专利名称：生产截短型重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种构建基因工程菌生产截短型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)的方法，属生物技术领域。
1965年美国医师Urist发现脱钙的骨基质有诱导异位成骨作用，他认为在脱钙的骨基质中含有一种能诱导新骨形成的物质，并将其命名为骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)。1988年他领导的研究小组在世界上首先分离出4种人的不同的BMP。最近人们又成功地克隆了另外15个人BMP的基因，这些都为BMP的研究提供了很好的材料。除BMP-1之外，它们都是转化生长因子TGF-β超家族成员，彼此之间无论在基因或蛋白质结构上，还是在生物学功能上都非常相似。
BMP的生物学作用无明显的种属特异性，具有跨种诱导成骨的能力。比如，在小鼠股部肌肉中植入0.1mg/kg体重的BMP，2～3周即可出现软骨。新骨的发生量与BMP的植入量呈正相关。在临床上，如果骨缺损范围较大，一般不可能自行修复愈合，通常采用自体骨、异体骨或异体脱钙骨基质以及某些生物材料进行移植修复。在这种情况下，由于骨缺损修复的速度和修复骨的强度的不同，以及微生物的污染以及异体脱钙骨的排斥反应等问题，对疾病的治疗都带来影响。因此，用重组人BMP修复骨的缺损受到了普遍的重视。Bolande发现，如果将BMP与脱钙骨基质粉混合植入，将提高修复能力。这种混合物用于兔尺骨干2cm长的缺损，其效果明显优于单纯脱钙骨或自体骨移植对照组。自然界中BMP虽然广泛存在于各种动物的骨组织中，但含量极低，以人BMP-2为例，每公斤骨仅含几十～几百微克，难以满足临床应用需要。利用基因工程的方法大规模生产有生物活性的BMP是极富吸引力的方法。自1988年美国的Genetics Institute克隆出4个人的BMP的cDNA以来，国外学者又克隆出11个新的BMP。其中对重组人BMP-2(rhBMP-2)的结构与功能的研究最为深入。
Genetics Institute公司将人的人BMP-2cDNA转入真核工程细胞中(如COS和CHO细胞)表达。但用CHO细胞生产的rhBMP-2成本很高且产量较低，价格昂贵不适合我国的临床实际需要。寻找新的方法势在必行。
本发明的目的是提供一种成本低，能形成产业化生产截短型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)的方法。
本发明的技术方案是用重组DNA技术构建截短型人BMP-2基因(BMP-2-108)，并在大肠杆菌中高效表达这个基因，得到有生物活性的rhBMP-2-108蛋白质。本发明的方法包括以下步骤1)人工合成编码人BMP-2羧基端107个氨基酸残基的核苷酸序列天然人BMP-2成熟肽由114个氨基酸残基组成。实验证明在人BMP-2成熟肽的N端第一个半胱氨酸之前有两组三个成串的碱性氨基酸残基组成的片段的丢失并不影响其生物活性。第55位的天冬氨酸残基上有一个潜在的糖基化位点，糖基化作用与其生物半衰期有关，而与活性无关。为了在大肠杆菌系统中更高效地表达人BMP-2成熟肽，首先合成了其羧基端的107个氨基酸残基的基因编码序列，并在第一个氨基酸残基的密码子之前加上了起始密码子ATG和限制性内切酶的识别位点，将第二个氨基酸精氨酸残基突变为赖氨酸残基和在最后一个氨基酸残基的密码子之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶的识别位点，构建截短型人BMP-2基因SEQ IDNO1长度324bp类型脱氧核糖核酸链数双链几何结构线性来源人工合成特征编码人BMP-2成熟肽羧基端的107个氨基酸残基的序列人BMP-2-108的基因编码序列5’ ATG AAA AAA CTG AAA TCC TCC TGC AAA AGA CAT CCG CTG TATGTG GAT TTT AGC GAT GTG GGC TGG AAC GAT TGG ATT GTG GCGCCG CCG GGC TAT CAT GCG TTT TAT TGC CAT GGC GAA TGC CCG TTTCCG CTG GCG GAT CAT CTG AAC TCC ACC AAC CAT GCG ATT GTGCAG ACC CTG GTG AAC TCT GTG AAC AGC AAA ATT CCG AAA GCGTGC TGT GTG CCG ACC GAA CTG AGC GCG ATT TCG ATG CTG TATCTG GAT GAA AAC GAA AAA GTG GTG CTG AAA AAC TAT CAG GAT ATGGTG GTG GAA GGT TGT GGC TGT CGC TAA 3’人BMP-2-108的氨基酸残基序列MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR2)构建含BMP-2-108基因的表达载体将合成的BMP-2-108基因和含有与该基因相同限制性内切酶识别位点的载体分别用相关的限制性内切酶切开，酶切温度为25～38℃，酶切时间为1～5小时。