一种能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法
【专利摘要】本发明公开了一种能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法，包括如下步骤：当父本雄花处于初花期与盛花期过渡期时，于9:00?11:00或15:00?17:00采集父本雄花序；雄花序于22～28℃无菌室内80～160W光照下干燥12～24h干燥，当花药大量爆裂，轻轻抖动有大量黄色花粉散落时即可；干燥的雄花序过花粉筛，收集花粉，装入容器中，封口，置于?60～?100℃或液氮中贮藏。进一步当花粉需萌发时，将贮藏的花粉置于液体培养基中，25～35℃下即可萌发。本发明首次形成了红锥花粉采集、干燥、保存和活力检测的体系，方法简单、迅速且可操作性强，可提高红锥花粉活力，提高红锥人工杂交授粉的成功率。
【专利说明】
一种能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存 方法
技术领域
[0001] 本发明属于林木育种技术领域。更具体地，涉及一种能够提高萌发率及延长花粉 活力的红锥花粉收集保存方法。
【背景技术】
[0002] 红锥（C asia/3〇j〇sis Ajs irix A. DC)又名红黎、赤黎、黎木、刺栲、红栲、红掾栲、 红柯，属壳斗科拷属常绿乔木，树体通直，树尚可达30米，胸径达1米以上，它是我国南亚热 带和亚热带植被常绿阔叶林的优势组成树种，属华南地区重要的乡土阔叶珍贵用材和高效 多用途生态公益林树种。红锥天然分布于东经9502(/~1180(/,北炜1803(/~250(/,主 产地集中于广东、广西、福建南部，其周边分布在云南南部、贵州东南部以及湖南、江西、福 建、海南等省的南部，边缘分布达西藏的墨脱县。红锥具有生长快、材质优、适应广、效益高 等优良特性。其主干通直、材质坚硬、呈红色、耐腐蚀性强、不开裂、不变形、容易加工，是优 质珍贵用材，可供建筑、造船、高档家倶、木制地板、军工用品、体育器材等用。种子富含淀 粉，可炒食、饲料和酿酒，种实、壳斗均富含单宁，可提制栲胶。红锥作为华南地区地带性植 被顶极群落的重要组成部分，既具有良好的生态稳定性和优异的生态效益，又是十分优良 的大径级用材树种。它具有旺盛的生长期和良好的生长速度，一次造林可采伐10次以 上，经营百年经久不衰，且枝叶浓密，混生性能好，可作为用材和水源涵养林进行纯林种植， 亦可为残次林改造、生态公益林改造的混交造林进行推广应用。因此，该树种已成为华南地 区十分重要的乡土阔叶树种，每年用红锥营建的水源涵养林、低效生态公益林改造以及纯 林面积超过3500公顷，目前，在广东、广西、福建等省区已营造各种人工林3万多公顷。已成 为我国南方地区的重要造林树种之一。
[0003] 但是，红锥的整体改良程度不高，改良体系尚未完善，良种供应严重短缺，已成为 制约红锥人工林迅速发展的瓶颈。通过杂交育种，实现优良有效基因的理想重组，一直以来 是新品种培育的最有效、最快速、最安全的途径。特别是林木新品种，目前约80%以上的林木 新品种均依靠杂交育种获得。但是，林木种类繁多且千差万别，导致林木杂交育种技术也复 杂多样，如何高质量地针对完成红锥的育种目标是一大难题;相比其他树种，红椎的杂交更 为复杂，原因在于:红锥的花序较为复杂，由纯雄花序、纯雌花序和两性花序组成，花粉量较 大，花粉粒小而轻，且极易受潮结块，雌花柱头为典型的湿性柱头自然授粉容易授粉失败， 造成空苞率高。
[0004] 因此，花期人工辅助授粉促进座果率，提高种子产量，是较为有效的解决措施。花 粉采集、干燥、贮藏、活力测定技术，是实现该措施必须的技术环节。花粉是种子植物的雄 配子体，在有性繁殖中发挥着重要的作用。花粉的萌发、花粉管生长是植物有性生殖的重要 环节，包含许多复杂的生理过程。花粉以花粉管为通道输送精子完成受精过程，花粉的萌发 和花粉管生长是实现受精作用的关键。
[0005] 红锥的花粉粒小而轻，且极易受潮结块，因此，系统研究红锥不同育种亲本受环境 影响的开花生物学特性，研制有效的花粉采集、干燥、保存技术、去雄隔离技术和高效授粉 促进果实发育技术，形成一套高效的杂种人工控制授粉技术，对实现优良杂交新品种的批 量化生产具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和技术不足，提供一种红锥 花粉采集、干燥、保存以及活力检测技术，能够提高红锥花粉萌发率及延长花粉活力。
[0007] 本发明的目的是提供一种能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存 方法。
[0008] 本发明另一目的是上述能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方 法的应用。
