改进的植酸酶的制作方法

专利名称：改进的植酸酶的制作方法
植酸酶是一种将植酸盐(肌醇六磷酸)水解为肌醇和无机磷酸的酶。已知其是一种有价值的饲料添加剂。
本发明涉及改进的植酸酶，即具有改良特性(如改良的活性特性)的植酸酶，其参照为例如其衍生源或已知的植酸酶。改良的活性特性是指在植酸酶活性的至少一个相关方面进行改良，例如(非-排它列举)pH稳定性，温度稳定性，pH范围，温度范围，比活性(特别是相关于pH和温度的)，底物特异性，底物裂解模式，底物结合，位点特异性，磷酸从谷物中释放的速度和水平，反应速度，植酸盐降解速率)，释放的磷酸所达到的终水平。
改良的活性特性的例子为改良的比活性(如增加，如在pH3，4，5，或6时增加)；改良的pH或温度范围；和/或改良(如增加)的热稳定性，例如当使用差示扫描量热(DSC)测量时增加的解链温度。
本发明还涉及一种制备修饰型蛋白的方法，其中第一步是通过下述步骤a)，b)和c)从多个高度同源序列中测定出一个共有序列a)通过本领域已知的任何标准比对程序对至少3个，优选至少4个氨基酸序列进行比对；b)在氨基酸序列比对的每一位点，评价氨基酸的进化相似性，而共有残基通过本领域公知的标准程序选择，其中为了预测(calculation)共有残基，至少应保证在某指定残基仅出现在比对序列中的两个序列上时，所述程序能确定一个共有残基。然而，如果在所比对的氨基酸序列中有一亚组序列，其彼此间的相似性远高于与其它序列之间的相似性，则仅当其共有序列可以相同于EP 897985所述的方式而确定时，或给该亚组中每一序列分配一个由1除以该亚组序列数所得的权重时，该亚组可用所述预测表示；c)如果该程序未能在指定位置鉴定出共有序列，则可选择任何氨基酸，优选在此位置出现频率最高的氨基酸。
在本发明第二方面，使一个同源序列与该共有序列比对，并使该同源序列中一或多个非共有残基被相应共有残基取代。
优选的，该同源氨基酸序列仅在所述程序于中度严谨条件下可明确定义共有残基的位置上进行氨基酸残基的取代，而在未能于中度严谨条件下确定优选的共有氨基酸的所有位置上，该同源蛋白的氨基酸保持不变。
在发明第三方面，测定了目的蛋白的活性中心，包括共有序列中以及同源蛋白的序列中参与形成活性中心的所有氨基酸残基；随后，将同源蛋白的部分或全部趋异氨基酸残基插入共有序列的骨架中。
在此方法的一个实施方案中，用于比对特定位置之氨基酸的进化相似性的程序为程序″PRETTY″。
蛋白质活性中心可利用蛋白质三维结构分析测定。
同源蛋白如酶家族，限定的蛋白家族的实例为植酸酶家族，例如真菌来源的。
例如，植酸酶的氨基酸序列可通过引入至少一个选自下列的突变或取代被改变E58AF54YD69KI73VD197N K94AT214L R101AE222T N153KE267D V158IR291I A203GR329H S205GS364T V217AA379K A227VG404A V234LP238AQ277EA287HA292QV366IA396SE415QG437A
R451E为了解释这些缩写，举一个例子，突变E58A被解释如下当从该数字减去26，可以得到在如


图1所示共有植酸酶序列或另一被比对的植酸酶序列中的位置或残基号(对应于在
图1所示序列中加入一段26个氨基酸的信号序列)。例如，在E58A中，数字58是指位置号32(58-26＝32)。该数字前的字母，即E，代表该植酸酶中被修饰的氨基酸，其被所述数字之后的氨基酸，即A，取代。
上述氨基酸取代，单独和/或联合，对氨基酸的稳定性有积极影响。
下组突变(即含有选自下组的至少一个突变的植酸酶)也是兴趣所在E58A，D69K，D197N，T214L，E222T，E267D，R291I，R329H，S364T，A379K，G404A；F54Y，I73V，K94A，R101A，N153K，V158I，A203G，S205G，V217A，A227V，V234L，P238A，Q277E，A287H，A292Q，V366I，A396S，E415Q，G437A，R451E；E58A，D69K，D197N，F54Y，I73V，K94A；T214L，E222T，E267DR101A，N153K，V158I；R291I，R329H，S364TA203G，S205G，V217A；A379K，G404AA227V，V234L，P238A，Q277E；A287H，A292Q，V366I，A396S，E415Q，G437A，R451E；T214L，E222T，S364T，V158I，A203G，G404A，A227V，P238A，A396S，G437A，R451E。
宿主细胞的实例为植物细胞，动物细胞，和微生物细胞，例如原核或真核细胞，如细菌，真菌或酵母细胞。真菌宿主的实例为曲霉属菌株，酵母宿主的实例为糖酵母属菌株，汉逊氏酵母属(Hansenula)菌株。
本发明也涉及通过上述任一方法可获得的或已获得的修饰蛋白。
本发明也涉及植酸酶例如(但不限于)共有植酸酶-1的变体或突变蛋白，其中，在图2的氨基酸序列中，已进行至少一个下述取代Q50L，Q50T，Q50G，Q50T-Y51N，Q50L-Y51N或Q50T-K91A。
在上述第三方面，如上所述从同源序列中确定一个共有序列；第二步，在所述共有序列及单个同源蛋白的序列中，测定蛋白活性中心，其包含参与形成活性中心的所有氨基酸残基。所述单个同源蛋白可具有优选的特性如高比活性或酶活性的不同pH依赖性。第三步，将参与形成该同源蛋白活性中心的部分或全部氨基酸残基插入所述共有序列的骨架中。结果产生嵌合蛋白，其具有来自单个蛋白的活性中心以及共有序列的骨架。
蛋白的活性中心可通过例如任何的蛋白三维结构分析来检测，例如通过基于已知蛋白的已知3D-结构的同源模拟。
本发明也提供了通过此方法可获得的或已获得的共有蛋白，特别是含有至少一个示于图2-6，10或21的氨基酸序列的蛋白，或其变体或突变蛋白。此类变体的实例见图7-9。
此类变体或突变蛋白可如欧洲专利申请EP0897010所述定义并制备，例如Q50L，Q50T，Q50G，Q50L-Y51N，或Q50T-Y51N。这些突变如上述定义，或参见图2。当参见图2时，不要求减去所述26个氨基酸的信号肽(例如，在图2中氨基酸序列第50位的“Q50L，”中，氨基酸Q被氨基酸L取代)。
含有本发明植酸酶的食品，饲料，或药物组合物是本发明的另一方面。
在此上下文及本发明的方法中，“此类指定蛋白质家族的至少3个，优选至少4个氨基酸序列”是指3，4，5，6至12，20，50个，或甚至更多的序列可用于比对和比较以产生共有蛋白的氨基酸序列。″指定的蛋白家族的序列″是指被折叠成三维结构的序列，其中α-螺旋，β-折叠和β-转角在同样的位置，使此结构被本领域技术人员称作可高度重叠。此外，这些序列定性了显示同类生物学活性的蛋白质，例如，特定酶类如植酸酶。这类蛋白的三维结构足以允许模拟此家族其它同源蛋白的结构。实施例1举例说明如何操作。本发明中“进化相似性”指根据结构相似性对氨基酸分类的方案，其允许一个氨基酸被另一个氨基酸取代且对整个结构影响最小，这可通过本领域公知的程序如“PRETTY”程序来进行。短语“此程序提供的相似程度…被设置到较小的严谨数”在本发明中指，可将确定本发明所用程序中相似性程度的参数值设定为，使该程序能针对完整氨基酸序列的最多数位置确定一个共有氨基酸，例如在程序PRETTY中，可将THRESHOLD的值选为2或3，PLURALITY的值为2。此外，“1除以这些序列的数目所得的权重”在本发明中指，能限定与用于确定共有序列之其它序列具有较高相似程度的一组序列的序列仅为所述确定提供一个系数，该系数等于1除以该组所有序列的数目。
如上所述，如果所述程序无法选出共有氨基酸，则将最常出现的氨基酸选为共有氨基酸；如果后一种情况不可能，本领域技术人员将从用于比较的所有序列中选出本领域已知其特性可改进目标蛋白热稳定性的氨基酸，方式如Janecek，S.(1993)，生物化学方法(Process Biochem.)28，435-445；Fersht，A.R.和Serrano，L.(1993)，结构生物学最新观点(Curr.Opin.Struct.Biol.)3，75-83；Alber，T.(1989)，生物化学年鉴58，765-798；Matthews，B.W.(1987)，生物化学26，6885-6888；或Matthews，B.W.(1991)，结构生物学最新观点1，17-21。
酶的稳定性与多种工业应用相关。因此，已有大量成功或不太成功的尝试，其通过合理或随机的方法用来改进酶的稳定性，优选热稳定性。
在此我们提供了另一种改进蛋白热稳定性的方式。
本发明提供了一种制备共有蛋白的方法，包括对所谓共有蛋白的几乎所有位置的氨基酸残基进行预测的方法，以及从该序列合成能在原核或真核表达系统中表达的完整基因的方法。
本发明的DNA序列可从编码目的蛋白如植酸酶的基因组或cDNA序列开始构建。例如，可通过体外诱变构建[见，例如Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约]。广泛使用的“定点诱变”最初由Hurchinson和Edgell[病毒学杂志8，181(1971)]所述，其包括使携有所需核苷酸取代的合成寡核苷酸与单链DNA序列中待导入突变的靶区域退火[见Smith，遗传学年鉴19，423(1985)，改良方法见Stanssen等，核酸研究17，4441-4454(1989)中文献2-6。对指定DNA序列的诱变还可通过聚合酶链式反应(PCR)进行。DNA作为起始材料可通过本领域公知的如Sambrook等(分子克隆)所述的方法从各个菌株中分离。
菌株信息参见如EP684313或下述任何保藏单位。黑曲霉(Aspergillusniger)[ATCC 9142]，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)[ATCC 48102]，嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)[ATCC 20186]与烟曲霉(Aspergillusfumigatus)[ATCC 34625]已根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号分别为ATCC74337，ATCC74340，ATCC74338和ATCC74339。但应理解，编码本发明共有蛋白的DNA可以如EP747483或EP897985，或实施例所述，通过本领域公知的方法合成。
序列信息参见如EP684313，或序列数据库如Genbank(Intelligenetics，加利福尼亚，美国)，欧洲生物信息协会(European Bioinformatics Institute)(HinstonHall，剑桥，英国)，NBRF(Georgetown大学，医疗中心，华盛顿特区，美国)和Vecbase(威斯康星大学，生物技术中心，Madison，威斯康星，美国)。
本发明的方法可例如用于改进植酸酶的热稳定性。
一旦获得本发明的全长DNA序列，可通过本领域公知以及Sambrook等(同上(s.a.))所述的方法将它们整合至载体，从而在适当宿主系统中过表达所编码的多肽。但本领域技术人员公知，DNA序列本身可用于转化本发明的适当宿主系统以获得所编码多肽的过表达。适当宿主系统有真菌，如黑曲霉[ATCC9142]或无花果曲霉(Aspergillus ficuum)[NRRL3135]等曲霉属或如Trichoderma reesei等木霉属；或酵母，如酿酒酵母等糖酵母属，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属，或多形汉逊氏酵母(DSM5215)等汉逊氏酵母多形体；或植物，如Pen等，生物/技术11，811-814(1994)所述。本领域技术人员公知此类微生物可来自保藏机构，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，真菌菌株保藏中心(CBS)或德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)或“Industrial Property”[(1991)1，29-40页]所列的任何其它保藏机构。可使用的细菌有大肠杆菌；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属；或变青链霉菌(Streptomyces lividans)等链霉菌属(参见如，Anne和Mallaert，FEMS微生物通讯114，121(1993)。优选大肠杆菌菌株，如大肠杆菌K12菌株，如M15[Villarejo，细菌学杂志120，466-474(1974)所述DZ 291]，HB 101[ATCC 33694]或大肠杆菌SG13009[Gottesman等，细菌学148，265-273(1981)]。