然后将酶切产物进行1～2％的琼脂糖凝胶电泳，用常规方法从凝胶中回收并纯化载体和基因两个DNA片段。再将两个片段同时置于T4DNA连接酶反应缓冲液中，加入T4DNA连接酶，在4～22℃下进行为时1小时～1周的连接反应，其中所使用的基因表达载体或为化学试剂诱导插入基因表达的载体，或为通过温度变化诱导插入基因表达的载体。
加在合成基因首、末两端的限制性内切酶识别位点可以为Ndel和BamHl，或者也可以是Ncol和HindIII，前者相关的基因表达载体可以用购自美国Novagen公司的含有Ndel和BamHl两个酶切位点的pET系列的化学试剂诱导型载体或pJLA系列的温度诱导型载体。后者基因表达载体可选用购自美国Promega公司的含有Ncol和HindIII两个酶切位点的pTrc99A载体。实验中所用的限制性内切酶及酶切缓冲液为TAKARA公司产品。
3)采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞用无菌铂丝直接蘸取冻存的大肠杆菌，在LB平板表面划线，于25～38℃下培养10～20小时。将1个分隔良好的单菌落接种到50～100毫升LB培养液中，在25～38℃下，以150～300次/分钟的振荡速度培养至OD600＝0.3～1.0。将培养物装于离心管内，置冰上5～20分钟。随后，将培养物于2～6℃离心5～20分钟，速度为1500～2000g。将离心所得的沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮之后，第二次在2～6℃下离心5～7分钟，速度为1000～1500g。将离心所得沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮，冰上放置28～32分钟。然后第三次在2～6℃下离心5～7分钟，速度为1000～1500g。将离心所得沉淀用2～5毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮。最后按每管100～200微升的量将悬浮液分装于无菌离心管中，将管口密封后，立即冻于-70℃。
4)将上述第2)步所得的连接反应物与第3)步所得的感受态细菌混匀，在冰上放置10～50分钟，接着在42℃的水浴中放置30～150秒，再冰浴1～10分钟，然后加入0.5～5毫升的LB培养基，在28～38℃的水浴或培养箱中温浴20～120分钟。随后，将150～250微升被转化的感受态细胞涂布到含有相应抗生素的LB平板上，将平板置于室温下直至液体被吸收后，倒置平板，于25～38℃培养箱中培养10～30小时后，即可出现重组菌的菌落，完成质粒的转化步骤；抗生素可以用卡那霉素、氨苄青霉等，针对不同的载体，选用相应的抗生素，如采用pET系列中的pET9a为载体，则用卡那霉素，采用pET-11b为载体，则用氨苄青霉素。
5)从被转化的重组大肠杆菌的固体平板上挑取单菌落，接种于装有1～10毫升LB培养液的试管中，在25～38℃的温度下中速振荡培养6～15小时，再对收获的菌体采用常规的碱裂解法抽提质粒DNA；6)将上述抽提的DNA用限制性内切酶酶切鉴定，酶切温度为30～37℃，酶切时间为1～3小时。正确重组子中应当含有300～400bp(BMP-2-108)及5～6kb(载体DNA)的酶切片段。凡能切出上述大小酶切片段的克隆即为转化了新的基因(rhBMP-2-108)的克隆，构建基因工程菌获得成功(此基因工程菌种已保存在中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO.M201011)。
7)在含葡萄糖的LB培养基中培养基因工程菌按1％的接种量将基因工程菌接入5～10毫升的LB培养基中，以100～200次/分速度振荡培养2～3小时。对以化学试剂诱导插入基因表达的载体，培养温度是30～32℃；对通过温度变化诱导插入基因表达的载体，培养温度是28～30℃。
