专利名称：抗广谱病原体的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及到基因工程的植物，其被改造用以表达一种或多种属于temporin和/或dermaseptin家族的肽。
新近，植物育种和基因工程技术已经用于抵抗植物病原体。在一定情形下，育种者和分子生物学家已经成功地改造了对某些病原体的抗性。过去一些年里，许多植物R(抗性)基因已经从植物中分离出来。当引入其它的易染病作物时，这些R基因产生对某些病原体的增强的抗性。例如，美国专利5,571,706介绍了烟草N基因的分离，它赋予对烟草花叶病毒的抗性。然而，尽管迄今报道的常规的育种和基因工程方法可成功地增强病原体的抗性，它们一般解决仅仅由一种病原体，或者小量紧密联系的病原体引起的问题。结果，尽管采用这些方法生产的作物具有增强的抗一种病原体的保护力，仍然必须采用常规的化学试剂以控制其它的病原体。
生产对广谱病原体，包括细菌和真菌病原体，具有增强的抗性的植物，将具有极大的农业利益。本发明涉及到这样的植物。
发明概述本发明者已经发现转基因植物内某些肽的表达赋予广谱病原体抗性，包括对真菌和细菌增强的抗性。这些肽是少量的、带正电的(阳离子的)属于temporin和dermaseptin家族的肽，它们天然存在在某些种青蛙的皮肤内。本发明提供的转基因植物可用于常规的农业用途，例如粮食作物。还可收割和处理这些植物以提取已表达的temporin和/或dermaseptin肽，它接着可以纯化以用于医疗和其它用途。
因而本发明包括表达至少一种dermaseptin或temporin肽的转基因植物，以及生产这些植物的方法。这些植物的部分，包括种子、果实、茎、叶和根，可以以常规方式利用，作为食物原料，或者作为dermaseptin或temporin肽的来源。由于所有植物种类易感染一种或多种植物病原体，可有效地应用本发明以在任何植物种类中产生广谱抗性。从而，本发明可应用至单子叶植物、双子叶植物和裸子植物，包括但并非限于，玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、一般意义的豆、油菜/菜籽(canola)、紫花苜蓿、亚麻、向日葵、红花、芸苔、棉花、亚麻、花生、三叶草；蔬菜，例如莴苣、西红柿、葫芦、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝卜、豌豆、小扁豆、甘蓝、花椰菜、椰菜、芽甘蓝、胡椒；树果实例如柑橘、苹果、梨子、桃子、杏、胡桃；和花，例如兰花、康乃馨和玫瑰。
在其最基本形式中，本发明提供表达一种或多种dermaseptin和/或temporin肽的转基因植物。dermaseptin和temporin肽家族的成员本领域是公知的。本发明可采用的dermaseptin的例子包括，但并非限于，由Mor.等人，Biochemistry，308824-8830，1991，Strahilevitz，Biochemistry，3310951-10960，1994和Wechselberger，Biochim.Biophys.Acta 1388279-283，1998.介绍的dermaseptin。可采用的emporin例子包括，但并非限于，由Simmaco等人，Eur.J.Biochem.，242788-92，1996介绍的temporin。在它们的天然状态(即，在青蛙细胞中表达的)，dermaseptin和temporin肽以前体形式产生，随后通过蛋白水解剪切加工以形成成熟蛋白质。Dermaseptin的成熟形式长度一般为大约27-34个氨基酸，而temporin的成熟形式长度一般为大约10-13个氨基酸。本发明预料这些肽的天然存在的全长(未加工过)形式，以及肽的成熟(加工过)形式和中间形式的用途。此外，也可以采用这些肽的合成形式。肽的合成形式包括任何不是天然存在的形式，以及包括在氨基酸序列上不同于天然存在肽，但仍然保持dermaseptin或temporin生物活性的肽。该序列变异体通常保留与至少一种天然存在的dermaseptin或temporin肽的至少40％的氨基酸序列同一性。
其它的可采用的dermaseptin或temporin的合成形式包括具有N-末端肽延伸的形式。这样的肽延伸可包括通常在蛋白质加工过程中清除的dermaseptin或temporin的前体形式的部分，或者可以是合成序列。这些N-末端肽延伸可对蛋白水解剪切产生增强的抵抗力，并且也可增强肽的抗菌活性。通常地，这些N-末端延伸长度在2和25个氨基酸之间，尽管也可以采用更长的延伸。在某些实施方案中采用的N-末端延伸序列的例子包括肽序列MAMWK和MASRH。AMWK序列是天然存在的肽延伸；它是通常在加工过程中剪切的全长dermaseptin-b肽序列的部分。ASRH是一种合成的延伸序列。在每种情形下，N-末端蛋氨酸加入延伸肽以确保肽的适当表达。
本发明的基本方面基于在转基因植物中temporin和dermaseptin肽的表达，其它的氨基酸序列也可连接这些肽中，以便制备融合肽。转基因植物中这种融合肽的表达可提供甚至比单独temporin或dermaseptin肽的表达更有效的广谱病原体抗性，或者可增强已表达的temporin/dermaseptin分子的稳定性以提供更高的表达水平，因此促进源于植物组织的肽的纯化。因而，在另一实施方案中，本发明提供表达融合肽的转基因植物，它包括(1)为temporin或dermaseptin的第一肽序列；和
(2)与第一肽序列可操作地连接的第二肽序列。
第二肽序列通常地，但并不是必需地，与第一肽序列的氨基(N-)末端连接。
在某些实施方案中，第二肽序列包括阴离子的(带负电荷的)“前区”肽序列。这种前区肽用来中和dermaseptin或temporin的阳离子本质，因而在细胞环境中可以提供增强的稳定性。因此，这些前区通常包括大量的带负电荷的氨基酸，例如谷氨酸(Glu或E)和天门冬氨酸(Asp或D)。适合的前区包括发现在天然存在的未加工过的(全长)dermaseptin和temporin肽中的那些，以及阴离子的源自其它肽的前区，包括哺乳动物起源的那些，例如源自绵羊cathelin蛋白质的前区。包括这样的前区的融合肽可以以P-D或P-T表示，其中P为前区肽，T为temporin肽，D为dermaseptin肽。
尽管这样的前区肽可以直接连接入dermaseptin或temporin肽的N-末端，采用间隔肽以连接这两种肽是有益的。本领域中连接两种肽的间隔肽的应用是公知的；这种间隔肽通常长度在2和25氨基酸之间，并且提供一种连接第一肽序列至第二肽的灵活的铰合部。已经被用于提供连接两种肽的灵活的铰合部的间隔序列包括甘氨酸(4)丝氨酸间隔(GGGGS x3)，Chaudhary等人介绍，Nature 339394-397，1989。如上介绍的N-末端肽延伸还可用于提供间隔肽功能。包括前区肽、间隔肽和dermaseptin或temporin肽的融合肽可以表示为P-S-D或P-S-T，其中S表示间隔肽。
间隔序列也可包括剪切位点，例如由蛋白酶识别和剪切的肽序列。这样的位点有助于接着植物组织的纯化之后从dermaseptin或temporin肽中清除前区。
在下列章节更详细地介绍本发明的这些和其它的方面。序列表显示列在附随的序列表中的核酸和氨基酸序列，对于核苷酸碱基采用标准字母缩写，对于氨基酸采用三字母密码。每个核酸序列仅仅显示一链，但是通过参考显示的链应认为包括互补链。
SEQ ID1显示dermaseptin b cDNA序列。
SEQ ID2显示前体dermaseptin b肽(未加工过)的氨基酸序列。
SEQ ID3显示成熟dermaseptin b肽的27个氨基酸的序列。
SEQ ID4显示成熟dermaseptin B肽的31个氨基酸的序列。
SEQ ID5-14显示各种成熟(加工过)dermaseptin肽的氨基酸序列。
SEQ ID15显示一种编码temporin G的cDNA序列。
SEQ ID16显示temporin G前体(未加工过)形式的氨基酸序列。
SEQ ID17显示成熟temporin G肽的13个氨基酸的序列。
SEQ IDs18-26显示各种成熟(加工过)temporin肽的氨基酸序列。
SEQ ID27显示编码MSRA2的核酸序列。
SEQ ID28显示MSRA2的氨基酸序列。
SEQ ID29-32显示用于产生编码MSRA2的核酸序列的寡核苷酸。
SEQ ID33显示编码MSRA3的核酸序列。
SEQ ID34显示MSRA3的氨基酸序列。
SEQ ID35-38显示用于产生编码MSRA3的核酸序列的寡核苷酸。
SEQ ID39-41显示各种N-末端延伸序列的氨基酸序列。