可用于真菌中表达的载体是本领域公知的且述于EP420358，或Cullen等[生物/技术5，369-376(1987)]，Ward[分子工业真菌学，丝状真菌的系统和应用，Marcel Dekker，纽约(1991)]，Upshall等[生物/技术5，1301-1304(1987)]，Gwynne等[生物/技术5，71-79(1987)]，或Punt等[生物技术杂志17，19-34(1991)]；用于酵母中表达的载体见Sreekrishna等[基础微生物学杂志28，265-278(1988)，生物化学28，4117-4125(1989)]，Hitzemann等[自然293，717-722(1981)]或EP183070，EP183071，EP248227，或EP263311。用于大肠杆菌中表达的合适载体见Sambrook等[同上]，Fiers等[第8次国际生物技术专题讨论会论文集，法国微生物协会(Soc.Franc.deMicrobiol.)，巴黎(Durand等编)，680-697页(1988)]，Bujard等[酶学方法155，416-433(1987)]，或Stuber等[免疫学方法，Lefkovits和Pemis编，AcademicPress，Inc.，卷IV，121-152(1990)]。用于芽孢杆菌中表达的载体是本领域公知的且述于如EP207459，EP405370，美国国家科学院院报，81，439(1984)或Yansura和Henner，酶学方法185，199-228(1990)。用于多形汉逊氏酵母中表达的载体是本领域公知的且述于如Gellissen等，生物技术9，291-295(1991)。
已携有调控元件如启动子的载体，或本发明的DNA序列可通过改造而含有这种元件。可使用的合适启动子元件是本领域公知的，例如Trichoderma reesei的cbhl-启动子[Haarki等，生物技术7，596-600(1989)]或pkil-启动子[Schindler等，基因130，271-275(1993)]；用于米曲霉的amy-启动子[Christensen等，Abstr.19th Lunteren Lectures on Molecular GeneticsF23(1987)，Christensen等，生物/技术6，1419-1422(1988)，Tada等，分子普通遗传学229，301(1991)]；用于黑曲霉的glaA-启动子[Cullen等，生物/技术5，369-376(1987)，Gwyrme等，生物/技术5，713-719(1987)，Ward，分子工业真菌学，丝状真菌的系统和应用，Marcel Dekker，纽约，83-106(1991)]，alcA-启动子[Gwynne等，生物技术5，718-719(1987)]，sucl-启动子[Boddy等，现代遗传学24，60-66(1993)]，aphA-启动子[MacRae等，基因71，339-348(1988)，MacRae等，基因132，193-198(1993)]，tpiA-启动子[McKnight等，细胞46，143-147(1986)，Upshall等，生物/技术5，1301-1304(1987)]，gpdA-启动子[Punt等，基因69，49-57(1988)，Punt等，生物技术杂志17，19-37(1991)]以及pkiA-启动子[de Graaff等，现代遗传学22，21-27(1992)]。可用于酵母中表达的适当启动子是本领域已知的，例如pho5-启动子[Vogel等，分子细胞生物学，2050-2057(1989)；Rudolf和Hinnen，美国国家科学院院报(Proc.Nati.Acad.Sci.)84，1340-1344(1987)]或用于酿酒酵母中表达的gap-启动子；用于在巴斯德毕赤氏酵母中表达的aoxl-启动子[Koutz等，酵母5，167-177(1989)；Sreekrishna等，基础微生物学杂志28，265-278(1988)]；或用于在多形汉逊氏酵母中表达的FMD启动子[Hollenberg等，EPA0299108]或MOX-启动子[Ledeboer等，核酸研究13，3063-3082(1985)]。
因此含有本发明DNA序列的载体，优选使所述DNA序列在细菌或真菌或酵母中表达的载体，以及所述转化的细菌或真菌或酵母，均是本发明的一部分。
本发明还提供一种允许蛋白，尤其本发明植酸酶，高表达的系统，例如重组汉逊氏酵母菌株。为此，可根据用于表达的生物如本案中的酵母(见实施例1)的密码子频率表来选择此类蛋白的密码子。随意地，信号序列的密码子可如实施例1中具体案例所述选择；这意味着密码子频率表是依据编码指定蛋白家族的氨基酸序列的DNA序列中所用的密码子来制备。然后从用于表达的宿主细胞的密码子频率表中选择用于信号序列之DNA序列的密码子，其中利用了在两个表中出现频率相当的密码子。
一旦这些DNA序列被适当培养基中的适当宿主细胞表达后，所编码的蛋白可通过本领域公知的蛋白纯化方法或就植酸酶而言EP420358中的方法，在被分泌到培养基中的情况下从培养基中分离，或在蛋白存在于胞内的情况下从宿主细胞中分离。因此，本发明多肽的制备方法，所述方法产生的多肽，或由本发明DNA序列编码的多肽，都是本发明的一部分，其中所述方法包括将上述转化的细菌或宿主细胞在适当条件下培养，和从中回收所述多肽。
本发明的多肽一经获得，可通过本领域公知的任何试验，按其具有农业用途的特性进行鉴定。
通常，本发明的多肽可用于任何具体领域，例如植酸酶可用于将肌醇聚磷酸如植酸盐转化为肌醇和无机磷酸。
此外，本发明的多肽可在药用组合物或复合食品或饲料的制备方法中使用，其中将所述组合物的成分与至少一种本发明的多肽混合。因此，含有至少一种本发明多肽的复合食品或饲料或药用组合物也是本发明的一部分。本领域技术人员熟知其制备方法。这类药用组合物或复合食品或饲料可进一步含有通常用于此目的且本领域公知的添加剂或成分。
本发明进一步提供了减少动物肥料中植酸盐水平的方法，其中给动物喂食所述饲料组合物，其量可将饲料中所含植酸盐有效转化为低级肌醇磷酸和/或肌醇，和无机磷酸。
在上下文中，植酸酶是一种具有植酸酶活性的酶或多肽。植酸酶可为例如肌醇六磷酸的磷酸水解酶，例如(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8)与(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)。
在一个实施方案中，通过SDS-PAGE评估，植酸酶被纯化，即纯度至少85％，优选至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％。将植酸酶分离。植酸酶活性可通过本领域公知的任何植酸酶试验来测定，例如下述试验(见实施例9)。试验温度可以是真实(actual)植酸酶的最适温度，试验pH可以是真实植酸酶的最适pH。
试验温度可在例如20-90℃，或30-80℃，或35-75℃的范围内选择，例如37℃，50℃，60℃，或70℃。
试验pH可在例如pH2-9，或3-8，或3-6的范围内选择，例如试验的pH值可选择3，4，5，6，或7。
测定氨基酸序列的同源性(或多肽或氨基酸同源性)作为两个序列相同的程度。这可通过本领域已知的预测机程序适当测定，例如GCG软件包所提供的GAP程序[威斯康星软件包程序手册，遗传学预测机组，575 ScienceDrive，Madison，威斯康星53711，美国]，也参见Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-453]。在9.1版本中，为了进行多肽序列对比，将长度权重设为0，缺口权重设为3.0。
两个DNA(核酸)序列之间的同一性或同源性的程度可通过本领域已知的预测机程序测定，例如GCG软件包所提供的GAP程序[威斯康星软件包程序手册，遗传学预测机组，575 Science Drive，Madison，威斯康星53711，美国]来测定，也参见Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-453]。在9.1版本中，为了进行DNA序列对比，使用GAP并使用下列设置缺口产生罚分为50，缺口延伸罚分为3。
用于测定指定DNA或RNA序列是否与特定核苷酸和寡核苷酸探针杂交的适当实验条件包括，将含有所述DNA或RNA片段、用于检测杂交的膜在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠；(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港，纽约)中预浸渍10min，并使该膜在5×SSC，5×Denhardt′s溶液，0.5％SDS和100μg/ml超声处理的变性鲑精DNA(Sambrook等1989)中预杂交，然后在含10ng/ml随机-引发的32P-dCTP-标记探针(比活性＞1×109cpm/μg)的相同溶液中于约45℃杂交12小时(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)生物化学年鉴1326-13)。
然后将此膜在2×SSC，0.5％SDS中洗涤两次，每次30分钟，温度为至少55℃(低严谨度)，至少60℃(中度严谨)，至少65℃(中/高严谨度)，至少70℃(高严谨度)，或至少75℃(非常高严谨度)。
在这些条件下与所述寡核苷酸探针杂交的分子可通过x-线胶片检测。
具有改变的热稳定性的植酸酶，或热稳定植酸酶，均属于本发明。“热稳定”植酸酶是Tm(解链温度)——经差示扫描量热(DSC)对植酸酶蛋白质的测定——至少为65℃的一种植酸酶。DSC可使用恒定加热率，例如10℃/min。在另外的实施方案中，Tm至少为66，67，68，69，70，71，72，73，74或75℃。或，Tm等于或低于150℃，或等于或低于145，140，135，130，125，120，115或110℃。因此，Tm间距的实例为65-150℃，66-150℃，-(等)-75-150℃；65-145℃，66-145℃，-(等)-75-145℃；65-140℃，-(等)-75-140℃；-(等)-65-110℃，66-110℃，-(等)-75-110℃。
Tm的具体范围如下65-110℃；70-110℃；70-100℃；75-95℃，或80-90℃。
在以下实施例9和10中，描述了经DSC对Tm的测定，且显示了多种植酸酶的Tm。
还显示了最适pH，因为——作为另一种方式——热稳定的植酸酶可被定义为一种具有至少60℃的最适温度的植酸酶。优选该最适温度在pH5.0或5.5时的底物植酸盐或植酸上测定。实施例9描述了一例植酸酶试验，其包括对单位的定义。
在另外的实施方案中，最适温度为至少61，62，63，64，65，66，67，68，69或70℃。在一个具体实施方案中，最适温度等于或低于140℃，或等于或低于135，130，125，120，115，110，105或100℃。因此，最适温度的间距可以为60-140℃，61-140℃，-(等)-70-140℃；60-135℃，61-135℃，-(等)-70-135℃；60-130℃，-(等)-70-130℃；-(等)-60-100℃，61-100℃，-(等)-70-100℃。
在更具体地描述本发明之前，对所附图表的简单解释如下。
图1共有植酸酶-1序列的图样。字母表示氨基酸残基的单字母代号。以下序列用于比对土曲霉(Aspergillus terreus)9A-1的phyA[Mitchell，D.B.，Vogel，K.，Weimann，B.J.，Pasamontes，L.&van Loon，A.P.G.M.(1997)。组氨酸磷酸酶的植酸酶亚家族来自土曲霉和嗜热毁丝霉的两个新植酸酶的基因的分离，微生物学143，245-252]；始于氨基酸(aa)27；SEQ ID NO1]；土曲霉cbs116.46的phyA[EP897985]。一种在动物实验中表现优良的烟曲霉耐热植酸酶。植酸酶的优化和天然变异性。在植酸盐和植酸酶的生物化学(Rasmussen，S.K；Raboy，V.；Dalb～ge，H.和Loewus，F编；KluwerAcademic Publishers)；始于aa27；SEQ ID NO2；黑曲霉泡盛变种的phyA(Piddington等(1993)基因133，55-62；始于aa27；SEQ ID NO3)；黑曲霉T213的phyA(EP897985)；始于aa27；SEQ ID NO4)；黑曲霉NRRL3135株的phyA[van Hartingsveldt，W.，van Zeijl，C.M.F.，Harteveld，G.M.，Gouka，R.J.，Suykerbuyk，M.E.G.，Luiten，R.G.M.，van Paridon，P.A.，Selten，G.C.M.，Veenstra，A.E.，van Gorcom，R.F.M.和van den Hondel，C.A.M.J.J.(1993)，黑曲霉植酸酶编码基因(phyA)的克隆、鉴定和过表达。基因127，87-94；始于aa27；SEQ ID NO5]；烟曲霉ATCC 13073的phyA(Pasamontes，L.，Haiker，M.，Wyss，M.，Tessier，M.和van Loon，A.P.G.M.(1997)烟曲霉耐热植酸酶的克隆、纯化和鉴定，应用环境微生物学63，1696-1700；始于aa25；SEQ ID NO6)；烟曲霉ATCC32722的phyA(EP897985)；始于aa27；SEQ ID NO7)；烟曲霉ATCC58128的phyA(EP897985)；始于aa27；SEQ ID NO8)；烟曲霉ATCC26906的phyA(EP897985)；始于aa27；SEQ ID NO9)；烟曲霉ATCC32239的phyA(EP897985)；始于aa30；SEQ ID NO10；Emericella nidulans的phyA[Pasamontes，L.，Haiker，M.，HenriquezHuecas，M.，Mitchell，D.B.和vanLoon，A.P.G.M.(1997a).Emericella nidulans和嗜热真菌嗜热踝节菌的植酸酶的克隆，生物化学和生物物理学学报1353，217-223；始于aa25；SEQID NO11]；嗜热踝节菌的phyA(Pasamontes等，1997a；始于aa24；SEQ IDNO12)；以及嗜热毁丝霉的phyA(Mitchell等，1997；始于aa19；SEQ IDNO13)。比对利用程序PILEUP预测。缺口的位置经手工修正(refine)。比对中指定位置上的大写氨基酸残基属于确立共有残基的氨基酸的集合。最终构建的共有植酸酶(Fcp)的氨基酸序列(SEQ ID NO14)以粗体显示在预测的共有序列的下方。所预测的共有序列中的缺口根据实施例1所述原则手工补齐。
