专利名称：定量测定骨形成蛋白(bmp)活性细胞株的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术中的细胞因子活性的检测方法，进一步涉及一种定量测定骨形成蛋白(BMP)活性细胞株的建立方法。
现有的骨形成蛋白(BMP)活性测定方法，即动物体内植入实验，存在周期长、不能定量，且受动物品种、植入部位等多种因素影响的缺点。至今尚无专门用于定量测定骨形成蛋白的细胞株或细胞学方法。
骨钙素是骨形成过程中成骨细胞分泌的一种必需的基质蛋白，它正是骨形成蛋白(BMP)作用的重要靶分子之一。
本发明采用的技术方案是首先合成串联6个BMP作用关键元件的骨钙素部分启动子(6OCP)，(序列为5’-CCAAC CACA CCAAC CACA CCAACCACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA GCC GAT ATA AAT GCTACT GGA TGC TGG AGG GTG CAG AAC AGA CAA GTC-3’)连接上荧光素酶报告基因，克隆、构建其真核表达载体，使荧光素酶报告基因处于该启动子(6OCP)控制之下。然后将上述载体转入成肌细胞C2C12中，利用表达载体本身的抗性基因用抗生素进行压力筛选，获得可受BMP诱导、稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株。荧光素酶报告基因的表达产物为荧光素酶，荧光素酶的活性可通过检测其分解底物产生荧光量测得。具体检测方法为收集BMP刺激、培养2天的单克隆细胞，加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后高速离心5分钟，然后取部分离心上清，加入到一定量的荧光素酶作用底物液中，在化学发光检测仪上测定产生荧光量。通过检测各单克隆细胞株对BMP作用的反应性；最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标(荧光素酶产生荧光量)灵敏的细胞株。
本发明的方法经过特异性、稳定性等检验证实，该细胞株稳定可靠，适用于BMP活性的定量测定。
利用本发明测定BMP的活性仅需要2天时间，且操作简便，所测指标敏感，可以进行量化分析。
a.首先合成串联6个BMP作用关键元件的骨钙素部分启动子(6OCP)，序列为5’-CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACACCAAC CACA CCAAC CACA GCC GAT ATA AAT GCT ACT GGA TGC TGGAGG GTG CAG AAC AGA CAA GTC-3’，连接上荧光素酶报告基因，克隆、构建其真核表达载体，使荧光素酶报告基因处于该启动子(6OCP)控制之下；b.然后转入成肌细胞C2C12中，利用载体本身的抗性基因用抗生素进行压力筛选，获得可受BMP诱导、稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株；上述真核表达载体也可转入其它细胞系，如NIH3T3、C3H10T1/2细胞中；c.通过检测各细胞株对BMP作用的反应性具体检测方法为收集BMP刺激、培养2天的单克隆细胞，加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后高速离心5分钟，然后取部分离心上清，加入到一定量的荧光素酶作用底物液中，在化学发光检测仪上测定产生荧光量；d.最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标灵敏的细胞株；e.经过特异性、稳定性等检验证实，该细胞株稳定可靠，适用于BMP活性的定量测定；采用不同来源、不同批次的BMP刺激该细胞株后，检测荧光素酶活性，结果显示BMP的作用剂量与荧光素酶活性呈线性正相关。
权利要求
1.定量测定骨形成蛋白(BMP)活性细胞株的建立方法，包括以下步骤a.首先将串联6个BMP作用关键元件的骨钙素部分启动子连接上荧光素酶报告基因，克隆、构建其真核表达载体；该启动子序列为5’-CCAAC CACACCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACAGCC GAT ATA AAT GCT ACT GGA TGC TGG AGG GTG CAG AAC AGA CAAGTC-3’；b.然后转入成肌细胞C2C12中，利用载体本身的抗性基因用抗生素进行压力筛选，获得稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株；荧光素酶报告基因的表达产物为荧光素酶，荧光素酶的活性可通过检测其分解底物产生荧光量测得；上述真核表达载体也可转入其它细胞系，如NIH3T3、C3H10T1/2细胞中；具体检测方法为收集BMP刺激、培养2天的单克隆细胞，加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后高速离心5分钟，然后取部分离心上清，加入到一定量的荧光素酶作用底物液中，在化学发光检测仪上测定产生荧光量；c.通过检测各细胞株对BMP作用的反应性，最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标—荧光素酶分解产生荧光量灵敏的细胞株；d.经过特异性、稳定性等检验证实，该细胞株稳定可靠，适用于BMP活性的定量测定。
全文摘要
本发明公开了一种定量测定骨形成蛋白(BMP)活性细胞株的建立方法,利用分子生物学转基因技术将BMP作用靶分子骨钙素的部分启动子(串联6个关键作用元件)连同荧光素酶报告基因,转入成肌细胞C2C12中,经过筛选获得稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株,并检测各细胞株对BMP作用的反应性;最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标(荧光素酶)灵敏的细胞株。经过特异性、稳定性等检验,证实该细胞株稳定可靠;通过检测多批BMP样品结果显示,BMP的作用剂量大小与荧光素酶活性高低呈良好的线性正相关。本发明所建立的细胞株适用于BMP活性的定量测定。
文档编号C12Q1/06GK1357621SQ0113181
公开日2002年7月10日 申请日期2001年12月7日 优先权日2001年12月7日
发明者朱帮福, 陈苏民, 陈南春 申请人:中国人民解放军第四军医大学