图2是显示肽MSRA2(Dermaseptin B)和MSRA3(Temporin A)对大肠杆菌的抗菌作用的图。该细胞培养物在室温下在指定浓度的Dermaseptin B(DSB；7μg/ml，30μg/ml，和75μg/ml)，Temporin A(TA；75μg/ml，133μg/ml，200μg/ml)以及Temporin A和Dermaseptin B的组合(133μg/ml Temporin A和30μg/ml Dermaseptin B)存在时培养4小时，稀释并涂在LB板上。在于37℃培养过夜之后，对菌落计数并记下幸存的细菌。
图3是显示肽MSRA2(Dermaseptin B)和MSRA3(Temporin A)对胡萝卜欧文菌的抗菌作用的图。该细胞培养物于室温下，在指定浓度的Dermaseptin B(DSB；23μg/ml，45μg/ml)或Temporin A(TA；67μg/ml，133μg/ml)存在时培养4小时，稀释并涂在LB板上。在于28℃培养过夜之后，对菌落计数并记下幸存的细菌。
I.定义dermaseptin如本文采用的，术语“dermaseptin”指天然存在的称为dermaseptins的阳离子肽家族的任何成分，(Strahilevitz，Biochemistry，3310951-960，1994)，以及这些天然存在的肽的显示如下定义的dermaseptin生物活性的片段和变异体。
dermaseptin首先在南美州树蛙Phyllomedusa sauvagii的皮肤提取物中鉴别出(Mor等人，J.Biol.Chem.，26931635-31641，1994)。它们是广谱杀微生物的肽，可抑制细丝状真菌以及细菌、酵母和原生动物的生长(Strahilevitz，Biochemistry，3310951-10960，1994)。自从鉴别出第一个dermaseptin，即dermaseptin S，这个肽家族的大量的其它成分业已被表征和克隆，包括dermaseptin-b，分离自Phyllomedusa bicolor的皮肤(Mor等人，J.Biol.Chem.，26931635-31641，1994)，(SEQ ID2)；从Pachymedusa dacnicolor分离出两种dermaseptin，其由克隆PD-3-3和PD-2-2编码，如Wechselberger介绍的，Biochim.Biophys.Acta1388279-283，1998(分别为SEQ ID5-6所示的肽序列)；从Agalychnisannae分离出三种dermaseptin，其由克隆AA-3-6，AA-3-3，AA-3-1编码，如Wechselberger介绍的，Biochim.Biophys.Acta 1388279-283，1998(分别为SEQ ID7-9所示的肽序列)；以及源自Phyllomedusa sauvagii的五种dermaseptin肽，称为dermaseptin 5、dermaseptin 4、dermaseptin3、dermaseptin 2和dermaseptin 1，如Mor和Nicolas介绍的，JournalBiochemical Chemistry，2691934-1939，1994(分别为SEQ ID10-14所示的肽序列)。这些序列易于从公众数据库中得到，包括得自GenBank。
dermaseptin肽通常表达为大约60-80个氨基酸长度的前体形式，并且随后加工成大约27-34个氨基酸长度的成熟形式。例如，编码dermaseptin-b的cDNA(SEQ ID1；Amiche等人，J.Biol.Chem.2691747-1852，1994；Chapentier等人，Biol.Chem.27314690-14697，1998；位于GenBank核苷酸序列数据库，入藏登记号为X72387)编码78氨基酸长度的前体肽(SEQ ID2)。加工这种dermaseptin-b的前体形式以生产两种成熟形式，称为dermaseptin b和dermaseptin B(Strahilevitz，Biochemistry，3310951-10960，1994)。Dermaseptin b(SEQID3)长度为27氨基酸并且包括前体形式的49-75位氨基酸残基。Dermaseptin B是另一种长度为31个氨基酸的剪切产物，包括4个氨基酸的N末端延伸(AMWK)(SEQ ID4)。Dermaseptin B包括前体形式的45-75位氨基酸残基。除显示dermaseptin b全长前体形式的SEQ ID1和2之外，序列表显示的dermaseptin肽表示肽的加工过的、成熟形式。
假如可得到大范围dermaseptin肽序列和编码这些肽的核酸序列，本领域的普通技术人员，采用标准的分子生物学技术，能够容易地生产这些肽和它们相应的核酸序列。
除了采用以上介绍的天然存在的dermaseptin之外，采用与天然存在的dermaseptin肽稍微不同，然而在植物中表达时仍然赋予增强的广谱病原体抗性的肽，也可以实施本发明，这对于本领域的熟练技术人员而言是明显的。例如，成熟dermaseptin肽N-末端的螺旋状两性分子部分，尤其是前18个氨基酸残基，已经被证明对于抗菌活性重要(Mor等人，J.Biol.Chem.，26931635-31641，1994；Mor和Nicolas，Journal Biochemical Chemistry，2691934-39，1994)，并且该片段可用来代替全长dermaseptin。因此，术语“dermaseptin”也包括变异的dermaseptin肽，以及天然存在肽的片段，它们分享与天然存在的dermaseptin肽的特定序列同一性水平，或者通过一种或多种保守的氨基酸替换与天然存在的dermaseptin肽不同。
这些变异的肽和片段保留了dermaseptin生物活性，它可通过以下介绍的方法测定。变异的dermaseptin通常具有与天然存在的dermaseptin肽(例如SEQ ID3显示的那种)至少40％的氨基酸序列同一性，并通过以下介绍的方法测定。
dermaseptin生物活性dermaseptin肽抑制细菌生长和/或真菌生长的能力。通过采用以下给定的方案可容易地确定dermaseptin生物活性。
给定的dermaseptin肽的抗菌活性通过测定其抑制果胶分解性菌株例如胡萝卜欧文菌或大肠杆菌DH5的能力评估。通过在LB中连续地稀释肽并100∶1等分试样至96孔微量滴定板的孔中，测定给定肽的活性。新鲜的细菌培养物(～0.3 A550)接着在Luria-Bertani培养基(LB)中生长(1％w/v胰胨和0.5％w/v酵母提取物)并在LB中稀释至10-2以表示大约104-105菌落形成单位(CFU)ml-1。10∶1的细菌培养物然后接种入含有肽的孔中，样品在37℃培养4小时。孔的成分接着以LB稀释，涂在LB琼脂上并在37℃放置过夜。接着数与每个dermaseptin稀释液(和未加入肽的对照)相对应的菌落，试验下的肽的抗菌活性通过与对照板的比较测定。
本试验的条件下，如果它在7g/ml的浓度能够抑制至少10％的细菌生长(即，在此浓度，细菌菌落的数量不超过对照板的90％)，就测定dermaseptin肽具有生物活性。
给定dermaseptin肽的抗真菌生物活性通过利用真菌菌株仙人掌疫霉和/或茄病镰孢菌评估。所选择的真菌菌株在五种谷物琼脂(FiveCereal Agar，含有20gL-1五种谷物婴儿食物方便薄片以及8gL-1琼脂3的FCA(Terras等人，The Plant Cell 7573-588，1995)上生长。室温下生长5天之后，取出菌丝体塞并倒置在新鲜FCA板中心。试验肽的无菌溶液(10∶1)接着引入距板边缘3cm的孔中，在同一板上建立含无菌水的对照孔。在同一板上(或者在另外的板上)可以试验各种浓度的试验肽。试验板室温下培养5天，之后测量每个孔周围的生长抑制区。
在本试验条件下，如果它能够在5g/ml的浓度抑制真菌生长(即，含有这种浓度肽的孔周围有可辨别的抑制区)，就确定dermaseptin肽具有生物活性。
temporin如本文采用的，术语“temporin”指天然存在的称为temporins的阳离子肽家族的任何成分(Simmaco等人，Eur.J.Biochem.，242788-92.1996)，以及这些天然存在的肽的显示如下定义的temporin生物活性的片段和变异体。
temporin是最初从由Rana temporaria蛙皮肤制备的cDNA库中识别的具有抗菌活性的小型阳离子肽。这些肽显示与从Vespa蛇毒分离的溶血肽的一些序列相似性，然而，temporin肽并不是溶血的(Simmaco等人，Eur.J.Biochem.，242788-92.1996)。