8)rhBMP-2-108基因的诱导表达。在进行7)步骤后，按1％的比例，将培养物接种到含有200～500毫升LB培养基的三角烧瓶中，以200～300次/分振荡速度，按照步骤7)指定的培养温度下将基因工程菌培养至OD600＝1.2～1.4，培养时间为10～12小时。然后，接入大罐中的LB培养基中继续培养。接种量为5∶1(培养液∶种子液)，pH7.0。对于以化学试剂诱导插入基因表达的基因工程菌，培养温度为30～32℃，振荡速度100～600转/分，培养4个小时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导3～4小时，然后在8000～10000转/分离心收集菌体；对于通过温度变化诱导插入基因表达的基因工程菌则将培养温度迅速升到42～45℃，并在剧烈震荡下继续培养3～4小时，然后在8000～10000转/分离心收集菌体。
9)用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组蛋白质，经复性，分离，纯化后，获得本发明的产品截短型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)试验表明，本发明通过构建截短型人BMP-2基因而得到的表达量高的重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽，更易于纯化和复性，因而有更高的生物活性。相对而言，国内外一些实验室和生产部门在进行相关工作时，却因无法进一步复性和纯化大肠杆菌产生的人全长BMP-2，使工作只停留在实验室水平，无法进入医药用阶段，更难以形成产业化。本发明的基因工程菌所产生的人截短型BMP-2的量达到细菌总可溶蛋白量的30～50％，本发明建立的重组蛋白分离纯化技术简便实用，有利于大量生产医疗用的BMP-2，为其用于临床，造福病人奠定基础。
图1为含有合成的截短型人骨形态发生蛋白-2成熟肽基因的，IPTG诱导表达型载体(pET11b-BMP-2-108)图2为含有合成的截短型人骨形态发生蛋白-2成熟肽基因的，温度诱导表达型载体(pJLA503-BMP-2-108)图3为pET11b-BMP-2-108的NdeI和BamHI两个限制性内切酶酶切鉴定，图中M1和M2为分子量标准，1～6为不同的样品；A为载体片段(5.7Kb)，B为插入的基因片段(324bp)图4为截短型重组人骨形态发生蛋白-2的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中M为分子量标准(从上到下依次为97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)，C为未经IPTG诱导的对照样品，1-5为经IPTG诱导的样品，箭头所指处为BMP-2-108蛋白图5为重组人骨形态发生蛋白-2的Western blot图，箭头所指处为BMP-2-108图6为纯化的重组人骨形态发生蛋白-2的毛细管电泳分析图，表明其纯度超过97％，横座标为时间(分钟)，纵座标为光吸收值。
以下通过实施例进一步说明本发明。实施例1用化学试剂诱导型表达载体生产截短型人BMP-2成熟肽的方法本发明的方法包括如下步骤1)人工合成编码人BMP-2羧基端107个氨基酸残基的核苷酸序列首先合成了其羧基端107个氨基酸残基的基因编码序列，并在第一个氨基酸残基的密码子之前加上了起始密码子ATG和限制性内切酶Ndel的识别位点，将第二个氨基酸精氨酸残基突变为赖氨酸残基和在最后一个氨基酸残基的密码子之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶BamHl的识别位点。构建成截短型人BMP-2基因SEQ IDNO1长度324bp类型脱氧核糖核酸链数双链几何结构线性来源人工合成特征编码人BMP-2成熟肽羧基端的107个氨基酸残基的序列人BMP-2-108的基因序列5’ ATG AAA AAA CTG AAA TCC TCC TGC AAA AGA CAT CCG CTG TATGTG GAT TTT AGC GAT GTG GGC TGG AAC GAT TGG ATT GTG GCGCCG CCG GGC TAT CAT GCG TTT TAT TGC CAT GGC GAA TGC CCG TTTCCG CTG GCG GAT CAT CTG AAC TCC ACC AAC CAT GCG ATT GTGCAG ACC CTG GTG AAC TCT GTG AAC AGC AAA ATT CCG AAA GCGTGC TGT GTG CCG ACC GAA CTG AGC GCG ATT TCG ATG CTG TATCTG GAT GAA AAC GAA AAA GTG GTG CTG AAA AAC TAT CAG GAT ATGGTG GTG GAA GGT TGT GGC TGT CGC TAA 3’人BMP-2-108的氨基酸残基序列MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR2)构建含BMP-2-108基因的表达载体用化学试剂诱导型表达载体pET-11b，将合成的BMP-2基因，(起始端含Ndel酶切位点，终止端含BamHl酶切位点)，与pET-11b分别经Ndel和BamHl双酶切处理，酶切条件为37℃温育3小时。