[0009] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 一种能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法，包括如下步骤： 51. 花粉采集：当父本雄花处于初花期与盛花期过渡期时，于9:00-11:00或15:00-17: 〇〇采集父本雄花序，装入硫酸纸袋中； 52. 花粉干燥:将采集的雄花序于22~28°C无菌室内80~160W光照下干燥12~24h干 燥，干燥时注意花粉隔离，防止交叉污染；当花药大量爆裂，轻轻抖动有大量黄色花粉散落 时即可； 53. 花粉贮藏:干燥好的雄花序过花粉筛，去除杂质和花丝，收集花粉，装入容器中，封 口，置于-6〇°C~-100°C或液氮中贮藏。
[0010]进一步地，当需要花粉萌发时，将贮藏的花粉置于液体培养基中，25°C~35°C下萌 发。
[0011]优选地，所述萌发是于35 °C恒温下培养24h萌发。
[0012] 优选地，所述液体培养基的组成为：50~200g/L蔗糖，500~1000 mg/L硼酸，5~ l〇g/L琼脂，余量为水。
[0013]更优选地，所述液体培养基的组成为：鹿糖，1000 mg/l硼酸，8g/L琼脂，余 量为水。
[0014]另外，优选地，上述步骤Sl所述初花期与盛花期过渡期即为当父本雄花50~75%花 丝伸出，且为淡黄色时;或为当父本雄花100%花丝伸出，且为黄色时。
[0015] 更优选地，步骤Sl所述初花期与盛花期过渡期即为当父本雄花50~75%花丝伸出， 且为淡黄色时。
[0016] 优选地，步骤Sl所述采集是于9:00-11:00或15:00-17:00采集当天开的新鲜雄花 序。
[0017] 更优选地，步骤Sl所述采集是于10:00或16:00采集当天开的新鲜雄花序。
[0018] 优选地，步骤S2所述干燥是于25°C无菌室内100W光照下干燥18~24h。
[0019 ]优选地，步骤S3所述贮藏是置于-80°c或液氮中贮藏。
[0020] 优选地，步骤S3所述花粉筛的目数为90~110目。
[0021] 更优选地，步骤S3所述花粉筛的目数为100目。
[0022] 优选地，步骤S3所述过筛的方法是将干燥好的雄花序倒入花粉筛中，边用毛笔轻 轻碾动花序，边轻轻抖动，过筛。
[0023] 优选地，步骤S3所述容器为玻璃瓶。
[0024] 优选地，步骤S3所述封口是用保鲜膜封口。
[0025] 另外，上述方法在提高红锥花粉萌发率和/或延长花粉活力方面，以及在红锥杂交 育种方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。
[0026]本发明具有以下有益效果： 1、本发明红锥花粉干燥方法，在4000LX日光灯下干燥12~24h，相较于以往的室内阴干 或干燥器内干燥，可快速干燥又不破坏花粉活性，又亦可观察到花药完全爆裂时再进行刷 粉过筛，解决了红锥花粉粒小而轻，不易收集这一难题。
[0027] 2、本发明红锥花粉保存方法，分别放置在室温、4°(：、-20°(：、-80°(：、液氮等不同的 环境中贮藏，通过花粉活力检测，检测出随着保存时间不断增长，在液氮中保存的花粉活力 最强，其次是-80°C，显著提高了红锥花粉保存率。
[0028] 3、本方法采用的液体培养基中含有0.8%琼脂、20%蔗糖、1000 ppm的硼酸配制而 成，液体稳定可靠，适合红锥花粉离休培养。
[0029] 4、将干燥后的红锥花粉，借助手腕力量，抖动到固体培养基上，花粉可以与氧气直 接接触，且花粉分布均匀，花粉于35°C恒温下培养24h即可萌发。
[0030] 5、本方法首次形成了红锥花粉采集、干燥、保存和活力检测的体系，方法具有简 单、迅速且可操作性强等特点，可提高红锥人工杂交授粉的成功率，可有效解决红锥种子园 结实大小年的问题，提高种子园的产量和质量，使种子园能够有效地发挥其应有的功能。
【附图说明】
[0031] 图1为5种不同开花状态雄花序。
[0032]图2为不同雄花序状态的邓肯多重比较图（α=0.01)。
[0033]图3为红锥花粉活力采集时间的多重比较图（α=〇. 01)。
[0034]图4为不同干燥方式红锥花粉活力多重比较图（α=0.01)。
[0035] 图5为5种保存方式不同保存天数红锥花粉活力。
[0036] 图6为收集当天的红锥花粉培养24小时后花粉萌发检测结果。
[0037] 图7为本发明方法收集、干燥、封装的红锥花粉。
【具体实施方式】
[0038]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0039]除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0040]实施例1采集时机的研究 1、分别在以下五种雄花序状态下采集红锥雄花序： (1) 状态1(花丝刚刚伸出）； (2) 状态2(花丝伸出20~30%，淡黄色）； (3) 状态3(花丝伸出50~75%，淡黄色）； (4) 状态4(花丝伸出100%，黄色）； (5) 状态5(花丝伸出100%，褐色）。