temporin家族的十个成分，temporin A、B、C、D、E、F、G、H、K和L，已经由Simmaco等人介绍，Eur.J.Biochem.，242788-92.1996。类似dermaseptin，temporin通常表达为前体形式，随后加工以产生成熟形式。例如，编码temporin G的cDNA分子(示为SEQ ID15，位于GenBank核苷酸序列数据库，入藏登记号为Y09395)编码一种61个氨基酸的temporin G前体形式(示为SEQ ID16)。氨基酸1-22包括信号序列，氨基酸23-46包括前区，氨基酸47-59包括被加工的、成熟的temporin G肽(成熟形式示为SEQ ID17)。一般地，预计的成熟temporin肽长度在10和13氨基酸之间，一些已经被发现在C-末端酰胺化(Simmaco等人，Eur.J.Biochem.，242788-92.1996)。TemporinA、B、C、D、E、F、G、H、K和L的成熟形式分别示为SEQ ID18、19、20、21、22、23、17、24、25和26。
如果可得到大范围temporin肽序列和编码这些肽的核酸序列，本领域的普通技术人员，采用标准的分子生物学技术，能够容易地生产这些肽和它们相应的核酸序列。
除了采用以上介绍的天然存在的temporin肽之外，采用与天然存在的temporin肽稍微不同，然而在植物中表达时仍然赋予增强的广谱病原体抗性的肽，也可以实施本发明，这对于本领域的熟练技术人员而言是明显的。从而，术语“temporin”也包括变异的temporin肽，以及天然存在肽的片段，它们显示与天然存在的temporin肽的特定序列同一性水平，或者通过一种或多种保守的氨基酸替换与天然的temporin肽不同。
这样的变异的肽和片段保留了temporin的生物活性，这种生物活性可通过以下描述的方法测定。如以下描述的方法测定的，一种变异的temporin具有天然存在的temporin肽(例如SEQ ID17表示的那种)至少40％的氨基酸序列同一性。
temporin生物活性temporin肽抑制细菌生长的能力。
给定的temporin肽的抗菌活性通过测定其抑制果胶分解性菌株例如胡萝卜欧文菌或大肠杆菌DH5的能力评估。通过在LB中连续地稀释肽并100∶1等分试样至96孔微量滴定板的孔中测定给定肽的活性。新鲜的细菌培养物(～0.3 A550)接着在Luria-Bertani培养基(LB)中生长(1％w/v胰胨和0.5％w/v酵母提取物)并在LB中稀释至10-2以表示大约104-105菌落形成单位(CFU)ml-1。10∶1的细菌培养物然后接种入含有肽的孔中，样品在37℃培养4小时。孔的成分接着以LB稀释，涂在LB琼脂上并在37℃培养过夜。接着数与每个temporin稀释液(和未加入肽的对照)相对应的菌落，试验下的肽的抗菌活性通过与对照板的比较测定。
本试验的条件下，如果它在100g/ml的浓度能够抑制至少10％的细菌生长(即，在此浓度，细菌菌落的数量不超过对照板的90％)，就测定temporin肽具有生物活性，给定temporin肽的抗真菌生物活性通过利用真菌菌株仙人掌疫霉和/或茄病镰孢菌评估。所选择的真菌菌株在五种谷物琼脂(含有20gL-1五种谷物婴儿食物方便薄片，以及8gL-1琼脂3的FCA(Terras等人，The Plant Cell 7573-588，1995)上生长。室温下生长5天之后，取出菌丝体塞并倒置在新鲜FCA板中心。一种试验肽的无菌溶液(10∶1)接着引入距板边缘3cm的孔中，在同一板上建立含无菌水的对照孔。在同一板上或者在另外的板上可以试验各种浓度的试验肽。试验板室温下培养5天，之后测量每个孔周围生长抑制区。
在本试验条件下，如果它能够在5g/ml的浓度抑制真菌生长(即，含有这种浓度肽的孔周围有可辨别的抑制区)，就确定temporin肽具有生物活性。
转基因植物如本文采用的，该术语指含有通常未在该种野生型植物中发现的重组遗传物质的植物。从而，由通过转化被引入放重组DNA的植物细胞生长的植物是转基因植物，含有引入的转基因的植物的一切后代(无论是有性还是无性繁殖)也是。
序列同一性两个核酸序列，或者两个氨基酸序列之间的相似性，以序列之间共享的序列同一性的水平表示。序列同一性通常按照百分比同一性表示；百分比越高，两个序列越相似。
比较各种序列的对比方法在本领域是公知的。下列文献介绍了各种程序和对比算法Smith和Waterman，Adv.Appl.Math，2482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444，1988；Higgins & Sharp，Gene，73237-244，1988；Higgins & Sharp，CABIOS，5151-153，1989；Corpet等人，Nucleic Acids Research，1610881-10890，1988；Huang，等人，Computer Applications in the Biosciences，8155-165，1992；以及Pearson等人，Methods in Molecular Biology，24307-331，1994。Altschul等人，Nature Gene 6119-129，1994介绍了一种关于序列对比方法和同源性计算的详细的考虑。
可以从几种来源得到NCBI基本局部序列对比搜索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410，1990)，包括国家生物学信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和因特网上，以和有关序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/可以访问它。在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html可以得到如何采用该程序测定序列同一性的介绍。
用于本发明的天然存在的dermaseptin和temporin肽的变异体一般特征在于，当采用NCBI Blast 2.0.1对比时，与天然存在的temporin或dermaseptin的氨基酸序列全长对比，具有至少40％的序列同一性(Altschul等人介绍，Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)。为了比较超过约30个氨基酸的氨基酸序列，采用Blast 2序列功能，缺省BLOSUM62矩阵设置成默认参数(间隙存在值11，每个残基间隙值1)。当对比短肽(小于大约30个氨基酸)时，采用Blast 2序列功能，PAM30矩阵设置成默认参数(开放间隙9，延伸间隙1惩罚)，进行序列对比。当通过此方法评估时，具有与参考肽更高相似性的蛋白质会显示更高的百分比同一性，例如至少45％，至少50％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％或者至少95％的序列同一性。
重组重组核酸是一种具有非天然存在的序列，或者具有一种通过两个单独的序列片段的人工结合制备的序列。这种人工结合通过由化学合成完成，更通常地，通过对分离的核酸片段的人工操作，例如，通过基因工程技术完成。
寡核苷酸(oligo)一种长度至多大约100核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。
探针和引物基于本发明提供的氨基酸序列，可容易地制备核酸探针和引物。探针包括与可检测标记或报道分子连接的分离核酸。常规的标记包括放射性同位素、配体、化学发光剂和酶。标记方法和适用于各种目的的标记的选择指南，参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989和Ausubel等人，Current Protocals in Molecular Biology，Greene出版公司和Wiley-Intersciences，1987。
引物是短核酸，优选DNA寡核苷酸长15个核苷酸或更多。引物通过核酸的杂交可以被退火成互补的靶DNA链，以在引物和靶DNA链之间形成杂合体，接着通过DNA聚合酶沿靶DNA链延伸。引物对可以用于核酸序列的扩增，例如通过聚合酶链反应(PCR)或者其它的本领域公知的核酸扩增方法。
制备和使用探针和引物的方法参见，例如，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989；Ausubel等人，Current Protocals in Molecular Biology，Greene Greene出版公司和Wiley-Interscienes，1987；以及Innis等人，PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications，1990。PCR引物对可以由公知序列衍生，例如通过采用以例如引物为目标的计算机程序(0.5版，1991，Whitehead生物医学研究所，剑桥，MA)。本领域的熟练技术人员会理解特定的探针或引物的特异性随其长度增加。因此，例如，一种包括20个连续核苷酸的引物会与具有比相应的仅有15个核苷酸的引物更高特异性的靶退火。因而，为了获得更高的特异性，可选择包括20、25、30、35、40、50或更多连续性核苷酸的探针或引物。