然后将酶切产物用1～2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳30分钟，电压70伏。用Bio101纯化试剂盒纯化上述两个DNA片段。其过程为用干净手术刀切下目的片段，分别放入两个1.5毫升离心管中。加200～500微升Nal，置于温水(45～55℃)中至胶完全融化。将玻璃珠(Glassmilk，为Bio101纯化试剂盒中的商品)涡旋1分钟，取7微升加入上述两管，冰上放置5分钟，每1-2分钟混匀一次。将两管在13000g下离心5秒。去上清，再将沉淀物重悬浮于500微升New Wash液。而后又在13000g下离心5秒。再去上清。重复上述步骤二次(重复悬浮，离心三次)。最后一次小心吸净上清。在空气中干燥5～10分钟。将沉淀用17～50微升TE溶解，在13000g下离心2分钟。小心吸出上清，分别移至两个新的1.0ml离心管中。从上述两管DNA中吸取适量加入一个1.0ml离心管中。其中包括DNA片段1～17微升，T4 DNA连接酶(MBI公司)1μl，10倍浓度DNA连接缓冲液2微升，加水至总体积为20微升。混匀后略加离心，于22℃进行为时1小时的连接反应。所构建的pET-11b-BMP-2-108见附图1。
3)采用分子克隆技术，以常规的氯化钙方法制备大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞用无菌铂丝直接蘸取冻存的大肠杆菌BL21(DE3)，在LB平板表面划线，于37℃下于培养16小时。将1个分隔良好的单菌落接种到50毫升LB培养液中，于37℃下，以250次/分钟的速度振荡培养至OD600＝0.3～0.8。将培养物分装于2个50毫升的离心管内，置冰上10分钟。然后，于4℃离心7分钟，速度为1600g。离心得的沉淀用10毫升冰冷的CaCl2溶液溶解，4℃离心5分钟，离心速度为1100g。将离心所得沉淀再用10毫升冰冷的CaCl2溶液溶解，冰上放置30分钟，4℃离心5分钟，离速为1100g。再将离心所得沉淀第三次用冰冷的CaCl2溶液溶解，用量为2毫升。按每管200微升加于1.5毫升无菌离心管中，立即冻于-70℃。
CaCl2溶液配方(60mmol/L CaCl2，15％(V/V)甘油，10mmol/LPIPES，pH7.0)无水CaCl2 3.33g，PIPES 1.5126g，甘油75ml，H2O 350ml，混合后加10mol/L NaOH调pH值至7.0，定容于500ml。
4)取上述第2)步所得的连接反应物10微升与第3)步所得的感受态细菌100微升轻轻混匀，在冰上放置50分钟，接着在42℃的水浴中放置90秒，再置冰浴1～2分钟，然后加入0.8毫升的LB培养基，在37℃条件下温浴60分钟。随后，将100微升被转化的感受态细胞涂布到含有氨苄青霉素抗生素的LB平板上，将平板置于室温下直至液体被吸收后，倒置平板，于37℃培养箱中培养10～30小时后，即可出现重组菌的菌落，完成质粒的转化；5)从转化的重组大肠杆菌的固体平板上挑取单菌落，接种于装有3毫升LB培养液的试管中，在37℃温度下中速振荡培养10小时，再对收获的菌体采用常规的碱裂解法抽提质粒DNA；此例抽提过程如下将培养15小时的培养物转入1.5毫升离心管中，12000g离心30秒。弃上清，细菌沉淀略干燥。将沉淀重悬浮于100微升冰冷的SolI中，涡旋使沉淀分散完全。加入200微升新配的SolII，颠倒6-8次，离心管置于冰上。再加150微升冰冷的SolIII，颠倒6-8次，离心管置于冰上30分钟。12000g离心10分钟，转移上清至一新的1.5毫升离心管中。加400微升酚氯仿溶液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，于上清，涡旋混匀，12000g离心5分钟，转移上清至一新的1.5毫升离心管中。加相当于上清2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃放置30分钟。12000g离心10分钟。弃上清，加1毫升70％乙醇，12000g离心2分钟。小心去上清，空气干燥沉淀。用30微升含胰RNA酶(20微克/毫升)的TE重新溶解沉淀，经37℃消化半小时后储于-20℃备用。溶液配方1.SolI125ml 200mmol/L葡萄糖，12.5ml 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容于500ml，高压灭菌，终浓度50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)。