图2共有植酸酶-1基因(fcp)的DNA序列(SEQ ID NO15)和用于基因构建的引物序列。预测的氨基酸序列(
图1，SEQ ID NO14)用程序BACKTRANSLATE[Devereux，J.，Haeberli，P.& Smithies，O.(1984)，VAX序列分析程序组，核酸研究，12，387-395]转化为DNA序列，还有高表达酵母基因的密码子频率表(GCG程序包，9.0)。土曲霉cbs116.46的植酸酶的信号肽被融合到N-末端。图2所示氨基酸序列为SEQ ID NO16。粗体碱基表示用于产生基因的寡核苷酸序列。各个寡核苷酸的名字被交替注释在序列的上方或下方。加下划线的碱基代表基因的起始和终止密码子。斜体字表示的碱基代表被导入的两个EcoRI位点。
图3五种担子菌植酸酶的比对和共有序列。字母表示氨基酸残基的单字母代号。来自Paxillus involutus的植酸酶的氨基酸序列，phyA1(始于aa21；SEQ ID NO17)；以及phyA2(始于aa21，WO98/28409；SEQ ID NO18)；绒毛栓菌(始于aa24，WO98/28409；SEQ ID NO19)；平田头菇(始于aa19，WO98/28409；SEQ ID NO20)；和Peniophora lycii(始于aa21，WO98/28409；SEQ ID NO21)，从圆括号中的氨基酸残基开始，用于称作“Basidio”的相应共有序列(实施例2；SEQ ID NO22)的比对和预测。比对用程序PILEPUP来进行，缺口的位置经手工修正。共有序列用程序PRETTY预测。当两种P.involutus植酸酶的权重为0.5时，所有其它基因采用1.0的权重以便共有序列的预测。在所述程序不能测定共有残基之处，Basidio序列含有一个破折号(dash)。比对中指定位置的大写氨基酸残基代表能确定共有残基的氨基酸集和。
图4共有植酸酶-10氨基酸序列的图样。将Thermomyces lanuginosus植酸酶的序列[Berka，R.M.，Rey，M.W.，Brown，K.M.，Byun，T.和Klotz，A.V.(1998)，嗜热真菌Thermomyces lanuginosus的一个植酸酶基因的分子鉴定和表达，应用环境微生物学64，4423-4427；SEQ ID NO23]和五种担子菌植酸酶的共有序列(SEQ ID NO22)添加至
图1的比对中，由程序PRETTY预测出一个改进的共有序列。此外，略去黑曲霉T213的氨基酸序列，给剩余两种黑曲霉植酸酶序列分配权重0.5。详见实施例2。
图5共有植酸酶-10的DNA和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO25，和SEQ ID NO26)。氨基酸序列用单字母表示在相应DNA序列上方。用于装配基因的寡核苷酸的序列用粗体字母表示。不同于共有植酸酶-1的寡核苷酸和氨基酸带下划线。fcp10基因用以下寡核苷酸装配CP-1，CP-2，CP-3.10，CP-4.10，CP-5.10，CP-6，CP-7.10，CP-8.10，CP-9.10，CP-10.10，CP-11.10，CP-12.10，ap13.10，CP-14.10，CP-15.10，CP-16.10，CP-17.10，CP18.10，CP19.10，CP-20.10，CP-21.10，以及CP-22.10。新合成的寡核苷酸进一步用数字10标记。植酸酶相对于共有植酸酶-1含有以下32个取代Y54F，E58A，D69K，D70G，A94K，N134Q，I158V，S187A，Q188N，D197N，S204A，T214L，D220E，L234V，A238P，D246H，T251N，Y259N，E267D，E277Q，A283D，R291I，A320V，R329H，S364T，I366V，A379K，S396A，G404A，Q415E，A437G，A463E。带下划线的突变显示了当作为共有植酸酶-1中的单突变被测试时对共有植酸酶-1的稳定效应。
图6共有植酸酶-11(SEQ ID NO27)的比对。与共有植酸酶-10对照，设计共有植酸酶-11的氨基酸序列时，所有担子菌植酸酶均作为独立序列使用，每一序列分配一个0.2的权重。此外，黑曲霉T213的氨基酸序列再次用于该比对中。
图7共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO28和SEQ ID NO29)。氨基酸序列用单字母代码表示在DNA序列之上。被取代的氨基酸残基(相对于共有植酸酶-1)带下划线。基因的终止密码子用星号(*)标记。
图8共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO30和SEQ ID NO31)。氨基酸序列用单字母代码表示在DNA序列之上。被取代的氨基酸残基(相对于共有植酸酶-10)带下划线。基因的终止密码子用星号(*)标记。
图9烟曲霉ATCC13073植酸酶α-突变体Q51T的DNA和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO32和SEQ ID NO33)。氨基酸序列用单字母代码表示在DNA序列之上。被取代的氨基酸残基(相对于烟曲霉ATCC13073的植酸酶)带下划线。基因的终止密码子用星号(*)标记。
图10共有植酸酶-7的DNA和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO34和SEQ ID NO35)。氨基酸序列用单字母代码表示在DNA序列之上。用于装配基因的寡核苷酸的序列用粗体字母表示。被取代的寡核苷酸和氨基酸(相对于共有植酸酶-1)带下划线，相应的三联密码用小写字母表示。fcp7基因由下列寡核苷酸装配CP-1，CP-2，CP-3，CP-4.7，CP5.7，CP-6，CP-7，CP-8.7，CP-9，CP-10.7，CP-11.7，CP-12.7，CP13.7，CP-14.7，CP-15.7，CP-16，CP-17.7，CP-18.7，CP-19.7，CP-20，CP-21，和CP-22。新合成的寡核苷酸进一步用数字7标记。与原始的共有植酸酶-1相比，共有植酸酶-7含有以下24个取代S89D，S92G，A94K，D164S，P201S，G203A，G205S，H212P，G224A，D226T，E255T，D256E，V258T，P265S，Q292H，G300K，Y305H，A314T，S364G，M365I，A397S，S398A，G404A，和A405S。
图11共有植酸酶-1和共有植酸酶-10的差示扫描量热(DSC)。将蛋白样品浓缩至约50-60mg/ml，对10mM乙酸钠，pH5.0强力透析。以10℃/min的恒定加热速率加热到95℃。共有植酸酶-10(上图)的DSC产生85.4℃的解链温度，其比共有植酸酶-1(78.1℃，下图)的解链温度高7.3℃。
图12共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T和共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的差示扫描量热(DSC)。将蛋白样品浓缩至约50-60mg/ml，对10mM乙酸钠，pH5.0强力透析。以10℃/min的恒定加热速率加热到95℃。共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T(上图)的DSC产生88.6℃的解链温度，而共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的解链温度被测定为89.3℃。
图13共有植酸酶-1、共有植酸酶-10和共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T的最适温度比较。为了测定最适温度，在37-86℃之间的一系列温度下进行实施例9的植酸酶标准试验。用酿酒酵母的稀释上清进行检测。上清的其它组份对最适温度的测定没有影响△，共有植酸酶-1；◇，共有植酸酶-10；■，共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T。
图14共有植酸酶-10及其突变体thermo[3]-Q50T和thermo[3]-Q50T-K91A的依赖pH的活性图谱和底物特异性。植酸酶活性通过在适当缓冲液中不同pH的标准试验测定(见实施例9)。图a)显示了共有植酸酶-10(□)，共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T(●)和共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A(△)的依赖pH的活性图谱，图b)显示了通过在标准试验中用所述化合物置换植酸测得的相应底物特异性；空白栏，共有植酸酶-10；灰色栏，共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T；黑色栏，共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A。数字对应下列底物1.植酸；2.对硝基苯磷酸；3.苯基磷酸；4.果糖-1，6-二磷酸；5.果糖-6-磷酸；6.葡萄糖-6-磷酸；7.核糖-5-磷酸；8.DL-甘油-3-磷酸；9.甘油-2-磷酸；10.3-磷酸甘油酸；11.磷酸烯醇丙酮酸；12.AMP；13.ADP；14.ATP。
图15共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T和共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的依赖pH的活性图谱和底物特异性。植酸酶活性通过在适当缓冲液中不同pH的标准试验测定(见实施例9)。图a)显示了Q50T变体(■)和Q50T-K91A变体(●)的依赖pH的活性图谱，图b)显示了通过在标准试验中用所述化合物置换植酸测得的相应底物特异性(空白栏，共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T；实心栏，共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A)。底物列在
图14的图说明中。
图16共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T和共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的差示扫描量热(DSC)。将蛋白样品浓缩至约50-60mg/ml，对10mM乙酸钠，pH5.0强力透析。以10℃/min的恒定加热速率加热到95℃。共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T(上图)的DSC产生84.7℃的解链温度，而共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的解链温度被测定为85.7℃。
图17共有植酸酶-1，共有植酸酶-1和共有植酸酶-1-thermo-[3]和共有植酸酶-1-thermo[8]的最适温度的比较。为了测定最适温度，在37-86℃之间的一系列温度下进行植酸酶标准试验。用来自转化的酿酒酵母菌株的纯化蛋白进行检测。○，共有植酸酶-1；□，共有植酸酶-1-thermo[3]；▲，共有植酸酶1-thermo[8]。
图18共有植酸酶-1，共有植酸酶-7，和黑曲霉NRRL3135植酸酶的依赖pH的活性和底物特异性的比较。植酸酶活性通过在适当缓冲液中不同pH的标准试验测定(见实施例9)。图a)显示了植酸酶-1(■)，黑曲霉NRRL3135植酸酶(○)，和共有植酸酶-7(▲)的依赖pH的活性图谱，图表b)显示了通过在标准试验中用所述化合物置换植酸测得的相应底物特异性(黑色栏，黑曲霉NRRL 3135植酸酶；空白栏，共有植酸酶-1；灰色栏，共有植酸酶-7)。底物列在
图14的图说明中。
图19烟曲霉ATCC 13073的植酸酶及其含有氨基酸置换(F55Y，V100I，F114Y，A243L，S265P，和N294D)的稳定型α-突变体的差示扫描量热(DSC)。
将蛋白样品浓缩至约50-60mg/ml，对10mM乙酸钠，pH5.0强力透析。以10℃/min的恒定加热速率加热到95℃。烟曲霉ATCC 13073植酸酶(上图)的DSC显示为62.5℃的解链温度，而所述α-突变体的解链温度被测定为67.0℃。