分离的一种“分离的”生物成分(例如核酸或蛋白质或细胞器)是已经从天然存在该成分的生物体细胞中与其它的生物学成分基本上分离或者纯化，即与其它的染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器分离或从其中纯化出来。已经“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语也包含通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
载体一种核酸分子引入宿主细胞，因此产生一种转化宿主细胞。载体可以包括允许其在宿主细胞克隆的核酸序列，例如复制起点。载体也可包括一种或多种可选择的标记基因和其它的本领域公知的遗传因子。
可操作地连接当第一核酸序列与第二核酸序列以功能关联放置时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，启动子可操作地连接在编码序列上。一般地，可操作连接的DNA序列是邻接的，并且，必需将两个蛋白编码以符合同一读框的方式连接。通过正常的肽键，或者通过其它的共价连接，两个肽序列可以可操作地连接。
II.dermaseptin和temporin肽的选择a.dermaseptin肽以上提供了一些示范性的dermaseptin肽。编码这些dermaseptin多肽的核酸分子或者通过遗传密码简单应用衍生至该肽序列，或者可采用天然存在的cDNA或基因序列。例如编码dermaseptin-b的cDNA序列如SEQ ID1所示(并且公开在Amiche等人，J.Biol.Chem.2691747-852，1994)。一般地，选择适于表达的成熟形式的dermaseptin肽。然而，可以选择全长dermaseptin肽的任意片段，随具有dermaseptin生物活性的片段而定，如果它用于生产抗病原体植物。
本领域的普通技术人员可理解，具有不同程度的抗菌活性的各种dermaseptin肽，它具有比其它的更有效地抗某些病原体的作用。因此，当选择肽用于生产具有增强的耐病原体性的转基因植物时，在各种因素中，具体的dermaseptin的选择取决于要表达肽的植物的种类，以及通常感染那种植物种类的病原体的种类。
选择好所希望的要表达的dermaseptin，可通过标准分子生物学技术制备编码该肽的核酸分子。由于dermaseptin肽相对短，合成该核酸分子最简单的方法很可能是在商业上可得到的寡核苷酸合成仪上经由合成重叠寡核苷酸而进行。接着将寡核苷酸体外组装成全长编码区。这种方法也允许选择编码反映其中要引入核酸分子的植物的密码子使用偏向性的特定氨基酸残基的密码子，从而增强表达效率。在以下的实施例中提供采用这种方法的编码序列的产生的详细实例。
b.temporin肽以上提供了一些示范性temporin肽。编码这些temporin多肽的核酸分子或者通过遗传密码简单应用衍生至该肽序列，或者采用天然存在的cDNA或基因序列。例如，如SEQ ID15所示的编码temporin G的cDNA序列。一般地，选择适于表达的成熟形式的temporin肽。然而，可以选择全长temporin肽的任意片段，随具有temporin生物活性的片段而定，如果它用于生产抗病原体植物。
当选择dermaseptin肽时，本领域的普通技术人员可理解，具有变动程度的抗菌活性的各种dermaseptin肽，它具有比其它的更有效地抗某些病原体的作用。因此，当选择肽用于生产具有增强的耐病原体性的转基因植物时，在各种因素中，特别的temporin的选择取决于要表达肽的植物的种类，以及引起那种植物种类损失的病原体的种类。
如以上对dermaseptin的介绍，重叠寡核苷酸的合成和装配是一种简单和方便的生产编码temporin的核酸分子的方法。
c.其它肽序列的添加在转基因植物中temporin和dermaseptin蛋白也可以以融合蛋白的形式表达。尽管可以将选择的适于在植物中表达的temporin和dermaseptin蛋白与任何所希望的肽融合，但包括一种可操作地连接在dermaseptin或temporin氨基端的阴离子前区肽的融合蛋白的表达预期是特别有益的。为了这种目的可以采用任何阴离子前区肽，包括在天然存在的全长(即，未加工)dermaseptin和temporin肽中发现的阴离子前区。例如，包括temporin G的23-46位氨基酸的前区(显示为SEQ ID16)可以用作一种前区。这样的前区肽用以中和dermaseptin或temporin的阳离子本质，从而可在细胞环境中提供增强的稳定性。因此，这些区域通常包括大量的带负电荷的氨基酸，例如谷氨酸(Glu或E)和天门冬氨酸(Asp或D)。
本领域公知的其它的天然存在的前区肽的例子包括以下蛋白的前区肽人嗜中性防卫素蛋白(Daher等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，857327-7331，1988)；牛抗菌性cathelicidin蛋白BMAP28(Skerlavaj等人，J.Biol.Chem.27128375-381，1996)；绵羊抗菌性cathelin家族蛋白(Mahoney等人.，FEBS Lett.377519-522，1995)；牛indolicidin(DelSal等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.187467-472，1992)；猪抗菌肽prophenin-2和PR-39(Zhao等人，FEBS Lett.367130-134，1995)和PMAP-37(Tossi等人，Eur.J.Biochem，15941-946，1995)；人抗菌脂多糖结合蛋白CAP18(Larrick等人，Infect.Immun.631291-1297，1995)；以及鼠蛋白E3(Scott和Collins，Blood 882517-2530，1996)。
尽管阴离子前区肽可直接与阳离子肽N-末端结合，另一实施方案包括采用间隔肽序列连接前区肽至dermaseptin或temporin肽。在本领域连接两个肽域的间隔肽的使用是公知的；这样的间隔肽长度通常是2和25氨基酸之间，并提供灵活的连接第一肽序列至第二肽的铰合部。已经用于提供连接两个肽序列的灵活的铰合部的间隔序列包括甘氨酸glycine(4)-丝氨酸间隔(GGGGS x3)，由Chaudhary等人描述，Nature 339394-397，1989。如下介绍的N-末端肽延伸也可用于提供间隔肽功能。间隔序列肽也可包括剪切位点，例如由蛋白酶识别和剪切的肽序列，如因子Xa。这样的位点有助于在从植物组织中纯化之后从dermaseptin或temporin清除前区。在微生物体系中采用阴离子前区肽和间隔肽以表达某些阳离子肽在本领域是公知的，并且在授予Hancock的美国专利5,593,866中。
在某些实施方案中，N-末端延伸肽序列可以被加入dermaseptin或者temporin肽。这样的肽延伸可包括通常在蛋白加工期间清除的dermaseptin或temporin的前体形式的部分，或者可以是合成的序列。这些N-末端肽延伸用于提供增强的抗蛋白水解剪切性，增强转录水平或增强这些肽的抗菌活性。一般地，这些N-末端延伸长度在2和25氨基酸之间，尽管也可以采用更长的延伸。在某些实施方案中采用的N-末端延伸序列的例子包括肽序列AMWK、ASRH以及ALWK。AMWK(SEQ ID39)序列是天然存在的肽延伸；它是全长dermaseptin-b肽的部分，通常在加工过程中剪切掉。已经报道向dermaseptin b肽的N-端添加这种序列(以产生dermaseptin B)可增强该肽的体外抗菌活性(Strahilevitz，Biochemistry，3310951-10960，1995)。ASRH(SEG ID41)和ALWK(SEQ ID41)肽是合成的延伸序列。在每个情形下，加入N-末端的蛋氨酸以确保这种肽的合适的延伸。本领域的熟练技术人员可理解加入任何特定的N-末端延伸肽的对生产中的肽(dermaseptin或temporin)的生物学活性的影响，可以采用以上介绍的生物学活性试验容易地评估。
d.dermaseptin和temporin肽变异体如上描述的，大量的天然存在的temporin和dermaseptin肽是公知的，通过显示在序列表里的那些例示。通过引入氨基酸替换、添加的氨基酸残基或者通过删除氨基酸残基，可以选择这些天然存在的肽的变异体。这些变异肽或者通过化学合成生产(例如，以便确认这种变异肽保留功能活性)，或者在生物学表达体系中生产。在后一种情况下，可以操作编码相应天然存在的肽的核酸序列以便它编码变异肽。这可以通过许多方法实施，例如通过采用定点诱变或者聚合酶链反应。由于这种肽是相对短的分子，变异肽的编码区还可以简单地从头合成并引入适合的表达载体。