2.SolII10mol/L NaOH 60μl，10％SDS 300μl，ddH2O 2640μl或10mol/L NaOH 20μl，10％SDS 100μl，ddH2O 880μl3.SolIII(3mol/L NaAc(pH4.8))无水NaAc 24.6g，用70ml ddH2O溶解，用约20ml冰乙酸调pH至4.8，定容至100ml。
4.TE5ml 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)，1ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容于500ml，高压灭菌，终浓度10mM Tris·Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)。
6)将上述抽提的DNA用限制性内切酶酶切鉴定，酶切温度为30～37℃，酶切时间为1～3小时。正确重组子中应当含有300～400bp(BMP-2-108)及5～6kb(载体DNA)的酶切片段。凡能切出上述大小酶切片段的克隆即为转化了新的基因(rhBMP-2-108)的克隆，构建基因工程菌获得成功(菌种已保存在中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO.M201011)。附图3为其酶切鉴定图，图中M1和M2为分子量标准，1～6为不同的样品；A为载体片段(5.7Kb)，B为插入的基因片段(324bp)。
7)在含葡萄糖的LB培养基中培养基因工程菌按1％的接种量将基因工程菌接入5～10毫升的LB培养基中，以转速100～200转/分培养2～3小时。培养温度是30～32℃。
8)rhBMP-2-108基因的诱导表达。在进行7)步骤后，按1％的比例，将培养物接种到含有200～500毫升LB培养基的三角烧瓶中，以200～300转/分转速，在30～32℃下将基因工程菌培养至OD600＝1.2～1.4，培养时间为10～12小时。然后，接入大罐中的LB培养基中继续培养。接种量为5∶1(培养液∶种子液)，pH7.0，培养温度为30～32℃，搅拌速度100～600转/分，培养4个小时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导3～4小时，然后在8000～10000转/分离心收集菌体，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定说明已经产生该蛋白质(见附图4)；9)用物理方法或化学试剂诱导细胞裂解。把收集的冷冻湿菌体按1∶5的比例加入Tris-Cl(50mmol/L)-EDTA(mmol/L)缓冲液中搅拌溶解，加入1∶100的100mmol/L的PMSF使得终浓度为1mmol/L。经超声破菌后离心收集沉淀，再用Triton X-100清洗一次，收集沉淀的包含体。然后用1mol/L的尿素再次清洗收集沉淀冷冻保存。其中Tris-EDTA缓冲液的pH为8.0。整个过程需要时间大约5～6小时，在4℃下进行，离心转速12500转/分，将沉淀溶解于裂解液(Gu.HCl，7mol/L；Tris，50mmol/L；EDTA-Na，1mmol/L；DTT，10mmol/L)，在磁力搅拌器上搅拌至包含体完全裂解。将搅拌均匀的包含体裂解液在18000g下离心20分钟，弃沉淀，上清液用于复性。然后，进一步经过Q柱和CM柱层析纯化，就获得本发明的产品重组人骨形态发生蛋白-2，毛细管电泳鉴定纯度为97％以上(见附图5、图6)。实施例2用温度诱导型表达载体生产截短型人BMP-2成熟肽的方法1)与实施例1第1)步相同。
2)构建含BMP-2-108基因的温度诱导型表达载体，操作方法同实施例1，仅将所用表达载体pET-11b换成pJLA503。构建成的pJLA503-BMP-2-108(见附图2)。
3)与实施例1第3)步相同。
4)与实施例1第4)步相同。
5)与实施例1第5)步相同。
