[0191] 在与GAME1/SGT1和GAME4共表达的基因中鉴定两种编码假定转录因子的基因（图 4):一种基因，称为GAME9,由番茄ID Solyc01g090340和马铃薯ID PGSC0003DMG400025989 识别。其被描述为乙烯-反应元件结合因子13,并且含有假定AP2结构域。另一种基因是BHLH 转录因子，由番茄ID Solyc03g046570和马铃薯ID PGSC0003DMG400012262识别。 _2] 表7:图2中呈现的在马铃薯和番茄中与已知和假定留体生物碱相关基因共表达的 同源物的细节
[0193] 番前和马铃薯序列获自Sol Genomics Network(solgenomics.net)。共表达的r值 2 0.8。TC0N编号，在RNAsec数据集合中由本发明人给出的重叠群参考名称。N/A，不可用。
[0194]
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[0196] 实施例2: GAME9转录因子的功能分析
[0197] 通过分别向pK7GWIWG2(II)和pJCV52二元载体中引入相应的GAME9DNA片段来产生 GAME9沉默(RNAi)和过度表达(0X)构建体。如先前所述(Itkin等，2011，同上)产生用相应的 GAME9沉默和过度表达构建体转化的转基因番茄和马铃薯系。如Itkin等，（2011，同上）中所 述制备和分析组织提取物。
[0198] 在获自转基因和野生型番茄和/或马铃薯植物的叶和/或块茎的提取物上使用 UPLC-TQ-MS进行甾体生物碱的代谢分析。在从其中编码GAME9的基因沉默的马铃薯系 (GAME9_RNAi系）的马铃薯块茎皮获得的提取物中，观测到α-茄碱和α-查茄碱的降低(分别 是图5Α和图5Β)。来自马铃薯GAME9过度表达系的叶相比于野生型含有较高水平的α-茄碱 (图5C)和α-查茄碱（图5D)。在马铃薯叶中观测到类似累积模式，在RNAi系中具有降低量的 查茄碱和α-茄碱和在过度表达GAME9转录因子的系中具有增加量的这些甾体生物碱（图 6)〇
[0199] 在番茄中，过度表达GAME9转录因子(称为5879)的系的叶提取物相比于其在从野 生型植物获得的叶提取物的量含有较高水平的α-番茄素。相反，GAME9转录因子(5871系）的 表达下调导致番茄素含量显著降低。
[0200] 实施例3: GAME基因的功能表征
[0201 ] GAME 11沉默植物
[0202]病毒诱导基因沉默(VIGS)是允许基因在植物的多种器官中系统性沉默的常用技 术(Dinesh-Kumar S P等，2003.分子生物学方法(Methods Mol Biol)236:287-294)。
[0203]具有VIGS沉默GAME11(簇中的假定双加氧酶）的番茄叶的分析揭示α-番茄素水平 的显著降低和若干胆留烷醇型留体皂苷的累积。
[0204] GAME11双加氧酶在番茄中的沉默导致叶中的α-番茄素水平耗尽(m/z = 1034.5) (图8A)，而胆甾烷醇型甾体皂苷累积[即STS;m/z = 1331.6,1333.6,1199.6,1201.6(主要皂 苷）](图8B)。图8C示出MS/MS谱，11^ = 1331.6(在19.28分钟）。图80示出在19.28分钟洗脱并 累积在GAME11沉默叶中的皂苷的片段化模式。在图8C中，相应的质量信号在MS/MS色谱图上 用星号标记。元素组成和片段化模式显示所述化合物是胆留烷醇型皂苷，缺乏一个羟基和E 环（相比于呋喃留烷醇型皂苷），其导致片段化，涉及多个水分子损失而非E环的互变和 McLafferty 重排。
[0205] GAME 18沉默植物
[0206]通过病毒诱导基因沉默(VIGS)测定法支持GAME18在产生α-番茄素的四糖部分中 的作用，因为GAME18沉默果实累积γ -番茄素，所述γ -番茄素在对照样品中不存在(图9)。
[0207] 在从GAME18沉默的成熟绿色果实提取的代谢物中，对应于γ -番茄素标准物(m/z =740.5)(图9A-C)和γ -番茄素戊糖苷(m/z = 872.5)(图9D-E)，检测到新近累积化合物的 峰。
[0208] GAME 12沉默植物
[0209] GAME12转氨酶在番茄中的沉默导致呋喃甾烷醇型甾体皂苷的累积（图4D)。图10A 示出，GAME12沉默叶累积STS(m/z = 753.4)，而它仅以少量存在于野生型叶中（图10B)。图 10C示出MS/MS谱，m/z = 753.4,在19.71分钟，具有对片段的解释。根据在1^/^实验中观测 到的特征性质量片段所推断的STS在19.71分钟的所示结构描绘于图10D中。
[0210] GAME7 和 GAME8 的功能