氨基酸序列的最简单的修饰包括用一种或多种氨基酸替换具有类似生物性能的氨基酸。这些所谓的保守替换很可能对所得的蛋白质活性具有最小的影响。因此，通过一种或多种保守的氨基酸替换与天然存在的temporin或dermaseptin不同的肽，在本发明中可以用于代替天然存在的肽。表1显示在蛋白质中可替换原始的氨基酸并且被认为是保守替换物的氨基酸。
表1原始残基 保守替换物Ala serArg lysAsn gln；hisAsp gluGln asnGlu aspGly proHis asn；glnIle leu；valLeu ile；valLys arg；gln；gluMet leu；ilePhe met；leu；tyrSer thrThr serTrp tyrTyr trp；pheVal ile；leu通过选择比表1的那些不保守的替换物，可以得到更多的在功能或其它特征上实质上的变化，即选择在其下述作用上明显不同的残基保持(a)替换区多肽骨架结构，例如，如折叠或螺旋构造，(b)靶位分子的电荷或疏水性，或者(c)侧链的大小。一般希望在蛋白性能上产生最大变化的替换物是那些基团，其中(a)一种亲水性残基，例如丝氨酰基或者苏氨酰基，替换掉疏水性残基，例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或者丙氨酰基(或被其替换)；(b)半胱氨酸或脯氨酸替换掉任何其它残基(或被其替换)；(c)一种带正电侧链的残基，例如赖氨酰基、精氨酰基、组氨酰基，替换掉带负电的残基，例如谷氨酰基或天冬氨酰基(或被其替换)；或者(d)具有大侧链的残基，例如苯丙氨酸，替换掉一种不具有侧链的基团例如甘氨酸(或被其替换)。本发明也可采用具有这些更实质的变化中的一种或多种的变异肽，条件是保留temporin或dermaseptin生物学活性。
更广泛的氨基酸变化也可在变异dermaseptin或temporin进行。然而如上注解的，采用以上介绍的对比程序与它们各自的天然存在序列的氨基酸序列全长对比时，这些变异肽通常特征在于，计算出它们具有至少40％序列同一性。此外，这些变异肽保留生物学活性。
采用以上介绍的试验体系可以确认dermaseptin或temporin肽具有生物学活性。确认肽具有希望的活性之后，采用标准分子生物学技术可以容易地生产编码该肽的核酸分子。合适时，开放读框的选择要考虑其中要表达肽的植物种的密码子使用偏向性。III.dermaseptin和/或temporin引入植物一旦生产了编码dermaseptin和/或temporin肽的核酸序列，可以采用标准技术以在转基因植物中表达该序列，以便赋予植物抗病原体性。基本方法是克隆核酸进入转化载体，这样以致于它可操作地与指引该核酸在植物细胞表达的控制序列(例如启动子)连接。这种转化载体接着通过许多技术中的一种(例如，电穿孔法)引入植物细胞，整个植物由这些细胞再生，选择含有这些引入的核酸的后裔植物。优选地，一切或者部分的转化载体稳定整合入植物细胞基因组。整合入植物细胞并含有引入序列以及用于控制表达的有关的序列(引入的“转基因”)的转化载体的那部分被称为重组表达盒。
含有引入转基因的后裔植物的选择可基于检测改变的表型进行。这样一种表型可直接来自引入序列所赋予的抗病力，或者作为导入到转化载体中的可选择的显性标记基因引入的结果，被证明具有对化学试剂(例如抗生素)增强的抗性。
在技术和科学文献中充满了特征为用克隆核酸序列转化的植物改性的成功的例子。所选择的用于说明本技术领域所述知识的例子包括美国专利5,571,706(“植物病毒抗性基因和方法”)美国专利5,677,175(“植物病原体诱导蛋白”)美国专利5,510,471(“用于植物转化的嵌合基因”)美国专利5,750,386(“抗病原体转基因植物”)美国专利5,597,945(“遗传增强抗病力的植物”)美国专利5,589,615(“通过已修饰的25贮存清蛋白的表达具有改善的营养值的转基因植物的生产方法”)美国专利5,750,871(“芸苔种的转化和外源基因表达”)美国专利5,268,526(“转基因植物中植物色素的超量表达”)美国专利5,780,708(“可繁殖的转基因玉米植物”)美国专利5,538,880(“可繁殖的转基因玉米植物的生产方法”)美国专利5,773,269(“可繁殖的转基因燕麦植物”)美国专利5,736,369(“转基因谷类植物的生产方法”)美国专利5,610,042(“小麦的稳定的转化方法”)。
这些例子包括介绍转化载体的选择、转化技术以及被设计用于超量表达所引入的转基因的构建体的构建。
a.植物种类由许多病原体引起的疾病作用于多种植物种。这些植物是单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。因此，例如，dermaseptin和/或temporin肽可以引入的植物种包括，但是并非限于，玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、一般意义的豆、油菜/菜籽(canola)、紫花苜蓿、亚麻、向日葵、红花、芸苔、棉花、烟草、亚麻、花生、三叶草、豇豆、葡萄；蔬菜，例如莴苣、西红柿、葫芦、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝卜、豌豆、小扁豆、甘蓝、花椰菜、椰菜、芽甘蓝、胡椒；树果实例如柑橘、苹果、梨子、桃子、杏、胡桃；毛皮树例如花旗松和火炬松；和花，例如康乃馨和玫瑰。
b.载体构建和启动子选择已经介绍了大量适于植物细胞稳定转染或者转基因植物确立的重组载体，包括在Pouwels等人，Cloning VectorsA Laboratory Manual，1985，supp.，1987；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，5173-184，1989；以及Gelvin等人，PlantMolecular Biology Manual，Kluwer学院出版社，1990中介绍的那些。通常，植物转化载体包括在5′和3′调节序列和显性选择标记控制下的一种或多种已克隆的序列。这样的植物转化载体通常也包含启动子调节区(例如，一种控制诱导或组成型、经环境或发育调节的、或者细胞或组织特异性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。可用于表达一种转基因的组成型植物启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，它能够在大多数植物组织中赋予组成型、高水平的表达(参见例如，Odel等人，Nature，313810，1985；Dekeyser等人，Plant Cell，2591，1990；Terada和Shimamoto，Mol.Gen.Genet.220389，1990；以及Benfey和Chua，Science，250959-966，1990)；胭脂氨酸合酶启动子(An等人，Plant Physiol.88547，1988)；章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等人，PlantCell，1977，1989)以及具有易位增强序列的2x CaMV/35S启动子(Kay等人，Science，2361299-1302，1987)。
响应环境、激素、化学和/或发育信号而被调节的各种植物基因启动子也可以用于在植物细胞中转基因的表达，包括由以下因素调节的启动子(a)热(Callis等人，Plant Physiol.，88965，1988；Ainley等人.，Plant Mol.Biol.，2213-23，1993；和Gilmartin等人，The Plant Cell，4839-949，1992)(b)光(例如，豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等人PlantCell，1471，1989，和玉米rbcS启动子，Schaffner & Sheen，Plant Cell，3997，1991)；(c)激素，例如脱落酸(Marcotte等人，Plant Cell，1471，1989)；(d)创伤(例如，马铃薯PinII启动子(Keil等人，Nucl.Acids.Res.145641-5650，1986)，农杆菌属mas启动子(Langridge等人Bio/Technology 10305-308，1989)，和葡萄藤vstl启动子(Weise等人.Plant Mol.Biol.，26667-677，1994)；和(e)化学品例如茉莉酮酸甲酯或水杨酸(亦参见Gatz等人.Plant Mol.Biol.4889-108，1997)。