6)与实施例1第6)步相同。
7)在含葡萄糖的LB培养基中培养基因工程菌，其方法同实施例1，仅培养温度为28～30℃。
8)rhBMP-2-108基因的诱导表达，在进行7)步骤后，按1％的比例，将培养物接种到含有200-500毫升LB培养基的三角烧瓶中，以200-300转/分转速，在28～30℃下将基因工程菌培养至OD600＝1.2～1.4，培养时间为10～12小时。然后，接入大罐中的LB培养基中继续培养。接种量为5∶1(培养液∶种子液)，pH7.0，将培养温度迅速升到42～45℃，并在剧烈震荡下继续培养3～4小时，然后，在8000～10000转/分离心收集菌体。
9)与实施例1第6)步相同。
生物学实验证明用本发明方法制得的截短型人骨形态发生蛋白-2成熟肽，具有促进骨修复的活性。生物活性测定方法如下1、体外培养细胞测活按Thies等人的方法用鼠W-20-17干细胞株测定碱性磷酸酶活性。碱性磷酸酶活性单位定义碱性磷酸酶(AP)比活力指每毫克蛋白质中含有的酶活力单位数，表示为U/mg，一个酶活力单位定义为在37℃，pH10.5条件下每分钟转化1umol对硝基苯磷酸(pNPP)所需酶量。检测证明碱性磷酸酶比活力与BMP-2剂量呈依赖性，即随BMP-2的剂量增加而增加，说明本产品有明确的生物活性。
2、体内异位成骨实验按照国际上通用方法制备鼠股四头肌袋模型。每个小鼠股四头肌陷窝内给予0.5mg rhBMP-2-108，加等量的I型胶原(购自Sigma公司)作为赋型剂。对照组只植入0.5mgI型胶原。三周后，进行X-射线检测。结果显示，对照组没有异位成骨现象，而植入rhBMP-2-108的实验动物都有明显的异位成骨效应。
在用rhBMP-2-108修复狗长达2cm的桡骨缺损实验中也获得满意的效果，在骨缺损部位植入含rhBMP-2-108的材料后4～12周，经X-射线检查，发现植入材料被完全吸收，缺损部位产生新骨。
权利要求
1.生产截短型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)人工合成编码BMP-2羧基端107个氨基酸残基的核苷酸序列，并在第一个氨基酸残基密码子之前加上了起始密码子ATG和限制性内切酶的识别位点，将第二个氨基酸精氨酸残基突变为赖氨酸残基和在最后一个氨基酸残基的密码子之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶的识别位点，构成截短型人BMP-2基因SEQ IDNO1长度324bp类型脱氧核糖核酸链数双链几何结构线性来源人工合成特征编码人BMP-2成熟肽羧基端的107个氨基酸残基的序列人BMP-2-108的基因编码序列5’ ATG AAA AAA CTG AAA TCC TCC TGC AAA AGA CAT CCG CTG TATGTG GAT TTT AGC GAT GTG GGC TGG AAC GAT TGG ATT GTG GCGCCG CCG GGC TAT CAT GCG TTT TAT TGC CAT GGC GAA TGC CCG TTTCCG CTG GCG GAT CAT CTG AAC TCC ACC AAC CAT GCG ATT GTGCAG ACC CTG GTG AAC TCT GTG AAC AGC AAA ATT CCG AAA GCGTGC TGT GTG CCG ACC GAA CTG AGC GCG ATT TCG ATG CTG TATCTG GAT GAA AAC GAA AAA GTG GTG CTG AAA AAC TAT CAG GAT ATGGTG GTG GAA GGT TGT GGC TGT CGC TAA 3’人BMP-2-108的氨基酸残基序列MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR2)构建含BMP-2-108基因的表达载体，将合成的BMP-2-108基因和含有与该基因相同限制性内切酶识别位点的载体分别用相关限制性内切酶切开，酶切温度为25～38℃，酶切时间为1～5小时，然后将酶切产物进行1～2％的琼脂糖凝胶电泳，用常规方法从凝胶中回收并纯化载体和基因两个DNA片段，再将两个片段同时置于T4DNA连接酶反应缓冲液中，加入T4DNA连接酶，在4～22℃下进行为时1小时-1周的连接反应，其中所使用的基因表达载体或为用化学试剂诱导插入基因表达的载体或为通过温度变化诱导插入基因表达的载体；3)采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞用无菌铂丝直接蘸取冻存的大肠杆菌，在LB平板表面划线