图20烟曲霉13073的野生型植酸酶，其α-突变体，以及其进一步稳定的α-突变体(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)的最适温度比较。为了测定最适温度，在37-75℃之间的一系列温度下进行植酸酶标准试验。用转化的酿酒酵母菌株的稀释上清进行检测。上清的其它组份对最适温度的测得没有影响。○，烟曲霉ATCC 13073植酸酶；▲，烟曲霉ATCC 13073α-突变体；□，烟曲霉ATCC 13073植酸酶α-突变体-(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)；■，烟曲霉ATCC 13073α-突变体(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)-Q51T-K92A。Q51T和K92A分别对应于共有植酸酶-1的取代Q50T和K91A。
图21共有植酸酶-12的氨基酸序列(consphyl2；SEQ ID NO36)，其含有从″basidio″共有序列转移到共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的多个活性位点残基(加下划线)。
图22共有植酸酶-3-thermo[11]-Q50T的DNA和氨基酸序列。氨基酸用单字母代码表示在相应DNA序列之下。
图23共有植酸酶-3-thermo[11]-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列。氨基酸用单字母代码表示在相应DNA序列之下。
图24共有植酸酶-10-thermo[5]-Q50T的DNA和氨基酸序列。氨基酸用单字母代码表示在相应DNA序列之下。
图25共有植酸酶-10-thermo[5]-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列。氨基酸用单字母代码表示在相应DNA序列之下。
本文所述的生产植酸酶的微生物菌株，即Paxillus involutus CBS100231；Peniophora lycii CBS 686.96；平田头菇CBS900.96；以及绒毛栓菌CBS100232分别分离于来自丹麦；丹麦；丹麦；和瑞典的天然样品(Uppsala保藏中心。分别于1992年11月；1993年10月；1995年6月；和1995年11月保藏。
实施例1 共有植酸酶-1共有植酸酶-1(真菌共有植酸酶，fcp)的氨基酸序列如EP897985中实施例1和2所述设计并预测。下表1显示了用于设计共有植酸酶-1的植酸酶氨基酸序列的起点和权重。进一步将共有植酸酶-1序列如EP897985的实施例3所述转化为DNA序列，并如EP897985的实施例4所述构建和克隆共有植酸酶-1基因。
表1 植酸酶氨基酸序列的起点和权重土曲霉9A-1的phyA，aa27，权重0.5(Mitchell等，1997)
土曲霉cbs116.46 phyA，aa27，权重0.5(EP897985)黑曲霉泡盛变种phyA，aa27，权重0.33[Piddington，C.S.，Houston，C.S.，Paloheimo M.，Cantrell，M.，Miettinen-Oinonen，A.，Nevalainen，H.，& Rambosek，J.(1993)，编码黑曲霉泡盛变种的植酸酶(phy)和pH2.5最适型酸性磷酸酶(aph)的基因的克隆和测序，基因133，55-62)黑曲霉T213 phyA(EP897985)，aa27，权重0.33黑曲霉NRRL3135株phyA，aa27，权重0.33(van Hartingsveldt等，1993)烟曲霉ATCC13073 phyA，aa26，权重0.2(Pasamontes等，1997)烟曲霉ATCC32722 phyA，aa26，权重0.2(EP897985)烟曲霉ATCC58128 phyA，aa26，权重0.2(EP897985)烟曲霉ATCC26906 phyA，aa26，权重0.2(EP897985)烟曲霉ATCC32239 phyA，aa30，权重0.2(EP897985)Emericella nidulans phyA，aa25，权重1.0(Pasamontes等，1997a)嗜热踝节菌ATCC20186 phyA，aa24，权重1.0(Pasamontes等，1997a)嗜热毁丝霉phyA，aa19，权重1.0(Mitchell等，1997)实施例2一种改进型共有植酸酶(共有植酸酶-10)氨基酸序列的设计用于设计共有植酸酶-10的比对通过使用GCG序列分析软件包9.0版本(Devereux等，1984)的程序PILEUP以标准参数(缺口产生罚分12，缺口延伸罚分4)进行预测。缺口的定位使用文本编辑器(text editor)修正。
用以下序列对始于表2所述氨基酸(aa)的担子菌植酸酶进行比对表25种担子菌植酸酶用于预测相应共有氨基酸序列(basidio)的起点和权重Paxillus involutus CBS 100231 phyA1，aa21，权重0.5(WO98/28409)Paxillus involutus CBS 100231 phyA2，aa21，权重0.5(WO98/28409)绒毛栓菌CBS 100232 phyA，aa24，权重1.0(WO98/28409)平田头菇CBS 900.96 phyA，aa19，权重1.0(WO98/28409)Peniophora lycii CBS 686.96 phyA，aa21，权重1.0(WO98/28409)该比对显示在图3中。
表3中列出了用于最终比对的基因。该比对中所用序列的第一氨基酸(aa)述于生物命名之后。
表3 用于设计共有植酸酶-10的植酸酶序列的起点和权重土曲霉9A-1 phyA，aa27，权重0.5(Mitchell等，1997)土曲霉cbs116.46phyA，aa27，权重0.5(EP897985)黑曲霉泡盛变种phyA，aa27，权重0.5(Piddington等，1993)黑曲霉NRRL3135株phyA，aa27，权重0.5(van Hartingsveldt等，1993)烟曲霉ATCC 13073 phyA，aa26，权重0.2(Pasamontes等，1997)烟曲霉ATCC 32722phyA，aa26，权重0.2(EP897985)烟曲霉ATCC 58128 phyA，aa26，权重0.2(EP897985)烟曲霉ATCC 26906 phyA，aa26，权重0.2(EP897985)烟曲霉ATCC 32239 phyA，aa30，权重0.2(EP897985)Emericella nidulans phyA，aa25，权重1.0(Pasamontes等，1997a)嗜热踝节菌ATCC 20186 phyA，aa24，权重1.0(Pasamontes等，1997a)嗜热毁丝霉phyA，aa19，权重1.0(Mitchell等，1997)Thermomyces lanuginosus phyA，aa36，权重1.0(Berka等，1998)五种担子菌植酸酶的共有序列，权重1.0(Basidio，图3)相应比对显示于图4。
共有植酸酶-10的氨基酸序列的预测为了改进比对，我们增加了来自4种不同担子菌之5种植酸酶的最初共有序列(称为Basidio；仍含有未确定的序列位置；见图3)，用于该最初共有植酸酶序列之预测的几乎所有植酸酶序列和一种新的来自子囊菌纲Thermomyces lanuginosus的植酸酶序列，以便进行更大的比对。
我们设置复数性(plurality)为2.0和阈值为3。所用权重列于表3。比对及相应共有序列见表4。新的共有植酸酶序列和最初的共有植酸酶-1相比具有32个不同的氨基酸。程序PRETTY不能预测共有氨基酸残基之处按实施例1所述规则补齐。该程序所提示的残基无一被取代。
此外，在另一预测中，我们将所有担子菌植酸酶分别作为个氨基酸序列配以权重0.2来进行预测。相应的比对示于图6。预测得到的共有氨基酸序列(共有植酸酶-11)与共有植酸酶-10的序列有以下差异。字母X指该程序不能预测共有氨基酸；圆括号中的氨基酸对应于最终包括在共有植酸酶-10内的氨基酸。
D35X(第一个字母是共有植酸酶-10的，最后一个字母是共有植酸酶-11的)，X(K)69K，X(E)100E，A101R，Q134N，X(K)153N，X(H)190H，X(A)204S，X(E)220D，E222T，V227A，X(R)271R，H287A，X(D)288D，X(K)379K，X(I)389I，E390X，X(E)415E，X(A)416A，X(R)446L，E463A.编号如图5。
我们也检查了改进型共有序列10和11所示单个氨基酸取代对最初共有植酸酶之稳定性的影响。该方法见实施例3。
共有植酸酶-10的氨基酸序列到DNA序列的转换用土曲霉cbs116.46植酸酶的最初26个氨基酸残基作为信号肽，将其融合至共有植酸酶-10的N-末端。所用方法进一步描述在实施例1中。
所得fcp10基因的序列见图5。
共有植酸酶-10(fcp10)基因的构建和克隆任选用正义链和反义链将预测的fcp10DNA序列分为85bp的寡核苷酸。每一寡核苷酸与相对链的前、后寡核苷酸重叠20bp。所有购自Microsynth，Balgach(瑞士)的PAGE-纯化型引物参见图5。
PCR-反应在三个PCR反应中，将合成寡核苷酸被编入完整基因中。用来自Boehringer Mannheim(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)的HighFidelity试剂盒和来自AMS生物技术(欧洲)有限公司(Lugano，瑞士)的热循环仪“The ProtokolTM”实施PCR。所用以下寡核苷酸浓度为0.2pMol/ml。
Mix1.10CP-1，CP-2，CP-3.10，CP-4.10，CP-5.10，CP-6，CP-7.10，CP-8.10，CP-9.10，CP-10.10Mix2.10CP-9.10，Cp-11.10，CP-12.10，CP-13.10，Cp-14.10，CP-15.10，CP-16.10，CP-17.10，CP18.10，CP-19.10，CP-20.10，CP-21.10，CP-22.10新合成的寡核苷酸用数字10标记。共有植酸酶-10与最初的共有植酸酶-1相比含有下面的32个取代，其在图5中被加下划线Y54F，E58A，D69K，D70G，A94K，N134Q，I158V，S187A，Q188N，D197N，S204A，T214L，D220E，L234V，A238P，D246H，T251N，Y259N，E267D，E277Q，A283D，R291I，A320V，R329H，S364T，I366V，A379K，S396A，G404A，Q415E，A437G，A463E。
4个短PCR引物用于寡核苷酸的合成CP-aEcoRI
5′-TATATGAATTCATGGGCGTGTTCGTC-3′SEQ ID NO37)CP-b5′-TGAAAAGTTCATTGAAGGTTTC-3′(SEQ ID NO38)CP-c.105′-TCTTCGAAAGCAGTACACAAAC-3′(SEQ ID NO39)CP-eEcoRI5′-TATATGAATTCTTAAGCGAAAC-3′(SEQ ID NO40)PCR反应a10μl Mix1.10(每一寡核苷酸2.0pmol)2μl核苷酸(每一寡核苷酸10mM)2μl引物CP-a(10pmol/ml)2μl引物CP-c.10(10pmol/ml)10.0μl PCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反应b10μl Mix2.10(每一寡核苷2.0pmol)2μl核苷酸(每一核苷酸10mM)2μl引物CP-b(10pmol/ml)2μl引物CP-e(10pmol/ml)10.0μl PCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反应a和b的反应条件步骤1 2min-45℃步骤2 30sec-72℃步骤3 30sec-94℃步骤4 30sec-52℃步骤5 1min-72℃将步骤3到5重复40次。
PCR产物(670和905bp)经琼脂糖凝胶电泳(0.9％琼脂糖)，然后经凝胶提取(QIAEX II凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)纯化。用纯化的DNA片段进行PCR反应c。
PCR反应c6μl PCR反应a的产物≈50ng)6μl PCR反应b的产物≈50ng)2μl引物CP-a(10pmol/ml)2μl引物CP-e(10pmol/ml)10.0μl PCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反应c的反应条件步骤1 2min-94℃步骤2 30sec-94℃步骤3 30sec-55℃步骤4 1min-55℃将步骤2到4重复31次。
所得PCR产物(1.4kb)如上述纯化，用EcoRI降解，并连接至EcoRI-消化并去磷酸化的pBsk(-)-载体(Stratagene，La Jolla，CA，美国)。用1μl连接混合物转化大肠杆菌XL-1感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，美国)。所有标准方法如Sambrook等(1987)所述。所构建的基因(fcp10)的DNA序列通过本领域公知的测序方法检查。