[0041]不同开花状态雄花序如附图1所示。
[0042] 2、采集的雄花序于25°C室温的无菌培养室内，4000LX日光灯下干燥24h后，将花粉 抖动到固体培养基上(0.8%琼脂+20%蔗糖+1000 ppm)，35 °C恒温下培养24h，用光学显微镜 观察花粉的萌发数，花粉管长度，检测花粉活力。
[0043] 3、结果如表1所示，状态3(花丝伸出50~75%，淡黄色）时采集的雄花序，经过处理 后的花粉活力最高(74.07%)，状态4(花丝伸出100%，黄色)次之，花粉活力为65.59%。
[0044]表1不同雄花序状态采集的红锥花粉活力表
2、采用R-3.2.1软件对雄花序5种状态下的花粉活力进行方差分析，结果如表2所示，不 同雄花序状态对花粉活力有着极显著影响，F值为54.3，p值为4.20e-09，表明不同雄花序状 态采集样本对花粉活力存在极显著差异。
[0045] 进一步的邓肯多重比较图（附图2)显示，在显著水平a=〇.01上，状态3(花丝伸出50 ~75%，淡黄色)和状态4(花丝伸出100%，黄色）显著大于其他状态。
[0046] 弄2红維花鉛活力雄花序状杰的方差分析弄
注：显著水平，***:0.001。
[0047] 实施例2采集时间的研究 1、从早上8:00~18:00,每隔Ih采集一次花粉，合计11次。
[0048] 2、于25 °C室温的无菌培养室内，4000Lx日光灯下干燥24h后，将花粉抖动到固体培 养基上(0.8%琼脂+20%蔗糖+1000 ppm)，35°C恒温下培养24h，用光学显微镜观察花粉的萌 发数，花粉管长度，检测花粉活力。
[0049] 3、结果如表3所示:花粉萌发有两个峰值，分别是10:00和16:00。时间太早，露水未 散尽，花粉易粘着，不利于散粉，花粉萌发率低。正午时分，太阳暴晒，温度较高，也不利于花 粉萌发。因此选择花粉采集时间为9:00~11:00、15:00~17:00。
[0050] 表3不同采集时间的红锥花粉活力测定表
4、采用R-3.2.1软件对不同采集时间下的花粉活力进行方差分析，结果如表4所示，不 同采集时间采集花粉，花粉活力间存在极显著差异，F值为28.63，p值为3.80e-l 5。
[0051]表4不同采集时间红锥花粉活力的方差分析表
进一步的邓肯多重比较图（附图3)显示，在显著水平α=〇.01上，时间点3(10:00)和时间 点9( 16:00)花粉活力最高，显著大于其他时间点。
[0052]实施例3干燥方法的研究 1、将采集的雄花序进行以下9种不同方法的干燥： (1) 自然干燥24h; (2) 烘箱60度24h; (3) IOOw 干燥 6h; (4) IOOw干燥 9h; (5 ) IOOw干燥 12h; (6) IOOw 干燥 18h; (7) 100w干燥 24h; (8) 10〇￥干燥4811; (9) 100w干燥 72h。
[0053]然后进行花粉活力检测，5次重复。
[0054] 2、结果表明：总体上100W日光灯干燥的方法明显优于自然干燥和烘箱60干燥等常 规方法。且100W日光灯干燥12~24h，效果最佳。时间过短，花粉含水量高，造成花粉萌发率； 低时间过长，将花粉活力杀死，亦降低萌发率。
[0055]表5不同干燥方式红锥花粉活力测定表
3、采用R-3.2.1软件对不同干燥方式处理后的红锥花粉活力进行方差分析，结果如表6 所示，F值为26.81，p值为4.30e-12,采用不同干燥方式进行处理，花粉活力存在极显著差 异。
[0056] 表6红锥花粉活力干燥方式的方差分析表
注：显著水平，***:0.001。
[0057] 进一步的邓肯多重比较图（附图4)显示，在显著水平α=0.01上，干燥方式2、6、7、8、 9之间差异显著，干燥方式最好的是7( IOOw干燥24h)。
[0058] 实施例4保存方法的研究 1、将干燥后的花粉装入玻璃瓶中，密封，分别置于以下几种不同保存环境下保存： (1) 室温； (2) 4°C； (3) -20 °C； (4) -80 °C； (5) 液氮。
[0059] 各分别保存Od、5d、I Od、20d、30d、60d时，进行花粉活力检测，5次重复。
[0060] 2、结果如表7和附图5所示，保存5d后，花粉活力均出现不同程度的下降，室温保存 下的花粉活力下降的最快，液氮中保存的花粉活力几乎无变化，-80 °C下降的稍慢。保存30d 后，室温保存的花粉活力已完全丧失，4°C、-20°C保存的花粉，花粉活力降低了 50%，液氮保 存的花粉活力变化较小。
[0061 ]表7不同保存方式的红锥花粉活力测定表