[0211] 此外对紧密共表达并定位在基因组中其他地方的基因进行功能上的研究。两种基 因（称为GAME7和GAME8)属于细胞色素 P450的CYP72子家族。GAME7在两种物种（马铃薯和番 茄）中共表达，而StGAME8a和StGAME8b与StSGTl和StGAME4在马铃薯中强烈地共表达。目前， 我们不能证明对于GAME 7的SGA相关活性，但对于GAME6，表明它牵涉于SGA代谢中（US 20120159676)。然而，GAME8沉默番茄叶累积22-(R)_羟基胆固醇（图11A-D)，它是一种所提 出的在SGA生物合成途径中的中间体（图1)ΧΑΜΕ8沉默系相比于野生型累积两种异构体（图 llDhU)-异构体更丰富并且因此最有可能是GAME8的底物。
[0212]特定实施方案的前述描述将充分地揭示本发明的一般性质以使得其他人可以通 过应用当前的知识而在无需过多实验和不偏离一般概念的情况下容易地针对各种应用来 修改和/或改适这些特定实施方案，并且因此，这些改适和修改应该并且打算包括在所公开 实施方案的含义和等效范围内。应理解，本文使用的措辞或术语是用于描述而非限制的目 的。用于实施各种公开功能的装置、材料和步骤可在不偏离本发明的情况下采用多种替代 形式。
【主权项】
1. 一种遗传修饰植物，其包含具有至少一种基因的改变的表达的至少一个细胞，所述 至少一种基因选自编码GAME9转录因子的基因、编码2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(GAME11) 的基因、编码碱性螺旋-环-螺旋(BHLH)转录因子的基因或其组合，其中所述遗传修饰植物 相比于相应的未被修饰的植物具有改变含量的至少一种留体生物碱或其糖基化衍生物。2. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述GAME9转录因子包含与SEQ ID NO: 1具 有至少80%同源性的氨基酸序列。3. 如权利要求2所述的遗传修饰植物，其中所述GAME9转录因子包含以SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO:2中的任一个所示的氨基酸序列。4. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述编码GAME9转录因子的基因包含以SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6中的任一个所示的核酸序列。5. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(GAME11) 包含与SEQ ID NO:7具有至少80%同源性的氨基酸序列。6. 如权利要求5所述的遗传修饰植物，其中所述GAME11包含以SEQ ID N0:7和SEQ ID NO: 8中的任一个所示的氨基酸序列。7. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述编码GAME11的基因包含以SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12中的任一个所示的核酸序列。8. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述BHLH转录因子包含与SEQ ID NO: 13具 有至少80%同源性的氨基酸序列。9. 如权利要求8所述的遗传修饰植物，其中所述BHLH转录因子包含以SEQ ID NO: 13所 示的氨基酸序列。10. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述编码BHLH转录因子的基因包含以SEQ IDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16和SEQIDN0:17中的任一个所示的核酸序列。11. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，所述植物相比于相应的未被修饰的植物包含具 有编码GAME9转录因子的基因、编码GAME 11的基因和编码BHLH转录因子的基因的改变的表 达的至少一个细胞。12. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，所述植物是茄果类作物。13. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述至少一种基因或其任何组合的表达相 比于其在相应的未被修饰的植物中的表达得到抑制，从而所述遗传修饰植物相比于所述相 应的未被修饰的植物包含降低含量的至少一种留体生物碱或其糖基化衍生物。14. 如权利要求13所述的遗传修饰植物，所述植物是转基因植物，其包含含有靶向选自 GAME9、GAME11、BHLH或其组合的基因的至少一种沉默分子的至少一个细胞。15. 如权利要求14所述的转基因植物，其中所述沉默分子选自RNA干扰分子和反义分 子。16. 