实施例3 通过导入共有植酸酶-10和共有植酸酶-11的氨基酸序列所显示的单个突变增加共有植酸酶-1的热稳定性为了增加同源基因的热稳定性，也可检验目的蛋白与预测的共有序列之间每一差异氨基酸残基的稳定性效应，并将所有稳定突变组合至目的蛋白中。我们利用共有植酸酶-1作为目的蛋白，测试以单位点定点突变区别于共有植酸酶-10和/或-11的34个氨基酸残基的蛋白稳定性效应。
为构建在黑曲霉，酿酒酵母，或多形汉逊氏酵母中表达的突变蛋白，用含有共有植酸酶-1基因的相应表达质粒作为模板进行定点诱变(见实施例6-8)。突变用Stratagene(La Jolla，CA，美国)的″快速交换(quick exchange)TM定点诱变试剂盒″按说明书指示并使用相应引物来导入。所有获得的突变及相应引物概述于表4。携有所需突变的质粒用本领域公知的DNA序列分析来鉴定。
表4 用于共有植酸酶-1定点诱变的引物所取代的碱基用粗体来突出。导入的限制性位点在序列上方标出。当限制性位点被写在圆括号中时，所述位点通过导入突变而破坏。突变引物系列Kpn IQ50T 5′-CACTTGTGGGGTACCTACTCTCCATACTTCTC-3′(SEQ ID NO41)5′-GAGAAGTATGGAGAGTAGGTACCCCACAAGTG-3′Y54F 5′-GGTCAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAAG-3′(SEQ ID NO42)5′-CTTCCAAAGAGAAGAATGGAGAGTATTGACC-3′E58A 5′-CATACTTCTCTTTGGCAGACGAATCTGC-3′(SEQ ID NO43)5′-GCAGATTCGTCTGCCAAAGAGAAGTATG-3′Aat IID69K 5′-CTCCAGACGTCCCAAAGGACTGTAGAGTTAC-3′(SEQ ID NO44)5′-GTAACTCTACAGTCCTTTGGGACGTCTGGAG-3′Aat IID70G 5′-CTCCAGACGTCCCAGACGGCTGTAGAGTTAC-3′(SEQ ID NO45)5′-GTAACTCTACAGCCGTCTGGGACGTCTGGAG-3′K91A 5′-GATACCCAACTTCTTCTGCGTCTAAGGCTTACTCTG-3′(SEQ ID NO46)5′-CAGAGTAAGCCTTAGACGCAGAAGAAGTTGGGTATC-3′Sca IA94K 5′-CTTCTAAGTCTAAGAAGTACTCTGCTTTG-3′(SEQ ID NO47)5′ -CAAAGCAGAGTACTTCTTAGACTTAGAAG-3 ′A101R 5′-GCTTACTCTGCTTTGATTGAACGGATTCAAAAGAACGCTAC-3′(SEQ ID NO48)5′-GTAGCGTTCTTTTGAATCCGTTCAATCAAAGCAGAGTAAGC-3′N134Q 5′-CCATTCGGTGAACAGCAAATGGTTAACTC-3′(SEQ ID NO49)5′-GAGTTAACCATTTGCTGTTCACCGAATGG-3′
Nru IK153N 5′-GATACAAGGCTCTCGCGAGAAACATTGTTC -3′(SEQ ID NO50)5′-GGAACAATGTTTCTCGCGAGAGCCTTGTATC-3′Bss HII158V 5′-GATTGTTCCATTCGTGCGCGCTTCTGGTTC-3′(SEQ ID NO51)5′-GAACCAGAAGCGCGCACGAATGGAACAATC-3′Apa IS187A 5′-GGCTGACCCAGGGGCCCAACCACACCAAGC-3′(SEQ ID NO53)5′-GCTTGGTGTGGTTGGGCCCCTGGGTCAGCC-3′Bcl ID197N 5′-CTCCAGTTATTAACGTGATCATTCCAGAAGG-3′(SEQ ID NO52)5′-CCTTCTGGAATGATCACGTTAATAACTGGAG-3′Nco IT214L 5′-CACTTTGGACCATGGTCTTTGTACTGCTTTCG-3′(SEQ ID NO54)5′-CGAAAGCAGTACAAAGACCATGGTCCAAAGTG-3′Avr IIE222T 5′-GCTTTCGAAGACTCTACCCTAGGTGACGACGTTG-3′(SEQ ID NO55)5′-CAACGTCGTCACCTAGGGTAGAGTCTTCGAAAGC-3′V227A 5′-GGTGACGACGCTGAAGCTAACTTCAC-3′(SEQ ID NO56)5′-GTGAAGTTAGCTTCAGCGTCGTCACC-3′Sac IIL234V 5′-CTAACTTCACCGCGGTGTTCGCTCCAG-3′(SEQ ID NO57)5′-CTGGAGCGAACACCGCGGTGAAGTTAG-3′A238P 5′-GCTTTGTTCGCTCCACCTATTAGAGCTAGATTGG-3′(SEQ ID NO58)5′-CCAATCTAGCTCTAATAGGTGGAGCGAACAAAGC-3′Hpa IT251N 5′-GCCAGGTGTTAACTTGACTGACGAAG-3′(SEQ ID NO59)5′-TTCGTCAGTCAAGTTAACACCTGGC-3′Aat IIY259N 5′-GACGAAGACGTCGTTAACTTGATGGAC-3′(SEQ ID NO60)5′-GTCCATCAAGTTAACGACGTCTTCGTC-3′Asp IE267D 5′-GTCCATTCGACACTGTCGCTAGAACTTC-3′(SEQ ID NO61)5′-GAAGTTCTAGCGACAGTGTCGAATGGAC-3′E277Q 5′-CTGACGCTACTCAGCTGTCTCCATTC-3′(SEQ ID NO62)5′-GAATGGAGACAGCTGAGTAGCGTCAG-3′A283D 5′-GTCTCCATTCTGTGATTTGTTCACTCAC-3′(SEQ ID NO63)5′-GTGAGTGAACAAATCACAGAATGGAGAC-3′Ksp IH287A 5′-GCTTTGTTCACCGCGGACGAATGGAG-3′(SEQ ID NO64)5′-CTCCATTCGTCCGCGGTGAACAAAGC-3′Ban HIR291I 5′-CACGACGAATGGATCCAATACGACTAC-3′(SEQ ID NO65)5′-GTAGTCGTATTGGATCCATTCGTCGTG-3′Bsi WIQ292A 5′-GACGAATGGAGAGCGTACGACTACTTG-3′(SEQ ID NO66)5′-CAAGTAGTCGTACGCTCTCCATTCGTC-3′Hpa IA320V 5′-GGTGTTGGTTTCGTTAACGAATTGATTGC-3′(SEQ ID NO67)5′-GCAATCAATTCGTTAACGAAACCAACACC-3′(Bgl II)R329H 5′-GCTAGATTGACTCACTCTCCAGTTCAAG-3′(SEQ ID NO68)5′-CTTGAACTGGAGAGTGAGTCAATCTAGC-3′Eco RVS364T 5′-CTCACGACAACACTATGATATCTATTTTCTTC-3′(SEQ ID NO69)5′-GAAGAAAATAGATATCATAGTGTTGTCGTGAG- 3 ′Nco II366V 5′-CGACAACTCCATGGTTTCTATTTTCTTCGC-3′(SEQ ID NO70)5′-GCGAAGAAAATAGAAACCATGGAGTTGTCG-3′Kpn IA379K 5′-GTACAACGGTACCAAGCCATTGTCTAC-3′(SEQ ID NO71)5′-GTAGACAATGGCTTGGTACCGTTGTAC-3′S396A 5′-CTGACGGTTACGCTGCTTCTTGGAC-3′(SEQ ID NO72)5′-GTCCAAGAAGCAGCGTAACCGTCAG-3′G404A 5′-CTGTTCCATTCGCTGCTAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO73)5′-GTAAGCTCTAGCAGCGAATGGAACAG-3′Q415E 5′-GATGCAATGTGAAGCTGAAAAGGAACC-3′(SEQ ID NO74)5′-GGTTCCTTTTCAGCTTCACATTGCATC-3′
Sal IA437G 5′-CACGGTTGTGGTGTCGACAAGTTGGG-3′(SEQ ID NO75)5′-CCCAACTTGTCGACACCACAACCGTG-3′Mun IA463E 5′-GATCTGGTGGCAATTGGGAGGAATGTTTCG-3′(SEQ ID NO76)5′-CGAAACATTCCTCCCAATTGCCACCAGATC-3′以及，相应地，可用于其它突变。
如实施例9所述测定于酿酒酵母中表达的纯化植酸酶(实施例7)的最适温度。表5显示所导入的每一突变对共有植酸酶-1稳定性的影响。
表5 单独氨基酸在共有植酸酶-1中的取代对稳定性的影响+或-分别指蛋白稳定性变动最多1℃的正效应或负效应，++和--是指蛋白稳定性变动1℃至3℃的正效应或负效应；圆括号中的10或11指提示氨基酸取代的共有植酸酶序列。
稳定 中性 不稳定
本实施例用上述引物和技术将8种正突变(E58A，D197N，E267D，R291I，R329H，S364T，A379K，G404A)组合在共有植酸酶-1-thermo[8]中。此外，导入主要影响植酸酶催化特性的突变Q50T和/或K91A(见专利申请EP897010和EP897985，以及实施例9)。所得植酸酶(共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A)的DNA和氨基酸序列示于图7。该共有植酸酶的最适温度和解链温度通过这种方式增加了7℃(
图15，16，17)。
在另一个共有蛋白中，我们在共有植酸酶-1-thermo[11]中组合了11个正突变(E58A，D69K，D197N，T214L，E222T，E267D，R291I，R329H，S364T，A379K，G404A)。此外，导入突变Q50T和/或K91A。通过这种方式使解链温度比共有植酸酶-1-thermo[8]又增加3-4℃。
利用表5的结果，我们通过回复突变K94A，V158I，和A396S进一步改善了共有植酸酶-10的热稳定性，(A94K，I158V，和S396A)的回复显示对共有植酸酶-1的稳定性的强烈负效应，所得蛋白称为共有植酸酶-10-thermo[3]。SEQ ID NO26加上3个突变K94A，V158I，和A396S。此外，我们导入了主要影响共有植酸酶催化特性的突变Q50T和K91A(参见专利申请EP897010和EP897985，以及实施例9和
图14和15)。所得DNA和氨基酸序列见图8。所优化的植酸酶显示出比共有植酸酶-10高4℃的最适温度和解链温度(
图12和13)。此外该植酸酶液在pH5.5对250U/mg植酸底物的比活性大大增加(
图14)。
在另一种共有蛋白中，两个另外的突变被导入到产生共有植酸酶-10thermo[5]的共有植酸酶-10thermo[3](E222T，G437A)中。此外，导入突变Q50T和/或K91A。通过这种方式使解链温度比共有植酸酶-10thermo[3]又增加了1-2℃。
实施例4烟曲霉ATCC 13073的植酸酶通过将其氨基酸残基用共有植酸酶-1和/或共有植酸酶-10的相关残基取代而稳定在
图1的比对中的6个氨基酸序列位置上，仅有或几乎仅有烟曲霉13073植酸酶不含有相应的共有植酸酶氨基酸残基，将这些非共有氨基酸残基用共有残基取代。以下氨基酸在烟曲霉13073植酸酶中被取代，另含有Q51(24)T取代(其影响催化特性且对应于共有植酸酶中的Q50T取代)和土曲霉cbs116.46植酸酶的信号序列(参见欧洲专利申请0897010，和图9)F55(28)Y，V100(73)I，F114(87)Y，A243(220)L，S265(242)P，N294(282)D。圆括号中的数字指
图1中的编号。
在第二轮中，进一步将在共有植酸酶-10中鉴定并检验为共有植酸酶-1(表5)中单一突变的11个稳定氨基酸取代中的4个(E58A，R329H，S364T，G404A)导入烟曲霉α-突变体中。此外，还导入氨基酸取代S154N，其显示植酸酶的蛋白酶敏感性降低。
如实施例3所述导入突变(见表6)，如实施例6-8所述使之表达。产生的烟曲霉13073植酸酶变体被称为α突变体(例如带有Q24T，F28Y，V73I，F87Y，A220L，S242P，N282D取代的烟曲霉ATCC 13073植酸酶)以及″优化的″α-突变体(例如进一步具有E59A-S1S4N-R329H-S364T-G404A取代的烟曲霉α-突变体)。K92A是一个额外的优选突变。
烟曲霉13073α-突变体的植酸酶的最适温度(60℃，图20)和解链温度(67.0℃，图9)比野生型植酸酶的(最适温度55℃，Tm60℃)提高5-7℃。另5个氨基酸取代进一步使最适温度提高3℃(图20).