组织特异性(例如根、叶、花和种子)启动子(Carpenter等人，ThePlant Cell 4557-571，1992；Denis等人，Plant Physiol.1011295-1304，1993；Opperman等人，Science 263221-223，1993；Stockhause等人，ThePlant Cell 9479-489，1997；Roshal等人，The EMBO J.61155，1987；Schernthaner等人，EMBO J.71249，1988；Yamamoto等人，Plant Cell3371-382，1990；and Bustos等人，Plant Cell 1839，1989)也可以被融合入编码序列以获得在各个器官中特定的表达。
植物转化载体也可以包括RNA加工信号，例如，内含子，它可以位于该转基因ORF序列的上游或者下游。此外，表达载体也可包括来自植物基因的3′-非翻译区的其它调节序列，例如，一种增强mRNA的mRNA稳定性的3′终止区，如马铃薯的PI-II终止区或者章鱼氨酸或胭脂氨酸合酶(NOS)3′终止区。
最后，如上注明的，植物转化载体也可包括显性选择标记基因，以允许易选择出转化体。这些基团包括编码抗生素抗性基团(例如，抗潮霉素、卡那霉素、博莱霉素、G418、链霉素或奇放线菌素)和抗除草剂基因(例如，膦丝菌素乙酰基转移酶)的那些。
c.转化和再生技术单子叶植物和双子叶植物的植物细胞的转化和再生现在是常规的，专业人员可以确定恰当的转化技术。方法的选择随待转化的植物类型改变；本领域熟练技术人员会识别特定方法对于给定植物种类的适当性。适当的方法包括，但并非限于植物原生质体的电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；采用病毒的转化；植物细胞微注射；植物细胞微粒轰击；真空渗入；以及根瘤农杆菌(AT)介导的转化。本章节开始列出的专利文献描述了转化和再生植物的典型步骤。
d.已转化植物的选择采用转化载体进行植物转化和再生后，通常采用掺入转化载体的显性选择标记选择已转化的植物。通常地，这样的标记会赋予已转化植物的秧苗以抗生素抗性，转化体的选择可通过暴露秧苗至适当浓度的抗生素完成。
选择也可通过利用经转基因赋予植物的病原体抗性完成。如以下实施例介绍的，这样的筛选或者在转基因植物已经再生之后完成，或者(取决于采用的转化方法)于植物再生之前在绿化转基因愈伤组织上进行。IV.含多阳离子肽编码区的植物一些情形下，由编码dermaseptin或temporin肽的转基因单一拷贝赋予的抗性水平，可以通过引入单一阳离子肽基因的多次拷贝或者编码不同阳离子肽的几个基因增强。
通过采用基因工程，将多阳离子肽编码区引入单一载体是可能的。通常地(尽管非必需地)，这样的载体包括两种或多种dermaseptin和/或temporin开放读框，每个可操作地与其自身5’和3’调节序列连接。当被引入植物时，这样的载体可导致多种阳离子肽的表达。
含多转基因的植物的创造也可通过采用标准育种技术完成。编码第一阳离子肽的转基因可以被引入第一植物，编码第二阳离子肽的第二转基因可以被引入第二植物。所得的转基因植物接着可杂交以生产载有两种转基因的后代。V.dermaseptin和temporin的生产和分离以上介绍的组合物和方法不仅可以用于生产具有增强的、广谱病原体抗性的植物，而且也可以用于适于广泛其它用途的dermaseptin和temporin的大规模生产。例如，植物中大量产生的temporin和dermaseptin可以纯化和用于医疗用途。
植物中生物活性肽的生产现在已广泛实施，大批的表达和纯化方法是公知的。促进植物中生物学活性蛋白产生的构建体例子可以在Goodman等人的美国专利4,956,282中发现。这些构建体例子通常包含启动子区和编码后来在纯化加工中利用的氨基酸序列的附加核酸序列。用于促进dermaseptin和/或temporin肽分离的氨基酸序列随后可以剪切且丢弃。
表2寡核苷酸#15’-ATG GCC ATG TGG AAA GAC GTT CTG AAA AAG(SEQ ID29)ATC GGT ACT GTC GCC CTC CAT GCA GGG-3’寡核苷酸#23’-TGA CAG CGG GAG GTA CGT CCC TTC CGG CGC(SEQ ID30)GAA CCT CGT CAT CGG CTG TGG TAG AGC GTC ATT-5’寡核苷酸#35’TCT AGA GGT ACC ATG GCC ATG TGG AAA GAC G-(SEQ ID31)3’寡核苷酸#43’-GGC TGT GGT AGA GCG TCA TTC TCG AGA CGT CTT(SEQ ID32)CGA AC-5’粗体核苷酸代表寡核苷酸#1和寡核苷酸#2之间的互补性区域。寡核苷酸#1的下划线部分与寡核苷酸#3的下划线部分一样，因此允许寡核苷酸#3与源自寡核苷酸#1和#2开始延长的PCR产物结合。同样地，寡核苷酸#4的下划线部分与寡核苷酸#2的下下划线部分一样。这允许寡核苷酸#4与由寡核苷酸#1和#2的延长创造的PCR产物结合。
b.temporin编码序列核酸分子设计为temporin A的成熟的13个氨基酸长度形式，其具有6个氨基酸的N-末端延伸序列，MASRHM(SEQ ID33)。这种核酸构建体命名为MSRA3并且在单一PCR反应中采用四个重叠寡核苷酸合成。采用的寡核苷酸如表3所示。头两个寡核苷酸(寡核苷酸#1和寡核苷酸#2)分别包含编码原型肽的核酸序列。然而，和用于编码原型dermaseptin肽的寡核苷酸不同，这些寡核苷酸是完全互补的，从而消除了在寡核苷酸#3和#4结合之前对起始延伸循环的需要。在PCR反应中采用的寡核苷酸#1和寡核苷酸#2的浓度为20nM。后两个寡核苷酸包含通过各种限制酶识别的序列。具体地，寡核苷酸#3包含XbaI、KpnI和NdeI的限制位点，寡核苷酸#4包含SstI和PstI的限制位点。在PCR反应中采用的这些寡核苷酸浓度为200nM。
产品扩增之后，采用嵌入限制位点将它克隆进常规的克隆载体。MSRA3编码区的核酸序列显示为SEQ ID33，已编码的肽显示为SEQID34。寡核苷酸#1-4显示为SEQ ID35-38。
表3寡核苷酸#15’-ATG TIT CTG CCC CTA ATC GGG AGG GTT CTC(SEQ ID35)TCG GGA ATC CTG TAA-3’寡核苷酸#23’-TAC AAA GAC GGG GAT TAG CCC TCC CAA GAG(SEQ ID36) AGC CCT TAG GAC ATT-5’寡核苷酸#35’-GGT ACC TCT AGA CAT ATG TTT CTG CCC CTA-3’(SEQ ID37)寡核苷酸#43’-GAG AGC CCT TAG GAC ATT CTC GAG ACG TC-5’(SEQ ID38)粗体核苷酸表示寡核苷酸#1和寡核苷酸#2之间的互补性区域。如表里描述的这些序列是完全互补的。寡核苷酸#2下划线部分与寡核苷酸#3下划线部分互补，寡核苷酸#1下划线部分与寡核苷酸#4下划线部分互补。
所得的双链DNA接着克隆进一种或多种以下描述的载体。2.含各种启动子序列的载体编码MRSA2和MRSA3的核酸序列装配入各种植物转化载体，从而将其置于各种不同的启动子控制下。
克隆MRSA2和MRSA3序列进入一种这样的载体，将不同的序列置于包含CaMV 35S启动子的两个拷贝和AMV RNA4翻译增强元件的启动子的控制下(Kay等人，Science 2361299-1302，1987)。由连接入该载体所得的克隆以前缀pD作为名称。因此，pDMSRA2表示包含在双CaMV 35S启动子和AMV RNA4翻译增强子控制下的含有MSRA2构建体的载体。同样地，pDMSRA3表示包含在双CaMV 35S启动子和AMV RNA4翻译增强子控制下的含有MSRA3构建体的载体。
设计了另一种载体，以使MSRA2构建体受重建“超级启动子”的控制。这种启动子包含在ocs(章鱼氨酸合酶)上游活化序列(反向)三联体之后的mas(甘露氨酸合酶)启动子/活化区(Langridge等人，Bio/Technology 10305-308，1989)。这种超级启动子更详细地介绍参见Ni等人，The Plant J.，7661-676，1995。这种特别的构建体也包括6×His标记的编码区，位于MSRA2编码区上游并可操作地与其连接。因此，将这种6×His标记氨基酸序列表达为附加至被编码的dermaseptin/MAMWK肽的N-末端。编码这种肽的载体被命名为pRSHMSRA2。3.马铃薯和烟草的转化马铃薯品种，Russert Burbank和Desiree，以及烟草被用作适于转化的代表性植物品种。按照DeBlock，Theoret.Appl.Genet.76767-774，1988，加以一些改变，来实施植物的转化。
简要地，通过从4周龄枝分离叶子(5mm)和茎来实施烟草和马铃薯的转化。切下这些叶和枝并且通过以玻璃移液管尖刮擦进一步损伤。受伤的叶子和茎接着在含15ml的S2培养基的皮氏培养皿中颠倒漂浮。这种培养基包含如Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15473-479，1962所列的成分，补充有30g/L蔗糖、pH 5.5的0.5g/L MES和20g/L甘露醇。