如权利要求14所述的转基因植物，其中所述沉默分子包含具有与GAME9基因或其互 补序列的区域基本上互补的核酸序列的多聚核苷酸，所述GAME9基因或其互补序列具有以 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6中的任一个所示的核酸序列。17. 如权利要求16所述的转基因植物，其中所述沉默分子靶向具有以SEQ ID NO: 18所 示的核酸序列或其互补序列的GAME9片段。18. 如权利要求14所述的转基因植物，其中所述沉默分子包含具有与GAME11基因或其 互补序列的区域基本上互补的核酸序列的多聚核苷酸，所述GAME11基因或其互补序列具有 以SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12中的任一个所示的核酸序列。19. 如权利要求18所述的转基因植物，其中所述沉默分子靶向具有以SEQ ID NO: 19所 示的核酸序列或其互补序列的GAME11片段。20. 如权利要求14所述的转基因植物，其中所述沉默分子包含具有与BHLH基因或其互 补序列的区域基本上互补的核酸序列的多聚核苷酸，所述BHLH基因或其互补序列具有以 SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 17中的任一个所示的核酸序列。21. 如权利要求14至20中的任一项所述的转基因植物，所述转基因植物是具有降低含 量的至少一种留体糖苷生物碱的茄果类作物，所述至少一种留体糖苷生物碱选自α-茄碱、 查茄碱、澳洲茄边碱、澳洲茄碱、番茄素、番茄碱和其衍生物。22. 如权利要求21所述的转基因植物，所述植物还包含升高量的至少一种留体皂苷。23. 如权利要求21所述的转基因植物，所述植物是马铃薯或茄子植物，其相比于相应的 非转基因植物包含降低含量的至少α_前碱、澳洲前边碱、澳洲前碱和α-查前碱。24. 如权利要求21所述的转基因植物，所述植物是番茄植物，其相比于相应的非转基因 植物包含降低含量的番茄素、番茄碱或其衍生物。25. 如权利要求24所述的转基因植物，所述植物还包含升高量的至少一种胆留烷醇型 皂苷。26. 如权利要求1所述的遗传修饰植物，其中所述至少一种基因或其任何组合的表达相 比于其在相应的未被修饰的植物中的表达有所升高，从而所述遗传修饰植物相比于所述相 应的未被修饰的植物包含升高含量的至少一种留体生物碱或其糖基化衍生物。27. 如权利要求26所述的遗传修饰植物，所述植物是转基因植物，其包含含有编码选自 GAME9转录因子、2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(GAME11)、BHLH转录因子或其组合的至少一种 蛋白质的至少一种可转录多聚核苷酸的至少一个细胞。28. 如权利要求27所述的转基因植物，所述植物包含编码GAME9转录因子的可转录多聚 核苷酸。29. 如权利要求28所述的转基因植物，其中所述可转录多聚核苷酸包含以SEQ ID NO: 3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6中的任一个所示的核酸序列。30. 如权利要求27所述的转基因植物，所述植物包含编码GAME11的可转录多聚核苷酸。31. 如权利要求30所述的转基因植物，其中所述可转录多聚核苷酸包含以SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12中的任一个所示的核酸序列。32. 如权利要求27所述的转基因植物，所述植物包含编码BHLH转录因子的可转录多聚 核苷酸。33. 如权利要求32所述的转基因植物，其中所述可转录多聚核苷酸包含以SEQ ID NO: 14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16和SEQIDN0:17中的任一个所示的核酸序列。34. 如权利要求26至33中的任一项所述的转基因植物，所述转基因植物是具有升高含 量的至少一种留体糖苷生物碱的茄果类作物，所述至少一种留体糖苷生物碱选自α-茄碱、 查茄碱、澳洲茄边碱、澳洲茄碱、番茄素、番茄碱和其衍生物。35. -种降低植物中的至少一种留体生物碱或其糖基化衍生物的含量的方法，其包括 用至少一种沉默分子转化至少一个植物细胞，所述至少一种沉默分子靶向编码选自GAME9
【专利摘要】本发明涉及通过在甾体生物碱的生物合成中所涉及的关键基因而遗传修饰的植物。这些植物具有改变含量的甾体(糖苷)生物碱。提供了具有降低含量的抗营养甾体糖苷生物碱的茄果类作物。
【IPC分类】A01H5/00
【公开号】CN105592692
【申请号】CN201480039130
【发明人】A·阿哈罗尼, M·伊特金
【申请人】耶达研究及发展有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年6月2日
【公告号】EP3003013A1, US20160122775, WO2014195944A1