表6用于稳定烟曲霉ATCC13073植酸酶的诱变引物突变引物F55Y5′-CACGTACTCGCCATACTTTTCGCTCGAG-3′(SEQ ID NO77)5′-CTCGAGCGAAAAGTATGGCGAGTACGTG-3′(Xho I)E58A5′-CCATACTTTTCGCTCGCGGACGAGCTGTCCGTG-3′(SEQ ID NO78)5′-CACGGACAGCTCGTCCGCGAGCGAAAAGTAGG-3′V100I 5′-GTATAAGAAGCTTATTACGGCGATCCAGGCC-3′(SEQ ID NO79)5′-GGCCTGGATCGCCGTAATAAGCTTCTTATAC-3′F114Y 5′-CTTCAAGGGCAAGTACGCCTTTTTGAAGACG-3′(SEQ ID NO80)5′-CGTCTTCAAAAAGGCGTACTTGCCCTTGAAG-3′A243L 5′-CATCCGAGCTCGCCTCGAGAAGCATCTTC-3′ (SEQ ID NO81)5′-GAAGATGCTTCTCGAGGCGAGCTCGGATG-3′S265P 5′-CTAATGGA TGTGTCCGTTTGATACGGTAG-3′(SEQ ID NO82)5′-CTACCGTATCAAACGGACACATGTCCATTAG-3′N294D 5′-GTGGAAGAAGTACGACTACCTTCAGTC-3′ (SEQ ID NO83)5′-GACTGAAGGTAGTCGTACTTCTTCCAC-3′
(Mlu I)R329H 5′-GCCCGGTTGACGCATTCGCCAGTGCAGG-3′(SEQ ID NO84)5′-CCTGCACTGGCGAATGCGTCAACCGGGC-3′Nco IS364T 5′-CACACGACAACACCATGGTTTCCATCTTC-3′(SEQ ID NO85)5′-GAAGATGGAAACCATGGTGTTGTCGTGTG-3′(Bss HI)G404A 5′-GTGGTGCCTTTCGCCGCGCGAGCCTACTTC-3′(SEQ ID NO86)5′-GAAGTAGGCTCGCGCGGCGAAAGGCACCAC-3′实施例5将黑曲霉NRRL3135植酸酶的活性位点氨基酸残基导入共有植酸酶-1我们使用黑曲霉NRRL3135植酸酶的晶体结构来限定所有活性位点氨基酸残基(见实施例1和EP897010)。根据
图1的比对，我们将共有植酸酶-1的下述活性位点残基以及不相同的邻近残基用黑曲霉植酸酶的那些取代S89D，S92G，A94K，D164S，P201S，G203A，G205S，H212P，G224A，D226T，E255T，D256E，V258T，P265S，Q292H，G300K，Y305H，A314T，S364G，M365I，A397S，S398A，G404A，和A405S。
如实施例1所述将新的共有植酸酶-7蛋白序列反译为DNA序列(
图10)。相应的基因(fcp7)如实施例1所述用下述寡核苷酸混合物来产生Mix1.7CP-1，CP-2，CP-3，CP-4.7，CP-5.7，CP-6，CP-7，CP8.7，CP-9，CP-10.7Mix2.7CP-9，CP-10.7，CP-11.7，CP-12.7，CP-13.7，CP-14.7，CP-15.7，CP-16，CP-17.7，CP-18.7，CP-19.7，CP-20，CP-21，CP-22.
上述寡核苷酸的DNA序列见
图10。新合成的寡核苷酸另用数字7标记。用如实施例1所述的相同PCR引物合成寡核苷酸后，实施例6-8所述将该基因克隆至表达载体中。
在多形汉逊氏酵母中表达和纯化后，所检测的该酶的pH-谱非常相似于黑曲霉植酸酶的(见
图18)。
实施例6 共有植酸酶基因在多形汉逊氏酵母中的表达用于转化多形汉逊氏酵母RB11的植酸酶表达载体[Gellissen，G.，Hollenberg，C.P.，Janowicz，Z.A.(1994)，甲基营养型酵母中的基因表达，在Smith，A.(编)，重组微生物中的基因表达。Dekker，纽约，pp395-439]通过将pBsk-fcp或其变体的Eco RI片段插入多形汉逊氏酵母表达载体pFPMT121的多克隆位点中而构建，其中pFPMT121基于酿酒酵母的ura3选择标记，多形汉逊氏酵母的甲酸脱氢酶(FMD)启动子元件和甲醇氧化酶(MO)终止子元件。将Fcp基因的5｀末端融合至FMD启动子，3｀末端融合至MOX终止子(Gellissen等，应用微生物学生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)46，46-54，1996；EP299108)。所产生的表达载体命名为pFPMTfcp，pFPMTfcp10，和pFPMTfcp7。
使所构建的质粒在大肠杆菌中增殖。质粒DNA用现有技术中的常规方法纯化。利用如Gellissen等(1996)所述的感受态细胞制备方法和酵母转化方法将所述表达质粒转化至乳清苷-5｀-磷酸脱羧酶(ura3)缺陷型多形汉逊氏酵母菌株RB11中。将每一种转化混合物涂布于含有2％葡萄糖和1.8％琼脂的YNB培养基(0.14％w/v Difco YNB和0.5％硫酸铵)上，37℃培养。4-5天后挑出单个转化菌落，如上述在液体培养基中37℃培养2天。随后，将此培养物的等分试样接种到装有含2％葡萄糖之YNB培养基的新鲜小瓶中。在选择培养基上进一步传7代后，所述表达载体以多聚体形式整合到酵母基因组中。然后，通过两个另外的在3ml非选择性液体培养基(YPD，2％葡萄糖，10g/l酵母提取物，和20g/l蛋白胨)中另两步培养，获得有丝分裂稳定型转化子。为了获得遗传同源性重组菌株，将最终的稳定培养物的等分试样涂布于选择平皿中。分离单菌落，分析在含有2％甘油(其阻遏FMD启动子)而非葡萄糖的YNB中表达的植酸酶。共有植酸酶的纯化如实施7所述。
实施例7在酿酒酵母中表达共有植酸酶基因并从培养物上清中纯化植酸酶共有植酸酶基因从相应蓝斑(Bluescript)-质粒(pBsk-fcp，pBSK-fcp10，pBskfcp7)中分离，将其连接至酿酒酵母表达载体pYES2(Invitrogen，SanDiego，CA，美国)的表达盒的Eco RI位点，或亚克隆至缩短的GAPFL(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子和pho5终止子之间，如Janes等，现代遗传学18，97-103所述。基因的正确方向通过PCR核对。酿酒酵母菌株，例如INVScl(Invitrogen，San Diego，CA，USA)如Hinnen等，美国国家科学院院报75，1929-1933(1978)所述进行转化。挑出携有受控于GAPFL启动子之植酸酶基因的单菌落，在5ml选择培养基[SD-尿嘧啶；Sherman，J.P.，Finck，G.R.和Hicks，J.B.(1986)，酵母遗传学方法实验室手册.冷泉港大学]中30℃强烈振荡(250rpm)培养一天。再将预培养物加到500ml YPD培养基(Sherman等，1986)中并在相同的条件下培养。按说明书对gall启动子进行诱导。培养4天后，离心细胞培养物(7000rpm，GS3转头，15mm，5℃)以除去细胞，上清通过Amicon 8400 cell(PM3O膜；Grace AG，Wallizeller，瑞士)和ultrafree-15离心过滤装置(Biomax-30K，Millipore，Bedford，MA，美国)超滤浓缩。浓缩液(10ml)上样至40ml Sephadex G25 Superfine柱(PharmaciaBiotech，Freiburg，德国)，用10mM乙酸钠，pH5.0洗脱以脱盐。将脱盐样品加至2M(NH4)2SO4中，直接上样至1ml丁基Sepharose凝胶4Fast Flow疏水作用层析柱(Pharmacia Biotech，Feiburg，德国)，用在10mM乙酸钠，pH5.0中从2M到0M(NH4)2SO4的线性梯度洗脱。植酸酶在临界点洗脱，浓缩并上样至120ml Sephacryl S-300凝胶渗透层析柱(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)。共有植酸酶-1，-7和-10以均一对称峰形式洗脱，经SDS-PAGE证实纯度约95％。
实施例8 共有植酸酶基因在黑曲霉中的表达以蓝斑质粒pBsk-fcp，pBsk-fcp10，和pBskfcp7为模板，在基因的起始密码子上游导入Bsp HI-位点，终止密码子下游导入Eco RV-位点。使用ExpandTM高保真PCR试剂盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)及以下引物引物Asp-1BspHI5｀-TATATCATGAGCGTGTTCGTCGTGCTACTGTTC-3｀(SEQ ID NO87)用于克隆fcp和fcp7的引物Asp-2EcoRV3｀-ACCCGACTTACAAAGCGAATTCTATAGATATAT-5｀(SEQ ID NO88)用于克隆fcp10的引物Asp-3EcoRV3｀-ACCCTTCTTACAAAGCGAATTCTATAGATATAT-5｀(SEQ ID NO89)反应按厂家所述进行。经PCR-扩增的fcp-基因在起始密码子处有一个新的Bsp HI位点，其通过引物Asp-1导入，导致第二个氨基酸残基甘氨酸被丝氨酸取代。随后，将该DNA-片段用Bsp HI和Eco RV消化并连接至黑曲霉葡糖淀粉酶启动子(glaA)下游的Nco I位点和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)色氨酸C终止子(trpC)上游的Eco RV位点(Mullaney等，1985)。在此克隆步骤后，对该基因测序以检测可能由PCR导入的错误。所得表达质粒(基本对应于EP684313之实施例9所述PGLAC载体)含粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的乳清苷-5｀-磷酸脱羧酶基因(pyr4)作为筛选标记。黑曲霉的转化和共有植酸酶基因的表达如EP684313所述。共有植酸酶如实施例7所述被纯化。
实施例9 植酸酶活性和最适温度及pH的检测此实施例涉及植酸酶活性和最适温度的检测。各种植酸酶都被检测。
如EP420358以及van Hartingsveldt等(基因127，87-94，1993)所述制备黑曲霉NRRL 3135的植酸酶。
烟曲霉ATCC13073，土曲霉9A-1，土曲霉cbs116.46，Emericellanidulans，嗜热毁丝霉，及嗜热踝节菌的植酸酶如EP-0897985及其引用文献所述制备。
所测的其它植酸酶如本文所述制备。
共有植酸酶-1-thermo(8)是共有植酸酶-1的一个变体，其进一步包括8个突变，如图5中下划线所示。共有植酸酶-1的无信号肽形式示于
图1(SEQID NO14)，有信号肽形式示于图2(SEQ ID NO16)。
植酸酶活性的测定基本上如Mitchell等(1997)所述。在含有0.5％植酸(≈5mM)的200mM乙酸钠，pH5.0的试验混合物中进行活性测定。37℃培养15min后，通过加入等体积的15％三氯乙酸来终止反应。所释放的无机磷酸根通过使100μl试验混合物与900μl H2O和1ml 0.6M H2SO4，2％抗坏血酸和0.5％钼酸铵混合而定量测定。用磷酸钾的标准溶液作参照。1个酶活单位定义为37℃时每分钟释放1μmol磷酸根的酶量。蛋白浓度通过如Pace等人所述计算的280nm处酶消光系数来测定[Pace N.C.，Vajdos，F.，Fee，L.，Grimsley，G.和Gray，T.(1995)，如何测量和预测蛋白质的摩尔吸收系数，蛋白质科学，4，2411-2423)280nm处的1吸收单位(1OD)相当于1.101mg/ml共有植酸酶-1，1.068mg/ml共有植酸酶-7，以及1.039mg/ml共有植酸酶-10。
在pH-最适曲线中，纯化的酶用10mM乙酸钠，pH5.0稀释。将稀释蛋白质的试样与等体积的1％植酸(约10mM)在一系列的不同缓冲液中混合以进行培养0.4M甘氨酸/HCl，pH2.5；0.4M乙酸盐/NaOH，pH3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5；0.4M咪唑/HCl，pH6.0，6.5；0.4M Tris/HCl pH7.0，7.5，8.0，8.5，9.0。对照试验表明pH仅受混合步骤的影响。如上所述37℃培养15分钟。
