱或其糖基化衍生 物。如本文所用，术语"无毒量"是指以每千克可食用植物部分鲜重计，小于200mg的抗营养 甾体生物碱或糖苷生物碱。根据某些示例性实施方案，所述遗传修饰植物包含不可检测量 的抗营养留体生物碱或其糖基化衍生物。
[0102] 可以使用干扰转录和/或翻译的多种分子(例如，反义、siRNA、核糖酶或脱氧核酶） 在基因组和/或转录物水平上，或者使用例如拮抗剂、裂解多肽的酶等在蛋白质水平上实现 基因表达的下调或抑制。
[0103] 根据某些示例性实施方案，所述遗传修饰植物是转基因植物，其包含含有靶向选 自GAME9、GAME11和BHLH的基因的至少一种沉默分子的至少一个细胞。每种可能性代表着本 发明的另一个实施方案。
[0104] 根据一些实施方案，包含沉默分子的生物体相比于相应的非转基因植物具有升高 含量的至少一种留体皂苷或其衍生物。
[0105] 可以设计为GAME9、GAME11和BHLH中的至少一种的靶标的沉默分子是本领域技术 人员已知的。根据某些实施方案，所述沉默分子包含具有与GAME9基因的区域基本上互补的 核酸序列的多聚核苷酸，所述基因具有以SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6中的任一个所示的核 酸序列。
[0106] 根据某些其他实施方案，所述沉默分子包含具有与GAME11基因的区域基本上互补 的核酸序列的多聚核苷酸，所述基因具有以SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:12中的任一个所示 的核酸序列。
[0107] 根据某些其他实施方案，所述沉默分子包含具有与BHLH基因的区域基本上互补的 核酸序列的多聚核苷酸，所述基因具有以SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:17中的任一个所示的 核酸序列。
[0108] 反义分子
[0109] 反义技术是其中反义RNA或DNA分子与靶标正义DNA或RNA链相互作用的过程。正义 链是5 '至3'mRNA分子或DNA分子。正义链的互补链或镜像链被称为反义链。当反义链与正义 mRNA链相互作用时，双螺旋被识别为细胞外源的并且将被降解，从而导致蛋白质产生减少 或不存在。虽然DNA已经是双链分子，但可以将反义技术应用至其，建立三链体形成。
[0110] RNA反义链可以是催化或非催化的。所述催化反义链(也称为核糖酶)在特定序列 裂解RNA分子。非催化RNA反义链阻断进一步RNA加工。
[0111] 可通过用至少一种反义化合物(包括反义DNA、反义RNA、核糖酶、脱氧核酶、锁定核 酸(LNA)和适配子)转化生物体细胞或组织来实现GAME9、GAME1和BHLH基因或其任何组合的 细胞和/或组织水平的反义调节。在一些实施方案中，所述分子被化学修饰。在其他实施方 案中，所述反义分子是反义DNA或反义DNA类似物。
[0112] RNA 干扰(RNAi)分子
[0113] RNAi是指引入同源性双链RNA(dsRNA)以靶向特定基因产物，从而导致所述基因的 转录后沉默。这种现象首先由Guo和Kemphues(1995,细胞(Cell) ,81(4):611-620)报道于秀 丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)中，并且随后Fire等，（1998,自然（Nature)391: 806-81