含有农杆菌(以感兴趣的载体转化)的60μl的LB培养基在后对数生长期加入每个培养皿，这些培养皿接着在低光强度(500lux)下在农杆菌存在下培养3天。接着以含有1g/L羧苄青霉素的S2培养基洗涤植物组织，以滤纸吸干，颠倒置入S4培养基。S4培养基包含Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15473-479，1962列出的成分，减去蔗糖并补充200mg/L谷氨酸、pH 5.7的0.5g/L MES、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺膘呤-SO4、0.5％琼脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/L NAA、1g/L羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素、10mg/L AgNO3)。室温(RT)下在3000lux下放置植物组织样品以允许愈伤组织形成。两周之后，在叶和茎的伤口边缘形成了许多小愈合组织(Calli)。取出小愈合组织并转移入新鲜S6培养基(不含NAA的S4)。2-3周之后，这些愈合组织转移入S8培养基(补充了0.1mg/L GA3的S6)以允许形成芽。
在S8培养基放两周之后，第一批芽(0.5cm)转移至S1培养基。该培养基包含Gamborg等人描述的成分(Exp.Cell Res.50151-158，1968)，并还加入20g/L蔗糖、150mg/L CaCl2、pH 5.8的0.4％琼脂糖、1g/L羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素。S1培养基和芽放入Magenta瓶以允许根形成。一周之后芽已生根。为了避免选择相同的根，避免从同一或紧密连接的愈合组织转移芽。
再生的推定的转基因植物转入含1g/L羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的MS培养基以进一步分析。4.抗病性愈合组织的筛选发展了适于抗病试验的简化早期检测方法。对照和转基因愈合组织生长在S4培养基(MS培养基，其中无蔗糖并补充200mg/L谷氨酸、pH 5.7的0.5g/L MES、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺嘌呤-SO4、0.5％琼脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/LNAA、1g/L羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素、10mg/L AgNO3)。样品接着在RT和3000lux下放置以允许愈伤组织形成。两周之后，在叶和茎的伤口边缘形成了许多小愈合组织。取出小愈合组织并转移入新鲜S6培养基(无NAA的S4)。2-3周之后，愈合组织转移至新鲜培养基并在植物病原体，镰孢菌属或疫霉属存在的条件下生长。实验结尾，记下存活并保持明亮绿色的愈合组织。在对照样品中未发现抗真菌性愈合组织，发现抗真菌病原体的愈合组织已转化。5.转基因植物的分子鉴定采用以下描述的方法从转基因马铃薯和烟草植物中分离DNA。进行纯化，在某些情形下涉及一种更严格的方案，在其它情形下涉及一种简单的粗提取步骤。通过获得10克的新鲜叶组织并且立即在液氮中冷冻样品，开始更严格的提取步骤。冷冻过的组织接着研成细粉并以20ml提取缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液、5mM EDTA、0.35M山梨醇、0.1％BSA、0.1％β巯基乙醇、10％PEG 4000)提取。通过几层粗棉布和一层微孔布过滤匀浆。接着按照Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.842097-5100，1987，实施最后的纯化步骤。
当为PCR分析目的进行分离时，主要采用粗提取步骤。对于此步骤，收集大约200mg的新鲜叶并在液氮中研成粉状。100μl的0.5NNaOH加入粉末中并混合(旋转)30秒。这种悬浮液离心5分钟，5μl上清液加入45μl的100mM的Tris缓冲液(pH 8.0)中。这种粗基因组DNA提取物被用作PCR扩增的模板。
通过用提取的基因组DNA和以上表2的寡核苷酸#3和#4实施PCR反应，进行MSRA2构建体存在与否的检测。来自此反应的期待的产物大小是129bp。这种方法允许鉴定用pDMSRA2或pRSHMSRA2构建体转化的转基因烟草和马铃薯。
通过用上表3的寡核苷酸#3和#4，或者以特异性针对2×35SCaMV启动子的引物和上表3的寡核苷酸#4的组合，实施PCR反应，进行MSRA3构建体的检测。鉴别出含有pDMSRA3构建体的转基因烟草植物。
在含有在ocs(章鱼氨酸合酶)上游活化序列(反向)的三联体之后的mas(甘露氨酸合酶)启动子/活化区的超级启动子的控制下，也将对照植物改造成包含GUS基因(Ni等人，The Plant J.7661-676.1995)。经PCR技术确认这种转基因已插入烟草植物基因组。
某些情形下，通过Northern印迹分析确认转基因的活性表达。从转基因烟草和马铃薯植物中分离和纯化出用于这些实验的RNA底物。按照Verwoerd等人，Nucl.Acids Res.172362，1989，实施用于这种分离的方案。6.抗细菌病原体性为了检测这种转基因马铃薯和烟草植物对细菌病原体胡萝卜欧文菌的抗性，室温下让这种细菌在LB培养基生长整夜(A600＝2.9)。2ml等分量的欧文菌培养物在dH2O中稀释5倍，1ml稀释的培养物加入2ml MS液体培养基中并用于这种抗菌试验。从转基因植物或对照植物上新切的枝(～3.5cm)插入含有已稀释的欧文菌培养物的试管以致该植物切边的底部浸入细菌培养物中。试验管室温下在3000lux培养下并间歇地观察。
含有pDMSRA2的转基因马铃薯植物和含有pDMSRA2或pRSHMSRA2的转基因烟草植物如上介绍进行试验，并显示抗病原体性在细菌培养物存在下生长一周之后，这种转基因植物未受感染(通过视觉检查确定)并持续生长。大不相同地，与细菌培养物斗争的对照植物在培养一周之后严重感染，生长被抑制，在暴露至真菌病原体2-3周之后植物死亡。
为了检测转基因马铃薯块茎对细菌病原体Erwinia carotovora cvcarotovora的抗性，在块茎圆盘上开一小孔(直径2cm，厚3cm)。20微升的100x稀释的隔夜的细菌培养物(大约2×107CFU)移放孔中，盘在室温下培养6天。从盘上轻轻地清除腐烂的组织，测定块茎组织的重量损失。由此试验得到的结果显示，与非转基因对照组比较，转基因的马铃薯组织抗软腐病(
图1)。
在微量滴定板中，以含有大约1×105细菌/ml和指定浓度抗菌肽的220μl最后体积，测定抗菌肽(SEQ ID NO34(MRSA3)和SEQ ID NO28(MRSA2))对抗大肠杆菌(图2)和胡萝卜欧文菌(图3)的抗菌作用。细胞培养物室温下培养4小时，稀释并涂在LB板上。在37℃(大肠杆菌)或28℃(胡萝卜欧文菌)过夜培养之后，菌落计数并记录存活的细菌。两个试验结果显示该肽具有显著的抗菌活性。7.抗真菌性采用下列方案测定成熟植物对各种真菌的抗性。切1cm2×0.5cm的包含镰孢菌属或疫霉属(Phytophthora sp.)培养基片并放入9cm的培养皿中的V8琼脂培养基(250ml/L V8汁，7克/L琼脂)新鲜板的中心，并在室温下生长大约一个月，或者直到真菌菌丝体彻底覆盖该培养皿。切下转基因植物的芽(～10cm)并转入MS培养基以进一步生长。按照各种处理，允许植物生长3天或2周直到芽生根。不伤害植物，接着将两片1cm2×0.5cm的真菌琼脂切片施加至植物芽的两侧。然后视觉确定所得的感染程度。
在典型的试验中，以pDMSRA2转化的转基因马铃薯植物，以pRSHMRSA2或pDMSRA2转化的烟草植物，以及对照的马铃薯和烟草植物暴露在仙人掌疫霉下。7天之后，仙人掌疫霉已在MS培养基的整个表面生长，并透入对照植物的根和茎，引起对重要植物功能的损害。对照植物的根被严重损害，这是明显的。植物和真菌之间相互作用引起指示腐败过程的黄-棕色色素的分泌。随后，植物失水，叶子卷曲，茎的底部变柔软，根死亡。然而，转基因植物依然健康并无疾病症状，即使真菌菌丝体完全覆盖MS培养基。
以上介绍的实施也用于试验转基因植物对蔓延疫霉的抗性。这些试验结果显示转基因植物对蔓延疫霉也具有抗性。
进行用茄病镰孢菌进攻pDMSRA2转基因马铃薯植物的另一项实施。6天之后，镰孢菌生长遍及MS培养基表面，在对照植物中对根的损害是严重的，镰孢菌穿入茎基底部，茎软化，感染的叶子的叶脉显示出清晰的褐变和坏死。几天之后，对照植物萎缩并死亡。然而，转基因植物持续生长，即使在茄病镰孢菌的严重侵袭下。