为了测定植酸酶的底物特异性，将试验混合物中的植酸用5mM浓度的各种磷酸盐化合物代替。此外，活性的测试如上所述。
为了测定最适温度，将酶(100μl)和底物溶液(100μl)在指定温度下预温5min。通过将酶加入底物溶液中开始反应。保温15分钟后，用三氯乙酸终止反应，检测磷酸根的释放量。
共有植酸酶-1的最适pH在pH6.0-6.5(70U/mg)左右。导入Q50T突变使得最适pH渐变为pH6.0(130U/mg)。导入K91A突变进一步使最适pH渐变至更酸性范围。Q50T和K91A突变对共有植酸酶-10和进一步稳定的共有植酸酶变体也有相当的效应(
图14和15)。
共有植酸酶-7(其构建为使黑曲霉NRRL3135植酸酶的催化特性转移至共有植酸酶-1)具有与黑曲霉NRRL3135植酸酶(见
图18)非常相似的pH-谱。其底物特异性与黑曲霉NRRL3135植酸酶的相似程度更甚于共有植酸酶-1的。
共有植酸酶-1的最适温度(71℃)比用来预测共有序列的野生型植酸酶的(45-55℃，表7)高16-26℃。改进型共有植酸酶-10显示出其最适温度进一步增加到80℃(
图13)。
当使用酿酒酵母菌株过度生产的上清时，发现共有植酸酶-1-thermo[8]的最适温度在相同的范围(78℃)。经测定共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A具有最高的最适温度为82℃。
表7 共有植酸酶以及来自烟曲霉，黑曲霉，E.nidulans，和嗜热毁丝霉的植酸酶的最适温度和Tm-值。
最适温度的测定如实施例9所述。Tm-值通过实施例10所述差示扫描量热来测定。
实施例10通过差示扫描量热(DSC)测定解链温度为了测定植酸酶的伸展温度，如Brugger等，1997[Brugger，R.，Mascarello，F.，Augem，S.，van Loon，A.P.G.M.和Wyss，M.(1997)，通过差示扫描量热研究植酸酶和pH2.5酸性植酸酶的热变性。植酸和植酸酶的生物化学(Rasmussen，S.K.；Raboy，V；Dalboge，H.和Loewus，F.编；Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，荷兰]所述使用差示扫描量热法。用50-60mg/ml植酸酶均一溶液进行检验。以10℃/min的恒定加热速率加热到90-95℃。
所测的解链点证实了最适温度检测结果(表7)。迄今最稳定的共有植酸酶是共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A，其在所选条件下显示出解链温度89.3℃。这比所用的野生型植酸酶的解链温度高26.0到33.6℃。
实施例11将担子菌植酸酶活性位点转移到植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A如上所述(实施例5)，将衍生自担子菌植酸酶活性位点的突变导入共有植酸酶-10中。制备下述a)-e)的5个构建体a)称作共有植酸酶-12的构建物，其含有担子菌共有序列中选定数目的活性位点残基。其氨基酸序列被显示于图21(前26个氨基酸组成信号肽；不同于共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的位置带下划线)；b)将一簇突变(第II簇)转移到共有植酸酶-1和-10的序列中，即S80Q，Y86F，S90G，K91A，S92A，K93T，A94R，Y95Ic)以类似的方式转移另一簇突变(第III簇)，即T129V，E133A，Q134N，M136S，V137S，N138Q，S139A；d)以类似的方式转移另一簇突变(第IV簇)，即A168D，E171T，K172N，F173W；e)最后，转移另一簇突变(第V簇)被，即Q297G，S298D，G300D，Y305T。
这些构建物如实施例6到8所述被表达。
实施例12 利用GAP进行植酸酶比对使本文所述植酸酶—即氨基酸序列及相应DNA序列—相互比对。此外，对其它植酸酶也进行相应比对，它们是-EP897985所述的共有植酸酶-1；-EP420358所述的黑曲霉(ficuum)NRRL3135(黑曲霉NRRL3135)的植酸酶；-EP897010所述的烟曲霉ATCC13073(烟曲霉13073)；烟曲霉ATCC32239(烟曲霉32239)；土曲霉cbs116.46(土曲霉cbs)；Emericella nidulans(E.nidulans)；和嗜热踝节菌(T.thermophilus)的植酸酶；-EP684313所述的嗜热毁丝霉和土曲霉9-Al的植酸酶；-WO9735017(PCT/US97/04559)所述的Thermomyces lanuginosus(T.lanuginosus)的植酸酶；
-WO98/28409所述的平田头菇，Paxillus involutus1和2(P.involutusphyA1和phyA2)；以及绒毛栓菌的植酸酶；-WO98/28408所述的Peniophora lycii(P.lycii)的植酸酶。
用GAP程序及如上所述设置进行比对。
在多肽比对中，除了与共有植酸酶-11比对外，还包括信号肽。
氨基酸序列比对的结果被显示于下面表8中。每一小格的第一个数字是氨基酸的相似性，第二个数字是氨基酸的同源性。
在DNA序列比对中，也总是包括信号肽。结果示于下表9。
本发明包括以外实施方案(A)-(J)。
在这些实施方案中，当测定另一种植酸酶在氨基酸水平的％同一性或％相似性时，使用上述GAP等比对程序将其氨基酸序列与参照序列(例如在实施方案(A)中的共有植酸酶-10氨基酸序列)相比对。同一性百分比和相似性百分比均通过此程序计算。其它植酸酶的氨基酸序列可包括或不包括信号肽。
当测定另一种编码植酸酶的DNA在DNA水平的％同一性时，使用上述GAP等比对程序将该DNA序列与参照序列[例如在实施方案(A)中的SEQ ID NO25至核苷酸12-1412(如图5所示的共有植酸酶-10(Fcp10)的DNA序列]相比对。同一性百分比通过此程序计算。编码另一种植酸酶的DNA序列可以是包含内含子的基因组DNA序列，或cDNA序列。其可以包括或不包括信号肽编码部分。
当测定杂交时，所用探针是特异性DNA序列[例如在实施方案(A)中SEQID NO25的核苷酸12-1412(如图5所示的共有植酸酶-10(Fcp10)的DNA序列]。编码另一种植酸酶的DNA序列可以是含有植酸酶DNA序列的基因组DNA；纯化的基因组DNA序列(就植酸酶DNA序列而言为纯化的)；或其可以是编码植酸酶的cDNA序列，优选纯化型或扩增型，例如PCR-扩增型。编码植酸酶的DNA，无论什么类型，可包括或不包括信号肽编码部分。合适的杂交条件如上所述。
术语″DNA序列″包括在此例示的DNA序列的片段或部分，只要其能够编码活性酶(例如植酸酶)。
术语″氨基酸序列″包括在此例示的氨基酸序列，只要其具有酶活性(例如表现植酸酶活性)。
(A)与共有植酸酶-10(CP10，Fcp10)相关的植酸酶及相应DNA序列一种植酸酶，其含有与图5所示共有植酸酶-10(Fcp10)中1-467位的氨基酸序列有至少93.80％；或至少94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，含有与共有植酸酶-10中1-467位的氨基酸序列有至少95.09％或至少95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其由与图5所示共有植酸酶-10(Fcp10)之DNA序列中核苷酸12-1412有至少95.88％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列编码。
一种编码植酸酶的DNA序列，其与图5所示共有植酸酶-10(Fcp10)之DNA序列的核苷酸12-1412(i)有至少95.88％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或极高度严谨条件下可杂交。合适的阴性对照是编码共有植酸酶-1的DNA。合适的阳性对照是编码CP10，CP10-thermo[3)-Q50T，K91A，CP1-thermo[8]，CP1-thermo[83]Q50T，K91A中任一个的DNA。
一种编码植酸酶的DNA序列，所述酶含有与图5所示共有植酸酶-10(Fcp10)中1-467位的氨基酸序列有至少93.80％；或至少94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
(B)与共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A相关的植酸酶及相应DNA序列一种植酸酶，其含有与图8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A中1-467位的氨基酸序列有至少93.37％；或至少93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与图8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A中1-467位的氨基酸序列有至少94.66％；或至少95.0，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其由与图8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A之DNA序列的核苷酸12-1412有至少95.88％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列编码。
一种编码植酸酶的DNA序列，其与图8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A之DNA序列的核苷酸12-1412(i)有至少95.88％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或极高度严谨条件下可杂交。合适的阴性对照是编码共有植酸酶-1的DNA。合适的阳性对照是编码CP10，CP10-thermo[3)-Q50T-K91A，CP1-thermo[8]，或CP1-thermo[8]-Q50T-K91A中任一种的DNA。
一种编码植酸酶的DNA序列，所述酶含有与图8所示共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A中1-467位的氨基酸序列有至少93.37％；或至少93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
(C)与共有植酸酶-1-thermo[81相关的植酸酶及相应DNA序列一种植酸酶，其含有与共有植酸酶-1-thermo[8](示于图7；已添加回复突变T50Q和A91K)中1-467位的氨基酸序列有至少98.30％；或至少98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与共有植酸酶-1-thermo[8](示于图7；已添加回复突变T50Q和A91K)中1-467位的氨基酸序列有至少98.51％；或至少99，99.5％相似性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其由与共有植酸酶-1-thermo[8](示于图7；已添加回复突变T50Q和A91K)之DNA序列的核苷酸1-1407有至少98.73％；或至少99，99.5％同一性的DNA序列编码。
一种编码植酸酶的DNA序列，其与共有植酸酶-1-thermo[8](示于图7；已添加回复突变T50Q和A91K)之DNA序列的核苷酸1-1407(i)有至少98.73％；或至少99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或极高度严谨条件下可杂交。合适的阴性对照是编码共有植酸酶-1的DNA。合适的阳性对照是编码CP1-thermo[8]，或CP1-thermo[8]-Q50T-K91A中任一个的DNA。