3、采用R-3.2.1软件对不同保存方式下不同保存天数测定的花粉活力进行方差分析， 结果如表8所示，保存方法和保存时间间对花粉活力都有极显著差异。随着保存时间的延 长，不同保存方式亦显示出了明显差异，保存方式5明显优于其他方式，其次是保存方式4， 保存方式1效果最差。
[0062]表8红锥花粉活力保存方式的方差分析表
注：显著水平，***:0.001。
[0063] 实施例5红锥花粉采集、干燥、保存的方法 1、一种能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法，包括如下步骤： 51. 花粉采集：当父本雄花50~75%花丝伸出，且为淡黄色时，于10:00或16:00采集当天 开的新鲜雄花序，装入硫酸纸袋中； 52. 花粉干燥:将采集的雄花序于25°C无菌室内100W光照下干燥18~24h，干燥时注意 花粉隔离，防止交叉污染;当花药大量爆裂，轻轻抖动有大量黄色花粉散落时即可； 53. 花粉贮藏:将干燥好的雄花序倒入100目花粉筛中，边用毛笔轻轻碾动花序，边轻轻 抖动，过筛，去除杂质和花丝，收集花粉，装入小玻璃瓶中，保鲜膜封口，置于液氮中贮藏。 [0064] S4.进一步地，当需要花粉萌发时，将贮藏的花粉置于液体培养基中，35°C恒温下 培养24h萌发;所述液体培养基的组成为：200g//L蔗糖，1000 mg/L硼酸，8g/lJ京脂，余量为 水。
[0065] 2、上述收集当天开的红锥花粉培养24小时，检测花粉萌发，结果如附图6所示。
[0066] 3、经过上述方法收集、干燥、封装的红锥花粉如附图7所示。
[0067] 另外，经过上述方法收集、干燥、封装、贮藏的花粉，保存时间长达60d时花粉活力 尚未发生显著变化。
【主权项】
1. 一种能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法，其特征在于，包括 如下步骤：51. 花粉采集：当父本雄花处于初花期与盛花期过渡期时，于9:00-11:00或15 :00-17: 〇〇采集父本雄花序；52. 花粉干燥：将采集的雄花序于22~28°C无菌室内80~160W光照下干燥12~24h干 燥;当花药大量爆裂，轻轻抖动有大量黄色花粉散落时即可；53. 花粉贮藏:干燥好的雄花序过花粉筛，收集花粉，装入容器中，封口，置于-60~-100 °(：或液氮中贮藏。2. 根据权利要求1所述的能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法， 其特征在于，当花粉需萌发时，将贮藏的花粉置于液体培养基中，25~35°C下萌发。3. 根据权利要求1所述的能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法， 其特征在于，步骤S1所述初花期与盛花期过渡期即为当父本雄花50~75%花丝伸出，且为淡 黄色时;或为当父本雄花100%花丝伸出，且为黄色时。4. 根据权利要求1所述的能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法， 其特征在于，步骤S1所述采集是于9:00-11:00或15:00-17:00采集当天开的新鲜雄花序。5. 根据权利要求1所述的能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法， 其特征在于，步骤S2所述干燥是于25°C无菌室内100W光照下干燥18~24h。6. 根据权利要求1所述的能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法， 其特征在于，步骤S3所述贮藏是置于-80°C或液氮中贮藏。7. 根据权利要求1所述的能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法， 其特征在于，步骤S3所述花粉筛的目数为90~110目。8. 根据权利要求1所述的能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法， 其特征在于，步骤S3所述过筛的方法是将干燥好的雄花序倒入花粉筛中，边用毛笔轻轻碾 动花序，边轻轻抖动，过筛。9. 根据权利要求1所述的能够提高萌发率及延长花粉活力的红锥花粉收集保存方法， 其特征在于，步骤S3所述容器为玻璃瓶，所述封口是用保鲜膜封口。10. 权利要求1所述方法在提高红锥花粉萌发率和/或延长花粉活力方面或在红锥杂交 育种方面的应用。
【文档编号】A01H1/02GK105961377SQ201610391816
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】张卫华, 廖焕琴, 张方秋, 潘文, 林元震
【申请人】广东省林业科学研究院