在多个实施方案和实施例中已经举例说明和介绍了本发明的原理，不背离这些原理在安排和细节上改变本发明，对本领域熟练技术人员而言是明显的。我们要求保护一切在随后权利要求中的精神和范围内的一切改变。
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序列表<110>桑托什·米斯拉比尔·凯<120>抗广谱病原体的转基因植物<130>54447<140><141><150>60/125，072<151>1999-03-17<160>41<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>443<212>DNA<213>Phyllomedusa bicolor<220><221>CDS<222>(58)..(294)<400>1ccacgcgtcc gattctgtcc tccagtactc aacacattct gaattgtaag aacaaac57atg gat atc ctg aag aaa tct ctt ttc ctt gta tta ttc ctt gga ttg 105Met Asp Ile Leu Lys Lys Ser Leu Phe Leu Val Leu Phe Leu Gly Leu1 5 10 15gtt tcc ctt tcc atc tgt gaa gaa gag aaa aga gaa aat gaa gat gag 153Val Ser Leu Ser Ile Cys Glu Glu Glu Lys Arg Glu Asn Glu Asp Glu20 25 30gag aaa caa gat gac gag caa agt gaa atg aag aga gct atg tgg aaa 201Glu Lys Gln Asp Asp Glu Gln Ser Glu Met Lys Arg Ala Met Trp Lys35 40 45gat gtg tta aaa aaa ata gga aca gtg gcc tta cat gca gga aaa gcg 249Asp Val Leu Lys Lys Ile Gly Thr Val Ala Leu His Ala Gly Lys Ala50 55 60gct tta ggt gca gtt gct gat aca ata agt caa gga gag caa taa 294Ala Leu Gly Ala Val Ala Asp Thr Ile Ser Gln Gly Glu Gln65 70 75agtgaaaaaa atttaaaatt gaattactct aaatagaaca attagcaata attgtgtcaa 354acctacatta aagcatactg aaccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 414aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 443<210>2<211>78<212>PRT<213>Phyllomedusa bicolor<400>2Met Asp Ile Leu Lys Lys Ser Leu Phe Leu Val Leu Phe Leu Gly Leu1 5 10 15Val Ser Leu Ser Ile Cys Glu Glu Glu Lys Arg Glu Asn Glu Asp Glu20 25 30Glu Lys Gln Asp Asp Glu Gln Ser Glu Met Lys Arg Ala Met Trp Lys35 40 45Asp Val Leu Lys Lys Ile Gly Thr Val Ala Leu His Ala Gly Lys Ala50 55 60Ala Leu Gly Ala Val Ala Asp Thr Ile Ser Gln Gly Glu Gln65 70 75<210>3<211>27<212>PRT<213>Phyllomedusa bicolor<400>3Asp Val Leu Lys Lys Ile Gly Thr Val Ala Leu His Ala Gly Lys Ala1 5 10 15Ala Leu Gly Ala Val Ala Asp Thr Ile Ser Gln20 25<210>4<211>31<212>PRT<213>Phyllomedusa bicolor<400>4Ala Met Trp Lys Asp Val Leu Lys Lys Ile Gly Thr Val Ala Leu His1 5 10 15Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Asp Thr Ile Ser Gln20 25 30<210>5<211>36<212>PRT<213>Pachymedusa dacnicolor<400>5Gly Met Trp Ser Lys Ile Lys Asn Ala Gly Lys Ala Ala Ala Lys Ala1 5 10 15Ser Lys Lys Ala Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Val Ser Glu Ala20 25 30Leu Gly Glu Gln35<210>6<211>31<212>PRT<213>Pachymedusa dacnicolor<400>6Ala Leu Trp Lys Thr Leu Leu Lys Lys Val Gly Lys Val Ala Gly Lys1 5 10 15Ala Val Leu Asn Ala Val Thr Asn Met Ala Asn Gln Asn Glu Gln
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1.一种表达阳离子肽的转基因植物，所述阳离子肽选自(a)temporin；和(b)dermaseptin。
2.一种包含重组核酸分子的转基因植物，其中所述核酸分子编码选自以下的肽(a)temporin；和(b)dermaseptin。
3.按照权利要求2的转基因植物，其中所述肽包括一种氨基酸序列，该序列选自由SEQ ID3-14和17-26列出的氨基酸序列。
4.按照权利要求3的转基因植物，其中所述肽进一步包括2-25个氨基酸长度的N末端肽延伸。
5.按照权利要求4的转基因植物，其中所述N末端肽延伸选自AMWK、ASRH和ALWK。
6.一种包含重组核酸分子的转基因植物，其中所述核酸分子编码融合肽，该肽具有选自以下的式(a)P-D；和(b)P-T，其中D是dermaseptin肽，T为temporin肽，并且P是阴离子前区肽。
7.一种包含重组核酸分子的转基因植物，其中所述核酸分子编码融合肽，该肽具有选自以下的式(a)P-S-D；和(b)P-S-T，其中D是dermaseptin肽，T为temporin肽，P是阴离子前区肽，S为间隔肽。
8.一种包含核酸分子的转基因植物，所述核酸分子编码一种包含选自以下的氨基酸序列的肽(a)SEQ ID3-14及其片段；(b)通过一种或多种保守氨基酸替换与(a)指定的氨基酸序列不同的氨基酸序列；和(c)具有与(a)指定的氨基酸序列的至少40％同一性的氨基酸序列，其中所述肽具有dermaseptin的生物学活性。
9.按照权利要求8的转基因植物，其中所述肽进一步包括与所述肽的N-末端可操作地连接的阴离子前区肽。
10.一种包含核酸分子的转基因植物，所述核酸分子编码一种包含选自以下的氨基酸序列的肽(a)SEQ ID17-26和其片段；(b)通过一种或多种保守氨基酸替换与(a)指定的氨基酸序列不同的氨基酸序列；和(c)具有与(a)指定的氨基酸序列的至少50％同一性的氨基酸序列，其中所述肽具有temporin的生物学活性。
11.按照权利要求8的转基因植物，其中所述肽进一步包括与所述肽的N-末端可操作地连接的阴离子前区肽。
12.一种包含重组核酸分子的转基因植物，所述核酸分子编码一种包含氨基酸序列的肽，所述序列选自SEQ ID28和34。
13.一种生产生物学活性阳离子肽的方法，包括提供按照权利要求1的转基因植物；和从该植物中分离出至少一种生物学活性阳离子肽。
全文摘要
公开了表达dermaseptin和/或temporin肽的转基因植物。在某些实施方案中,这些植物具有增强的、广谱病原体抗性并可用作农业或园艺作物。在其它实施方案中,该植物用于生产大量的dermaseptin和/或temporin肽。
文档编号C12N5/10GK1351667SQ00805132
公开日2002年5月29日 申请日期2000年3月16日 优先权日1999年3月17日
发明者桑托什·米斯拉, 威廉·W·凯 申请人:维多利亚大学创新和发展公司