一种编码植酸酶的DNA序列，所述酶含有与共有植酸酶-1-thermo[8](示于图7；已添加回复突变T50Q和A91K)中1-467位的氨基酸序列有至少98.30％；或至少98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
(D)与共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A相关的植酸酶及相应DNA序列一种植酸酶，其含有与图7所示共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A中1-467位的氨基酸序列有至少97.87％；或至少98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与图7所示共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A中1-467位的氨基酸序列有至少98.08％；或至少98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其由与图7所示共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A之DNA序列的核苷酸1-1407有至少98.37％；或至少98.5，99，99.5％同一性的DNA序列编码。
一种编码植酸酶的DNA序列，其与图7所示共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A之DNA序列的核苷酸1-1407(i)至少98.37％；或至少98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或极高度严谨条件下可杂交。合适的阴性对照是编码共有植酸酶-1的DNA。合适的阳性对照是编码CP1-thermo[8]，或CP1-thermo[8]-Q50T-K91A中任一种的DNA。
一种编码植酸酶的DNA序列，所述酶含有与图7所示的共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A中1-467位的氨基酸序列有至少97.87％；或至少98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
(E)与共有植酸酶-11相关的植酸酶及相应DNA序列一种植酸酶，其含有与图6所示共有植酸酶-11中1-482位的氨基酸序列有至少90.71％；或至少91，91.5，92，92.5，93，93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与图6所示共有植酸酶-11中1-482位的氨基酸序列有至少92.07％；或至少92.5，93，93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
一种编码植酸酶的DNA序列，所述酶含有与图6所示共有植酸酶-11中1-482位的氨基酸序列有至少90.71％；或至少91，91.5，92，92.5，93，93.5，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
(F)与烟曲霉α-突变体相关的植酸酶及相应DNA序列一种植酸酶，其含有与图9所示烟曲霉α-突变体(植酸酶)中1-467位的氨基酸序列有至少97.17％；或至少97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与图9所示烟曲霉α-突变体(植酸酶)中1-467位的氨基酸序列有至少97.82％；或至少98，98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其由与图9所示烟曲霉ATCC 13073α-突变体(植酸酶)之DNA序列的核苷酸1-1401有至少96.13％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列编码。
一种编码植酸酶的DNA序列，所述酶含有与图9所示烟曲霉ATCC13073α-突变体(植酸酶)中1-467位的氨基酸序列有至少97.17％；或至少97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种编码植酸酶的DNA序列，其与图9所示烟曲霉ATCC 13073α-突变体(植酸酶)之DNA序列的核苷酸1-1401(i)有至少96.13％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或极高度严谨条件下可杂交。合适的阴性对照是编码烟曲霉13073的植酸酶的DNA。合适的阳性对照是编码烟曲霉ATCC 13073α-突变体的植酸酶，或优化型α-突变体的DNA。
(G)与优化型烟曲霉α-突变体相关的植酸酶及相应DNA序列一种植酸酶，其含有与优化型烟曲霉α-突变体的植酸酶序列至少96.08％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与优化型烟曲霉α-突变体的植酸酶序列有至少96.74％；或至少97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其由与编码优化型烟曲霉α-突变体植酸酶的DNA序列中核苷酸1-1401有至少95.63％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列编码。
一种DNA序列，其编码的植酸酶含有与优化型烟曲霉α-突变体植酸酶有至少96.08％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种编码植酸酶的DNA序列，其与编码优化型烟曲霉α-突变体植酸酶的DNA序列中核苷酸1-1401(i)有至少95.63％；或至少96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或极高度严谨条件下可杂交。
合适的阴性对照是编码烟曲霉13073植酸酶的DNA。合适的阳性对照是编码烟曲霉ATCC 13073α-突变体植酸酶或优化型α-突变体的DNA。
(H)与共有植酸酶-7相关的植酸酶及相应DNA序列一种植酸酶，其含有与
图10所示共有植酸酶-7中1-467位的氨基酸序列有至少94.87％；或至少95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与
图10所示共有植酸酶-7中1-467位的氨基酸序列有至少95.30％；或至少95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其由与
图10所示共有植酸酶-7之DNA序列的核苷酸12-1412有至少96.38％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的DNA序列编码。
一种编码植酸酶的DNA序列，其与
图10所示共有植酸酶-7之DNA序列的核苷酸12-1412(i)有至少96.38％；或至少96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相同；或(ii)在低度，或中度，中/高度，高度，或极高度严谨条件下可杂交。
一种编码植酸酶的DNA序列，所述酶含有与
图10所示共有植酸酶-7中1-467位的氨基酸序列有至少94.87％；或至少95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
(I)与担子菌共有植酸酶相关的植酸酶一种植酸酶，其含有与(i)图3所示担子菌共有植酸酶的氨基酸1-441，和(ii)图5所示氨基酸1-26的组合序列(将序列(ii)加在序列(i)的N-末端)有76.23％；或至少77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，94.5，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与图3所示担子菌共有植酸酶中1-441位的氨基酸序列有至少79.50％；或至少80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
(J)与共有植酸酶-12相关的植酸酶一种植酸酶，其含有与图21所示共有植酸酶-12的1-467位的氨基酸序列有至少70，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％同一性的氨基酸序列。
一种植酸酶，其含有与图21所示共有植酸酶-12的1-467位的氨基酸序列有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99，99.5％相似性的氨基酸序列。
表8植酸酶氨基酸序列的比较
表9编码植酶酶的DNA序列的比较
权利要求
1.一种植酸酶，其包含与共有植酸酶-10(SEQ ID NO26)1-467位的氨基酸序列有至少93.80％同一性的氨基酸序列。
2.一种植酸酶，其由与共有植酸酶-10的DNA序列(SEQ ID NO25)中12-1412位核苷酸有至少95.88％同一性的DNA序列编码。
3.一种植酸酶，其含有选自(i)SEQ ID NO26，或其氨基酸1-438，或由(ii)SEQ ID NO25的核苷酸12-1412，或90-1412编码的氨基酸序列。
4.一种植酸酶，其包含选自下组的氨基酸序列(i)共有植酸酶-10-thermo[3]，(ii)(i)的变体，进一步包含突变Q50T，K91A，或(Q50T+K91A)，后一变体示于图8，(iii)序列(i)和(ii)之任一的氨基酸27-467，(iv)SEQ ID NO31，或其氨基酸1-441；或(v)由SEQ ID NO30的核苷酸1-1401，或79-1401编码的氨基酸序列。
5.一种植酸酶，其包含选自下组的氨基酸序列(i)共有植酸酶-1-thermo[8]，(ii)(i)的变体，进一步含有突变Q50T，K91A，或(Q50T+K91A)，后一变体示于图7，(iii)序列(i)和(ii)之任一的氨基酸27-467，或(iv)SEQ ID NO29，或其氨基酸1-441；或(v)由SEQ ID NO28的核苷酸1-1407，或79-1407编码的氨基酸序列。
6.一种植酸酶，其含有共有植酸酶-11(SEQ ID NO27)的氨基酸序列。
7.一种DNA序列，其含有编码权利要求1-6之任一植酸酶的DNA序列。
8.一种含有编码植酸酶之DNA序列的DNA序列，所述编码植酸酶的DNA序列与共有植酸酶-10的DNA序列(SEQ ID NO25)中核苷酸12-1412是(i)至少95.88％一致，或(ii)可在高度严谨条件下杂交。
9.一种含有编码植酸酶之DNA序列的DNA序列，所述植酸酶含有与共有植酸酶-10(SEQ ID NO26)之氨基酸1-467至少93.80％一致性的氨基酸序列。
10.一种含有编码植酸酶之DNA序列的DNA序列，其中所述编码植酸酶的DNA序列含有(i)共有植酸酶-10的DNA序列(SEQ ID NO25)的核苷酸12-1412，或90-1412；(ii)共有植酸酶-10-thermo[3]-Q50T-K91A的DNA序列(SEQ ID NO30)的核苷酸1-1401，或79-1401；或(iii)共有植酸酶-1-thermo[8]-Q50T-K91A的DNA序列(SEQ ID NO28)的核苷酸1-1401，或79-1401。
11.一种载体，其含有权利要求7-10之任一的DNA序列。
12.一种微生物宿主细胞，其含有权利要求7-10之任一的DNA序列，或权利要求11的载体。
13.一种生产植酸酶的方法，该方法包括在允许植酸酶产生的条件下培养权利要求12的宿主细胞，并从培养基中回收植酸酶。
14.一种食品，饲料或药物组合物，其含有权利要求1-6之任一的植酸酶。
全文摘要
本发明涉及改进的植酸酶,优选是增加了热稳定性的植酸酶,以及产生植酸酶的方法。具体的,将稳定的氨基酸突变导入到同源蛋白中,或使植酸酶的活性位点部分或全部被取代。本发明还公开了相应的DNA序列及其制备方法,以及生产改进的植酸酶的方法,及其应用。本发明还公开了烟曲霉植酸酶和共有植酸酶的特异性突变体。
文档编号C12R1/865GK1344315SQ00805245
公开日2002年4月10日 申请日期2000年1月21日 优先权日1999年1月22日
发明者马丁·莱曼, 索伦·F·拉森 申请人:诺维信公司