，于25～38℃下培养10～20小时，将1个分隔良好的单菌落接种到50-100毫升LB培养液中，在25～38℃下，以150～300次/分钟的振荡速度培养至OD600＝0.3-1.0，将培养物装于离心管内，置冰上5～20分钟，随后，将培养物于2～6℃离心5～20分钟，速度为1500～2000g，将离心所得的沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮之后，第二次在2～6℃下离心5～7分钟，速度为1000～1500g，将离心所得沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮，冰上放置28～32分钟，然后第三次在2～6℃下离心5～7分钟，速度为1000～1500g，将离心所得沉淀用2～5毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮，最后按每管100～200微升的量将悬浮液分装于无菌离心管中，将管口密封后，立即冻于-70℃；4)将上述第2)步所得的连接反应物与第3)步所得的感受态细菌混匀，在冰上放置10～50分钟，接着在42℃的水浴中放置30～150秒，再冰浴1～10分钟，然后加入0.5～5毫升的LB培养基，在28～38℃的水浴或培养箱中温浴20～120分钟，随后，将150～250微升被转化的感受态细胞涂布到含有相应抗生素的LB平板上，将平板置于室温下直至液体被吸收后，倒置平板，于25～38℃培养箱中培养10～30小时后，即可出现重组菌的菌落，至此完成质粒的转化过程；5)从转化后的大肠杆菌的固体平板上挑取单菌落，接种于装有1～10毫升LB培养液的试管中，在25～38℃的温度下中速振荡培养6～15小时，再对收获的菌体采用常规的碱裂解法抽提质粒DNA；6)将上述抽提的DNA用限制性内切酶酶切鉴定，酶切温度为30～37℃，酶切时间为1～3小时，正确重组子中应当含有300～400bp(BMP-2-108)及5～6kb(载体DNA)的酶切片段，凡能切出上述大小酶切片段的克隆即为转化了新的基因(rhBMP-2-108)的克隆，构建基因工程菌获得成功；7)在含葡萄糖的LB培养基中培养基因工程菌按1％的接种量将基因工程菌接入5～10毫升的LB培养基中，以振荡速度100～200次/分培养2～3小时，对以化学试剂诱导插入基因表达的载体，培养温度是30～32℃，对通过温度变化诱导插入基因表达的载体，培养温度是28～30℃；8)rhBMP-2-108基因的诱导表达，在进行7)步骤后，按1％的比例，将培养物接种到含有200～500毫升LB培养基的三角烧瓶中，以200～300次/分的振荡速度，在步骤7)指定的培养温度下将基因工程菌培养至OD600＝1.2～1.4，培养时间为10～12小时，然后，接入大罐中的LB培养基中继续培养，接种量为5∶1(培养液∶种子液)，pH7.0，对于以化学试剂诱导插入基因表达的基因工程菌，培养温度为30～32℃，搅拌速度100～600转/分，培养4个小时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导3～4小时，然后在8000～10000转/分离心收集菌体，对于通过温度变化诱导插入基因表达的基因工程菌则将培养温度迅速升到42～45℃，并在剧烈震荡下继续培养3～4小时，然后在8000～10000转/分离心收集菌体；9)用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组蛋白质，经复性，分离，纯化后，获得本发明的产品截短型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)。
全文摘要
本发明涉及一种构建基因工程菌生产截短型重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽(rhBMP－2－108)的方法,该方法通过构建含截短型人BMP－2基因的基因工程菌而得到表达量高的重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽,更易于纯化和复性,因而有更高的生物活性。本发明的基因工程菌所产生的人截短型BMP－2的量达到细菌总可溶蛋白量的30～50%,本发明建立的重组蛋白分离纯化技术简便实用,有利于大量生产医疗用的BMP－2,为其用于临床,造福病人奠定基础。
文档编号C12N15/70GK1382803SQ0111675
公开日2002年12月4日 申请日期2001年4月21日 优先权日2001年4月21日
发明者徐放 申请人:杭州华东医药集团公司